Summary
Her viser vi en ny tilgang til at bruge høj opløsning spektral-domæne optisk kohærens tomografi (HR-SD-OCT) at hjælpe levering af genet terapi agenter ind i subretinal rummet, vurdere dens areal dækning og karakterisere fotoreceptor vitalitet.
Abstract
HR-SD-okt er udnyttet til at overvåge progression af fotoreceptor degeneration i levende musemodeller, vurdere levering af terapeutiske agenter ind i subretinal rummet og evaluere toksicitet og effektivitet i vivo. HR-SD-OLT anvender nær infrarødt lys (800-880 nm) og har optik specifikt designet til unik optik af musen øjet med sub-2-micron aksial opløsning. Transgene musemodeller af ydre retinal (fotoreceptor) degeneration og kontrol blev afbildet for at vurdere sygdomsprogression. Trak glas microneedles blev brugt til at levere sub retinal injektioner af adeno-associeret virus (AAV) eller nanopartikler (NP) via en trans-scleral og trans-choroidal tilgang. Omhyggelig placering af nålen ind i subretinal rummet var påkrævet før en kalibreret trykket indsprøjtning, som leverer væske ind i sub retinal rummet. Realtid subretinal operation blev udført på vores retinal imaging system (RIS). HR-SD-okt demonstreret progressive ensartet retinal degeneration som følge af udtryk af en giftig mutant menneskelige mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgenet i mus. HR-SD-okt tillader strenge kvantificering af alle de retinale lag. Ydre nukleare lag (ger.) tykkelse og fotoreceptor ydre segment længde (OSL) målinger korrelerer med fotoreceptor vitalitet, degeneration eller redning. RIS leveringssystem giver mulighed for real-time visualisering af subretinal injektioner i neonatal (~ P10-14) eller voksne mus og HR-SD-okt straks afgør succes af levering og kort areal omfang. HR-SD-okt er et kraftfuldt værktøj, der kan evaluere succesen af subretinal kirurgi i mus, desuden at måle vitalitet af fotoreceptorer in vivo. HR-SD-OLT kan også bruges til at identificere ensartede dyr kohorter for at vurdere omfanget af retinale degeneration, toksicitet og terapeutiske redning i prækliniske gen terapi forskningsundersøgelser.
Introduction
Forskere udvikler genterapier for en lang række retinal og retinal degenerative sygdomme med håb om at omsætte roman therapeutics til behandlinger for human sygdom1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tid domæne eller spektral domæne optisk kohærens tomografi (SD-OCT) er blevet brugt til at undersøge aspekter af ydre retinal degeneration i specifikke musemodeller sygdom12,13,,14 . HR-SD-OLT ikke dog været flittigt brugt i forbindelse med optimering af evaluering af musemodeller til beregning af sats og rumlige ensartethed af retinale degeneration, eller i forbindelse med præklinisk evaluering af genet baseret therapeutics, for eksempel, til vurdere redning, toksicitet, eller den rumlige udstrækning vektor levering8,15,16. Når en musemodel er fuldt karakteriseret, kan HR-SD-okt-data tjene som en informativ og pålidelig ressource til at måle virkningen af therapeutics at udøve redning eller toksicitet i musemodeller af retinale degeneration17. Mange grupper bruger subretinal injektion som en metode til vektor levering på grund af dens effektivitet på transducing fotoreceptorer og retinale pigment epitel (ÅV) celler. Dette er imidlertid en vanskelig metode til master, eftersom det gøres typisk ved fri hånd kirurgi fra hornhindens overflade, og er ofte behæftet med grå stær, blødning og utilsigtede retinal forsyningslinier opstår simpelthen ved manipulation af bageste glaslegemet. Mange grupper stadig forsøge subretinal injektioner blindt og levere den virus benytter manuel injektioner med relativt stor diameter rustfrit stål nåle (34G)8,17,18,19 ,20,21,22, og et par bruger optisk kohærens tomografi (OCT) imaging for at bekræfte korrekte levering af vektor til nethinden8,17, 20 , 22. nogle forbedringer i metoden er for nylig blevet beskrevet ved hjælp af individuel nåle drevet af en micromanipulator22.
Vi præsenterer en integreret tilgang, som hjælper i placeringen af nålen, og injektioner er lettet af en brugerdefineret styret stereo oftalmoskop designet i lab specifikt til at visualisere inde i små øjet af musen17, 23. brugen af trak glas mikro nåle sammenholdt med den stereotaxisk micromanipulator giver bedre kontrol af nålen placering med ingen kirurgisk skåret ned krævede (dvs. gennem bindehinden og bindevæv) forud for injektion. Brug af presset reguleret mikro injektor hjælper med at levere konsekvent injektionsvolumener, og injektion kan gøres med meget større stabilitet og præcision, og meget langsommere end manuel injektioner udført af en håndholdt sprøjte, dermed mindske den forekomst af boble injektion i øjet. Mindre nålen hjælper med at forhindre lækage efter nålen tilbagetrækning, fordi stien er selvstændige forsegling. For at vurdere omfanget af indsprøjtning/levering, stole mange undersøgende grupper på at finde og vurdere areal omfanget af forbedrede grønne fluorescens protein (EGFP) udtryk i nethinden (udtryk konstruere leveret af vektoren) i eksperimentel slutningen punkt (eutanasi) for at bekræfte vellykket injektioner11,19,20,24. Denne tilgang (ikke udnytte OCT) til at kontrollere kirurgisk succes spilder en enorm mængde af ressourcer i kirurgisk proceduremæssige tid og dyr, da alle dyr med (ukendt) kirurgisk fiaskoer skal bibeholdes, følges med gentagne foranstaltninger indtil aktiv dødshjælp og øjet høst (når EGFP er målt). Bekræftelse af placeringen af injektion i nethinden kan forbedres ved hjælp af HR-SD-OCT til at vise, at Indsprøjtningen er placeret mellem de korrekte lag af nethinden (dvs. den subretinal plads). HR-SD-OLT kan også bruges til straks at afgrænse mislykkede forsøg (kirurgiske fejl) at identificere relevante variabler i ægte kirurgisk tid til at forbedre tilgangen. Vi fandt, at HR-SD-okt giver adskillige fordele i prækliniske gen terapi undersøgelser ved at tillade hurtig kvantitative evaluering af ydre retinal degeneration, så identifikation/nedslagtning af undersøgelse dyr, der ikke opfylder eksperimentelle kriterier ( fx forkert subretinal injektion), og at direkte opfølgning imaging til regionen i øjet hvor vektor blev leveret (hvor prækliniske effekten er mest sandsynligt) samt styre regioner hvor vektoren ikke blev leveret. Siden sin udvikling, brugen af SD-okt fortsatte med at blive accepteret og anvendt af oftalmologi forskere og betragtes nu som standard af retinale imaging i retinal videnskabelige studier i mus eller gnavere modeller13,25. HR-SD-OCT og dens softwarefunktioner blev udnyttet i unikke integrerede måder at yderligere mål for vellykket kvantitativ genterapi i musemodeller på hvert trin i processen, herunder dyremodel udvalg, karakterisering af degeneration i valgte sygdomsmodeller, terapeutiske levering, kortlægning af vektor levering og toksicitet/effekt evaluering. Brugen af HR-SD-okt giver mulighed for mere effektiv drug discovery på alle niveauer af processen. Her beskriver vi disse metoder, der anvendes i vores RNA Drug Discovery program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animalske protokoller blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg af VA WNY HCS og Universitet på Buffalo-SUNY. Dyrene blev brugt efter bestemmelserne i foreningen for forskning i Vision og oftalmologi (ARVO) og Helsinki-erklæringen.
1. musemodeller
- Identificere musemodeller vurderes herunder kontrolelementer.
Bemærk: Imaging blev udført for et C57BL/6(J), hC1/hC1/mWT/mWT, en delvist humaniseret mus retinal degeneration model homozygot for menneskelige mutant RHOP347S hC1 alleler på wild-type (WT) mus RHO+/ + genotype26 , 27, hC1 x BL/6(J), en delvist humaniseret model med en enkelt kopi af det muterede menneskelige RHOP347S hC1 allel på WT musen RHO+/ + genotype (hC1 /-/ / mWT/mWT) (opnået ved at krydse hC1/hC1/mWT/mWT med C57BL/6 ( J) mus). Den ovenfor autosomal dominerende retinitis pigmentosa (adRP) modeller er på C57BL/6(J) baggrund. En musemodel, der er homozygot for to kopier af det menneskelige WT RHO gen på musen RHO knockout baggrund blev også brugt28,29. Denne linje er på 129Sv baggrund. Når denne linje blev krydset med en mus RHO knockout på 129Sv baggrund, opstår en enkelt dosis af menneskelige RHO på musen RHO baggrund. - Vedligeholde dyrene efter de betingelser, der er relevante for den eksperimentelle design.
Bemærk: Dyrene blev opretholdt i veterinær medicinsk enhed (VMU) på VA WNY HCS. Mus blev fodret standard lab chow og dyrket under 12 h:12 h lys: mørke cyklusser med blød fluorescerende overhead hvid lys med ca 300 lux på bur niveau på omkring 72 ˚F.
2. Mouse Eye Gel
- Forberede den optiske gel anvendes til retinal imaging30 og kirurgiske procedurer.
- Kombiner 2 mg/mL w/v høj molekylvægt (4 x 106 g/mol carbomer i sterile 1 x fosfat Buffered saltvand (PBS).
- Bland ved stuetemperatur indtil gel danner en tyktflydende optisk gennemsigtige gel.
- Overføre gel til små sterile flasker og centrifugeres i et swingende spand bordplade centrifuge på 350 x g at fjerne fanget luftbobler.
- Anvende gelen direkte på hornhinden at skabe en grænseflade mellem mus hornhinden og en præmie cover glas (18 mm x 18 mm).
3. HR-SD-okt Imaging
- Se HR-SD-okt enhed (figur 1).
- Veje dyret for at bestemme den korrekte dosis af anæstesi. Derefter bedøver musen bruger 25 µL/g kropsvægt af de 2,5% "buffered" 2,2,2-tribromoethyl alkohol (Avertin) løsning via intraperitoneal injektion (IP) og tilføje øjendråber for at spile eleverne, efter at dyret er immobiliseret.
- Bekræfte, at dyret er fuldt bedøvede af en tå knivspids, og være sikker på at dyret ikke reagerer.
- Trimme knurhår og Placer musen på HR-SD-okt slæden.
- Placer musens øjet direkte foran linsen, medaljon og manipulere den fase kontrol indtil hornhinden og iris er placeret. Holde hornhinden hydrerede ved at anvende kunstige tårer.
Bemærk: Finjustering micromanipulators på HR-SD-okt slæden bruges til at placere musen, sådan elev blænde er centreret og orienteret. Den optiske medaljon er så avanceret indtil nethinden bliver synlig og dyret justeres yderligere for at opnå det bedste mulige billede. - Først, åbne programmet "Mus" og klik på "patienten/eksamen". For det andet skal du klikke på "Tilføj patienten" og indtaste de relevante oplysninger for at identificere dyret i vinduet ny patient og "Gem og Afslut". Tredje, klik på "Tilføj eksamen" efterfulgt af "start eksamen". Fjerde, klik på "Tilføj brugerdefineret scanning" og vælg "rektangulært volumen", vælge OD eller OS for øje at blive afbildet, så klik på "Tilføj eksamen". Endelig starte sigter instrumentet og positionering dyret for at få det pågældende område. Efter at finde den korrekte region, fjerne eventuelle overskydende væske fra øjet overfladen ved hjælp af en steril bomuld tippes applikator lige før billede erhvervelse for at forbedre billedkvaliteten yderligere, så klik på "start snapshot", og hvis opnås et godt billede, klik på "Gem Scan".
Bemærk: Typiske parametre for rektangulære HR-SD-okt billeder er 900 a-scanninger/b-scan og 90 b-scanninger/billede. Erhvervede billeder er 1,4 mm x 1,4 mm. Regionen af retina afbildet afhænger af den specifikke eksperiment, men de fleste billeder er centreret på synsnerven hoved (ONH).
4. vurdering af tilstedeværelsen, sats og ensartethed af Model ydre retinale Degenerations
- Ydre Retinal Degeneration Model evaluering af HR-SD-okt
- Få dyr med et bredt spektrum af aldre både kontrol-og eksperimenterende fag at vurdere tilstedeværelsen, sats og ensartethed af ydre retinal degeneration.
- Udføre HR-SD-okt imaging på flere dyr på hvert alderstrin fra begge kohorter (sygdom og normal). Du kan bruge metoden beskrevet i 3.1.6 for at opnå OCT billeder.
Bemærk: Data kan indsamles fra en stor kohorte af dyr på én gang, som har fordelt fødselsdage der spænder over en lang periode (1 år), eller en lille kohorte af dyr kan bruges til at indsamle flere billeder over en længere periode (1 år) at opnå lignende resultater. - Åbne en optaget HR-SD-okt rektangulært volumen billede, og identificere de første b-scan skal måles (ideelt set vil omfatte ONH eller andre identificerbare landmark) fra ensemble af billeder. Forstørre billedet udfylder hele skærmen ved hjælp af zoom-funktionen i softwaren.
- Åbn det ønskede antal calipre ved højre-klikke på billedet af b-scanning og derefter klikke på "Calipre" og endelig klikke på så mange calipre som ønskede (de er nummererede fra 1 til 10). Sikre, at calipre dukker op i nederste højre hjørne af billedet. Ved hjælp af funktionen "Konfigurere Caliper" tildele dem alle som "lodret" i vinkel blok kolonne og turn på "Display Caliper sted" at lette ensartet placering på tværs af nethinden og endelig klikke på Anvend.
Bemærk: 1st caliper skal placeres i venstre side af billedet, når behandling oculus dexter (OD) højre øje og 1st Caliper skal placeres på højre side af billedet, når behandling af oculus skummel (OS) venstre øje billeder. Dette resulterer i en nasal til tidsmæssig orientering af alle data for både de venstre og højre øje når plotte. - Ved hjælp af computermus, flytte hver caliper til den ønskede placering (2,0 mm fra hinanden) på tværs af b-scan, Sørg for at placere en skydelære i midten af synsnerven hoved, i b-scan-billeder, der indeholder det (sat denne caliper til nul). Derefter bruge musen til at klikke og trække caliper til længde at spænde region af interesse. Vilkårligt sæt calipre, der ikke overlay målbare områder af b-scan til maksimal længde, og ignorere under dataanalyse.
- Måle ger. tykkelse ved hjælp af Caliper værktøjer, ved at placere toppen af caliper på den eksterne begrænsende membran (ELM) og i bunden af caliper i bunden af den ydre plexiform lag (OPL). Gentag dette for hver caliper på tværs af nethinden på 0,2 mm-trin. Gemme måleresultaterne.
- Efter at alle calipre er placeret og justeres til størrelsen, Højreklik på billedet og klik på "Gem Caliper Data".
- Gentage målinger på efterfølgende b-scanninger (hver 10th scanne fungerer godt) fra den samme rektangulære volumen OCT billede der spænder over hele nethinden fra ringere superior regioner. Calipre bør forblive åben og på samme sted i x-aksen. Juster længden af calipre uden at flytte dem i X-retning.
- Åbne Gem datafiler ved at klikke på det lille filikonet ud for de forarbejdede b-scan billede og klik på "Gå til Data". Klik på "dato ændret for at arrangere filerne i rækkefølge baseret på tidsbesparelse, og åbne alle filer for hver b-scan målt.
- Kompiler de rå data fra hver b-scan i en enkelt fil i rækkefølge fra laveste til højeste baseret på stelnummer. Vælg kolonnerne af data, herunder "Caliper navn", "Længde" og "Center X".
- Sikre, at byens X er den samme for alle b-scanninger måles for hvert rektangulært volumen OCT billede behandles. Slet alle data fra calipre, der ikke blev brugt til at registrere målinger, og indstille caliper beliggende på midten af synsnerven hovedet til nul.
- Plotte data for X vs flere Y datasæt til at få en 3D plot funktion til at plotte den samlede tykkelse af ger. eller en anden målt retinal lag.
- Sammenlign ger. målinger mellem kontrol og forsøgsdyr med tilsvarende aldre til at bestemme den sats og ensartethed af enhver potentiel retinal degeneration.
- Gentag processen for OSL målinger ved hjælp af samme b-scan-billeder. Følg den samme metode anvendes til at måle ger., undtagen markedsføring calipre mellem ELM og Bruchs membran (BM).
Bemærk: Et eksempel på hvordan man kan placere caliper er vist i repræsentative resultater afsnit (fig. 3B). Dette bør gøres på en zoomet i billedet for at reducere fejl. - Gentag dataanalyse for flere dyr for hver fødselsdag for både eksperimentelle og kontrol kohorter.
- Omfattende måling og 3D kortlægning af ger. eller OSL tykkelse ved hjælp af værktøjet software calipre
- Anmeld indlæg injektion OCT billeder og noter af eventuelle identificerbare landemærker, som ONH eller blodkar i nethinden. Placer derefter med musen for at få en opfølgende SD-okt fra samme region, og sørg for at medtage de samme identificerbare vartegn.
Bemærk: Sikre, at regionen af retina afbildet og involveret i den nethindeløsning er identificeret i post injektion SD-okt billeder. Optage et rektangulært volumen SD-okt billede og gemme det. - Behandle de optagede billeder som beskrevet ovenfor i trin 4.1.3. til 4.1.14. Gemme caliper data og plot som beskrevet ovenfor.
Bemærk: Den resulterende række ger. målinger bruges til at oprette et 3D plot skildrer ger. tykkelse. Placeringen af calipre langs x-aksen tillader en at replot grafen markedsføring synsnerven på oprindelse (0) langs x-aksen. Y-aksen, der er afbildet ved hjælp af b-scan antallet og synsnerven bruges derefter til at definere udgangspunkt, som gør det muligt at placere korrekt synsnerven på oprindelse på y-aksen. At identificere synsnerven i hvert datasæt tillader opfølgende billeder skal justeres pålideligt.
- Anmeld indlæg injektion OCT billeder og noter af eventuelle identificerbare landemærker, som ONH eller blodkar i nethinden. Placer derefter med musen for at få en opfølgende SD-okt fra samme region, og sørg for at medtage de samme identificerbare vartegn.
- Kortlægning af omfanget af injektionsstedet på fundus billedet
- Udføre post injektion rektangulært volumen OCT for at bekræfte succesen af injektion. Følge metoden beskrevet i 3.6.
- Bruge funktionen Caliper i softwaren til at identificere vendepunkt ved grænsen af Fritliggende nethinden fra en række b-scanninger spænder hele OCT billedet. Brug metoden til at åbne calipre beskrevet i 4.1.4.
- Optage fundus billeder med den tilknyttede placering af OCT b-scan og tilsvarende caliper position på fundus billedet, som svarer til dens placering.
- Kompilere alle fundus billeder til et sammensat billede, herunder caliper positioner, hvilket resulterer i en præcis kort over injektionsstedet på fundus billedet (eksempel i repræsentative resultater afsnit, figur 5A).
5. intraokulært injektioner
Bemærk: Oplysninger om brug af ris-serveren er yderligere uddybet i en nylig undersøgelse23.
- Forberede glas injektion nåle
- Autoklave kapillar rør med filamenter i små partier, ved hjælp af den tørre cyklus.
- Bruge en pipette aftrækker og set-up et program, der vil producere et glas tip med den skarpeste vinkel og en diameter i størrelsesordenen 2-5 µm.
Bemærk: En prøve 5-trins program, som produceres effektivt nåle på vores pipette puller er vist i tabel 1. - Gemme trak glas nåle i en steril pipette nålen jar ved stuetemperatur.
- Fyld injektion nålen med den ønskede løsning til injektion
- Montere nålen ind i nål holderen, forlader ca 5/8" stikker ud over slutningen af indehaveren.
Bemærk: A afstand mindre end 5/8" vil gøre det vanskeligt reach Injektion løsning at fylde nålen, fordi nål holder ikke passer umiddelbart ind i åbningen af 0,2 mL rør. Også, at nålen rager mere end 5/8" resultater i betydeligt større svingning eller præcession af tip, gør realtid imaging vanskeligt, da spidsen forlader brændplanet eller field of view (FOV), mens du forsøger at punktere øjet. - Forberede injektion løsning i en steril 0,2 mL tube. Tilføje en 1:10 fortynding af sterile fluorescein sulfat (10 mg/mL i 1 x PBS) til injektion løsningen til at opnå en endelig koncentration på fluorescein på 1 mg/mL.
Bemærk: Den nøjagtige farve anvendes er specifikke for brugeren og kan være noget, der er giftfri og synlige for det blotte øje under hvide lys belysning til at bidrage til at lette præcis placering af nålen tip på niveauet af ÅV og subretinal plads. - Visualisere nålen gennem stereo-mikroskop mens du bruger kontrol drejeknapper for 3-axis micromanipulator til at placere nål, så det justeres med midten af røret indeholder injektion løsning for udfyldelse af nålen.
- Omhyggeligt drive needle-tip til 0,2 mL tube, indtil spidsen af nålen er nedsænket i væsken. Udarbejde den ønskede mængde af injektionsvæske (f.eks. 1 µL) til nålen nødvendigt for en enkelt injektion. Opretholde den resterende løsning i røret anbringes i isen.
- Montere nålen ind i nål holderen, forlader ca 5/8" stikker ud over slutningen af indehaveren.
- Forberede dyret til injektion
Bemærk: RIS-mikroskop holdes rent, og er en ikke-kontakt-system. Den varme plade er belagt med en ren adsorbent pad og nåle er autoklaveres før bliver trukket. Efter de er trukket af en selvstændig sterilisering opvarmet metal strimmel, opbevares de i en lukket steriliseret kammer designet til at holde trak glas nåle. Nålene er kun håndteres ved hjælp af behandskede hænder, og pleje bruges til at forhindre, at røre spidsen af nålen mens montering det i holderen. De injicerede løsninger er tilberedte med steril teknik og er testet for kontaminering af striber en prøve af virus præparaterne på LB agar plader og inkubere dem over nat på 37 ˚C.- Veje dyr (g) for at bestemme den passende dosis af bedøvelsesmiddel smertestillende.
- Administrere bedøvelsesmiddel (2,5% opløsning af "buffered" 2,2,2-tribromoethyl alkohol (Avertin)) via intraperitoneal injektion (IP).
- Straks anvende antikolinerge lægemidler (f.eks. cyclopentylate) på begge øjne til at spile eleverne.
- Trim dyrets knurhår og antal dyr ved hjælp af øret punch eller anden metode.
- Vask øjnene og omkringliggende område med fortyndet betadine.
Bemærk: Undgå at få en løsning omkring næsen, da dette kan resultere i utilsigtede drukning. - Placer musen på den hede afrivningsblok, vedligeholdes på 39 ˚C, i den allerede støbte modeler ler musen holder med øjet sprøjtes mod nålen.
- Sørg for at musen ikke reagerer, ved hjælp af en knivspids test af bagben foden.
- Udførelse af subretinal injektion
- Bruge et par af sterile stump iris pincet til forsigtigt fremkalde proptosis af kloden ved at placere spidsen af pincet på 7 og 10 på urskiven på øjenlåg mens skubbe åbne og nedadgående på samme tid.
- Bruge pincet til at lokke øjenlåg under øjet kloden til at holde det ud af stikkontakten under indsprøjtningssystem processen.
Bemærk: Dyr 10 til 14 dage gamle vil ofte holde øjet ud af stikkontakten lettere end ældre dyr. - Direkte spidsen af nålen ca 1-1,5 mm under kanten af cornea limbus og omhyggeligt køre det ind i øjet gennem conjunctiva, indtil det skaber en scleral depression som nålen trænger ind i væv af sclera, og giver mulighed for manipulation af øjet.
- Rotere øjet nedad med micromanipulator til at visualisere den scleral depression gennem de udspilede elev med RIS stereo-mikroskop.
- Påfør en dråbe af sterile eye gel eller 1 x PBS løsning og dækker med en steril coverslip.
- Fokusere på den scleral depression lavet af spidsen af den nål (2-5 µm), og drev nål frem indtil en skarp peak former nethinden på injektionsstedet.
- Rotere nålen ved hjælp af indehaveren, indtil spidsen boringer gennem sclera og fluorescein i nålen er synlig under nethinden i umiddelbar nærhed af ÅV celle éncellelag.
- Drive spidsen af nålen, så det tangerer til verden, og derefter aktivere indsprøjtningspumpe med pedal fodkontakt.
- Efter den ønskede mængde er leveret (0,5-1 µL) til subretinal plads, hæve nålen og kontrollere, om bleb er stabil og at væske ikke sive ud af injektionsstedet, som er de første kriterierne i en vellykket injektion.
Bemærk: Opretholde en ordentlig tip diameter er (2-5 µm diameter) afgørende for at undgå lækage fra injektionsstedet. - Placere dyret på imaging platform for OCT apparatet. Følg vejledningen til HR-SD OCT Imaging for at optage et rektangulært volumen billede.
- Bekræfte, at den injicerede væske er placeret i den subretinal plads og gemme billeder til at bestemme omfanget af bleb.
- Fjern dyret fra indehaveren og anvende en rigelig mængde af antibiotisk salve til de injicerede øjne.
- Placere dyr på en varmepude, indtil det helt genopretter, så læg det tilbage i den oprindelige bur, hvor det kom fra.
Bemærk: Vores dyr er normalt injiceres før fravænning, skal dyrene derfor returneres til bur med moderen.
- Kortlægning af omfanget af subretinal bleb ved hjælp af OCT instrument softwareværktøjer.
- Opnå et rektangulært volumen OCT billede, ved hjælp af metoder, der beskrives tidligere, af bleb og Placer det til at omfatte en genkendelig landemærke i øjet som ONH.
Bemærk: Optagelse 90 b-scanner virker godt for kortlægning af bleb, men kunne anvendes afhængigt af den ønskede opløsning. - Tilføje en enkelt caliper til figuren og anbringe det på det vendepunkt, hvor nethinden løsner fra ÅV og årehinden.
Bemærk: Softwaren knytter automatisk et tilsvarende punkt til en linje på fundus billedet repræsenterer caliper og b-scanningen ved at blive evalueret. - Fange skærmen efter placeringen af calipre, og kompilere billeder til effektivt kort kant af injektion bleb på fundus billedet, som netop kort injektionsstedet. Gem den kompilerede billede for reference til at hjælpe til at lokalisere områder af interesse under opfølgningen billedbehandling.
Bemærk: Alternativt caliper data kan gemmes, er opfyldt, og afbildet ved hjælp af en lignende metode for plotting 3D datasæt ger. tykkelse.
- Opnå et rektangulært volumen OCT billede, ved hjælp af metoder, der beskrives tidligere, af bleb og Placer det til at omfatte en genkendelig landemærke i øjet som ONH.
- Intravitreal injektion
- Placer spidsen af nålen ved hjælp af en lignende kirurgisk tilgang som sub retinal injektion, bortset fra at nålen er drevet udelukkende via sclera på pars plana omkring 0,25 mm bag den hornhinde limbus og i glaslegemet.
- Efter nålen placering, skal du anvende injektion pulsen med fodpedalen.
Bemærk: En hurtig udbredelse af fluorescein farvestof i hele glasagtige af øjestykket er observeret, udfylde den forstørrede elev blænde med fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering af forekomsten, sats og ensartethed af Model ydre Retinal Degeneration
Målinger af ger. blev indspillet fra OPL til ELM, definere grænserne for ger. ved hjælp af caliper værktøj leveres i instrument-softwaren. Målet var at kortlægge progression af ydre retinal degeneration i en delvist humaniseret adRP musemodel. Sammenlignelige billeder fra en kontrol C57BL/6(J) mus og en hC1/hC1/mWT/mWT musemodel, udtrykker to kopier af mutant menneskelige stang opsin (RHOP347S) gener, blev vist at udstille både kontrol retinal resultater og dem af en svær og hurtigt progredierende retinal degenerativ tilstand. 3-uge-forhenværende adRP (hC1 x BL/6(J)) dyr, har kun en enkelt kopi af det muterede menneskelige RHOP347S gen og to kopier af musen WT RHO gener, havde nær normal ger. tykkelse. Men den opfølgende HR-SD-okt scanner på 10 og 37 uger demonstreret tidsligt progressive og rumligt ensartet retinal degeneration som resulterede i ca 60% tab af fotoreceptorer anerkendt som ger. udtynding over denne tidsramme. I hC1 x BL/6(J) adRP model har den retinale degeneration en anslået tid konstant (1/e) på 13 uger. Homozygot hC1 dyr, med to doser af den giftige mutant menneskelige transgene mus WT RHO baggrund, udsættes for en meget hurtigere degeneration, som det fremgår af omfattende retinal udtynding og i det væsentlige fuldstændig tab af alle fotoreceptorer af 3 ugens i alder (figur 2).
GER. foranstaltning er kun en del af ydre retinal normalitet som et indeks over fotoreceptor vitalitet. OSL fotoreceptorer og den indre segment/ydre segment (IS / OS) linje eller ellipsoide linjen fremlægge bevis til støtte for både fotoreceptor vitalitet og funktion. Sammenligninger i dyr, der har været avlet til at indeholde enten en (N129R - x 129R-) eller to (2HRho 1T1T) Kopier (doser) af de menneskelige gener, WT RHO på musen WT RHO knockout baggrund blev målt til ydre retina tykkelse. En statistisk signifikant stigning i ~ 8 µm i ger. blev observeret i mus med to kopier af det menneskelige WT RHO gen sammenlignet med mus med kun én kopi af det menneskelige gen. En statistisk signifikant stigning i ~ 5 µm i OSL blev observeret i mus med to vs en kopi af den menneskelige WT RHO gen på musen WT RHO knockout baggrund. Et eksempel på hvordan ger. og OSL målingerne er foretaget er vist i figur 3. Høj opløsning af billeder taget med HR-SD-okt-systemet tillade præcise målinger af ger. eller OSL tillader diskrimination af små forskelle med solid statistisk pålidelighed i humaniseret WT RHO musemodeller.
Vifte af kirurgisk resultater detaljerede OLT-når du forsøger Subretinal injektion
HR-SD-okt evaluering af forsøg subretinal injektioner givet en lang række resultater. Første, de mest almindelige erfaringer var bekræftelse af, at den injicerede væske blev med succes leveret inden for den sub retinal plads. Åbningen af den implicitte subretinal plads (som lukker under udvikling) lavet en bleb, der kunne visualiseres tydeligt både i en ansigt af HR-SD-OLT og i b-scan-billeder. Hypo-reflekterende væsken var omkranset af neurale nethinden ovenfor og den hyper-reflekterende ÅV cellelag stadig imod BM, nedenfor (figur 4). Omfanget af subretinal injektionen kunne bestemmes, hvis dyret var afbildet af HR-SD-okt umiddelbart efter injektion (se nedenfor). For det andet injektionen kunne forekomme i choroidal rummet (under BM) i stedet for i den subretinal plads. Dette resulterede i en hyper-reflekterende lag (ÅV) afgrænser kuplen af regionen væske-fordrevet af nethinden, og ingen hyper-refleksion på de bageste grænserne for øjet i OLT b-scanninger. Tredje, en anden potentielle resultat, der kan opstå under forsøget på subretinal injektion var en retinale schisis (opdeling) på nerve fiber lag. Dette resultat gav en normal ydre retina anatomi, men den inderste lag af nethinden indkapslet bleb, som måske eller måske ikke har invaderet glaslegemet. I princippet, sådan et schisis mønster kan forekomme med indsprøjtning overalt inden for lamineringer af neurale nethinden korrekt, men vi har kun set nerve fiber lag schisis til dato. For det fjerde en intravitreal injektion kan også forekomme, som har ingen indvirkning på OLT. Alle disse fejl skyldes den indledende forveksling af spidsen af nålen glas, eller måske nogle små bevægelse af kanylen under injektion, på grund af pres hovedet af koblede flow injektion enhed.
Kendetegner placeringen af Subretinal injektion
En kritisk faktor for effekten eller toksicitet af kandidat behandlingsformer er muligheden for at sammenligne retinal regioner, der har modtaget vektor vs dem, der ikke har. Vi instrueret betydelig indsats i at udvikle et middel til at markere område af nethinden involveret i de subretinal injektioner, så under opfølgende undersøgelser, vi kunne identificere areal omfanget af nethinden hvor behandlingsformer blev anvendt, og dermed hvor transduktion var muligt. Guld NPs tilladt et højt niveau af tillid i at identificere regioner i nethinden, som blev eller ikke blev injiceret. Men de specifikke partikler eller deres formulering viste sig at være giftige og resulterede i en svær lokaliserede retinal degeneration på webstedet af subretinal injektion af 24 timer post injektion (data ikke vist). Derfor, har vi udviklet en alternativ metode til tilknytning af injektionsstedet direkte fra HR-SD-okt billeddiagnostiske data. En metode til præcist at identificere injektion site grænser blev udviklet ved hjælp af måleværktøjer (calipre) i softwarepakke af instrument (figur 5). Vi kunne identificere kanten af bleb netop ved at undersøge de enkelte b-scanninger (fra ringere superior nethinden) bruges til at oprette fundus billedet. Når du placerer en skydelære på det punkt, hvor bleb skærer den vedlagte nethinden, er placeringen af caliper automatisk kortlagt på den tilsvarende b-scanning af en ansigt fundus billedet på den præcise position langs x-aksen hvor caliper var placeret på b-scan. Gentage denne proces gør det muligt at spore kanten af bleb på en en ansigt fundus billedet. Justeringsprocessen kræver, at lignende regioner af nethinden er afbildet hver gang i forhold til den konstante synsnerven hoved, og billederne kan skal drejes for at justere de retinale blodkar fra flere billeder før data adskillelse. Efter justering proces af post injektion billede og efterfølgende opfølgning billeder var regionen injektion overlejret over punkt datagitteret til at identificere placeringen af målinger i regionen inddraget i de nethindeløsning. Disse data kan afbildes som en overflade kort, som gav et visuelt værktøj til at identificere datapunkter inklusive injektionsstedet i forhold til regioner uden for injektionsstedet.
Kortlægning ger. tykkelse i 3D
Endelig, vi optage målinger af ger., OSL eller andre retinal lag fra den hele afbildet område af nethinden, og derefter plotte data ved hjælp af en overflade plot (figur 5). Sammenføje grænsen kort af injektionsstedet tillader adskillelse af de to datasæt, herunder det injicerede område og regionen som ikke blev adskilt under indsprøjtningssystem processen. Yderligere kunne forarbejdning og data analyse derefter udføres på disse to datasæt til at afprøve hypoteser, specifikke terapeutiske agenter kan redde retinal degeneration eller fremkalde toksicitet. Denne tilgang potentielt giver mulighed for eksperimenterende og kontrollere data skal indsamles fra et enkelt øje, sammenligne injiceres vs ikke-indsprøjtning regioner i det samme øje.
Figur 1 : UHR-SD-okt enhed. HR-SD-okt anordningen er vist. Instrument rack (A) indeholder computerskærmen (en), tastaturet og musen (b), boksen sonde interface (c), OCT motor (d), computer (e), betjeningsanordning for den super selvlysende Emitting dioder (infrarød) (f), og den uninterruptible power supply (g). Den optisk bænk (B) indeholder billedbehandling sonde optisk hovedet (for musen nethinden) (h), multi-akse (lineær og roterende) manipulatoren, (jeg), og en mus emne (j). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Progressive ydre Retinal Degeneration i delvist humaniseret adRP model målt som HR-SD-okt (A) HR-SD-okt billeder af nethinden blev opnået for adRP modellen (hC1 x BL/6 (J)) på forskellige alderstrin, C57BL/6(J) kontrol på 14 uger og homozygot hC1 mutant linje på 3 uger. Den ydre retina havde en normal udseende på 3 uger i adRP model, men der var tegn på progressiv ger. udtynding og uorganiseret på og ud over 10 uger gammel. Af 37 uger, (hC1 x BL/6(J)) påvist omfattende ydre retinal degeneration. Alle OCT scanninger var i nærheden af synsnerven. (B) ger. tykkelse (i mm) langs vandret akse gennem synsnerven var afbildet for kontrol (C57BL/6(J)), hC1 og adRP dyr i forskellige aldre. Der blev gradvis tab af ger. tykkelse i delvist humaniseret adRP model. GER. tab var større end 60% af 37 ugens i alder. Fejllinjer = standard fejl af middelværdien. Rød skalalinjen = 200 µm og alle billederne er de samme skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Kvantitative foranstaltninger af ydre nukleare lag og ydre segment længde ved hjælp af HR-SD-okt (A) mus linjer bruges til at påvise ger. og OSL foranstaltninger. Repræsentant OCT billeder fra 2HRho1T/1T (2 doser HRho) på mus RHO knockout baggrund) (venstre panel) og N129R - x 129R-(en dosis menneskelige RHO på musen RHO knockout baggrund) (højre panel). (B) er der vist et eksempel på hvordan calipre var anbragt for at måle ger. (rød) og OSL (blå). (C) data hidrørende fra tre dyr på hver linje for ger. tykkelse var afbildet i søjlediagrammet format viser sammenligning af 2HRho1T/1T linje og N129R - x 129R-(venstre panel). Linjen 2HRho1T/1T har ~ 8 µm tykkere ger.. For at vise forskelle i OSL, blev flere målinger (syv) foretaget fra en b-scan fra hver mus linje fra ELM til BM som i B (blå linje) i 9 uger gamle dyr (højre panel). Dette viste ~ 5 µm forskel i OSL på dyr med 1 vs 2 kopier af HRho-genet. GER og OSL foranstaltninger var statistisk signifikante, ger. p-værdi = 1.7e-5 og OSL p-værdi = 6.4e-5. Fejllinjer = standard fejl af middelværdien. Rød skalalinjen = 100 µm både b-scanninger i 3A har samme skala, 3B er zoomet til at øge klarheden af de retinale lag og give en kvalitativ demonstration af hvordan målingerne blev erhvervet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Typer af intraokulært injektioner i mus identificeret af HR-SD-okt (A). A (hC1xBL/6(J)) mus blev sprøjtet med ~ 1 µL af væske via Inferonasal transcleral transchoroidal injektion. Den resulterende nethindeløsning ses som grønne nederste højre regionen da ansigtet billedet, at skabe en skarp kant på forkanten af bleb på højre side af billedet. OCT fundus billedet af en injektionsstedet udstiller kun subtile forskelle afhængigt af placeringen af den flydende fyldt hulrum, fordi billedet er en samling af alle b-scanninger fra hele retinal tykkelse. Derudover ændrer injektion bleb afstand af den retinale overflade fra OCT medaljon, producerer en ufokuseret region på injektionsstedet. (B) OCT b-scanning af en ikke-indsprøjtning nethinden er påvist. ONH er mærket. (C) en subretinal injektion er påvist. ONH er mærket, og pilene i en ansigt billede (højre paneler) viser den bageste kant af udstationering. (D) A choroidal injektion er påvist med en klar udvidelse (opadgående forskydning) af ÅV lag (hyper-reflekterende kurve) på den nederste kant af nethinden (pile) og betydelige tab af hyper reflektivitet af ÅV og plexus lag nedenfor de injiceres væske. Sammenlign pile i billeder (C vs D). (E) A retinale schisis er påvist i nærheden af nerve fiber lag. Observere den meget tynde hyper-reflekterende membran indkapsle den injicerede væske, mens nethinden forbliver fastgjort til ÅV. Subtile forskelle mellem de tre forskellige afdelinger kan også visualiseres i en ansigt billeder (C, D, og E). Subretinal udstationering har en grænse, som er svært at visualisere (pile i C), mens den choroidal injektion skaber en sløret hyper reflekterende kant på forkanten af bleb, og den retinale schisis fremgår af en skarp afgrænsning af sin forkant (E). Begge røde skala barer = 200 µm i 4B. Alle billeder 4B-4E skaleres ligeligt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Kortlægning og kvantificere ydre Retinal ændringer efter Subretinal injektion. En metode blev udviklet til at identificere regioner af interesse under opfølgende undersøgelse af mus, der havde subretinal injektion af vektor, med 3D-plotning af ger. målinger fra flere OCT b-scanninger. En 2HRho1T/1T dyr blev sprøjtet med en selv-supplerende adeno-associeret virus udtrykker både normal god landbrugspraksis og bly kandidat hammerhead ribozym (scAAV-NGL ad6 hhRz 725) (OS øjet) i en toksicitet skærm. (A) filmede umiddelbart efter, areal omfanget af injektion var kortlagt ved at placere calipre på forkanten af bleb på det punkt, hvor de ydre segmenter adskilt fra ÅV i b-scanninger (venstre panel (rød caliper)). Placeringen af caliper værktøj er automatisk tilknyttet fundus billedet, og dette er gentaget og kompileret til så mange b-scanninger efter behov, hvilket afhænger af den ønskede opløsning (hver 5th scanning i (A) (højre panel)). Efterfølgende OCT undersøgelser (hver 2 uge) afbildet den samme region af retina tillade overlejring; ONH og retinale blodkar er landmærker at lette de kartesiske eller roterende justeringer. Hele regionen af nethinden blev målt til ger. tykkelse forudsat de nødvendige grænser (OPL og ELM) var synlige. (B) at kortlægge ger. længde over sprøjtes overfladen caliper positioner (farvekodede) er igen kortlagt på fundus billedet og samlet til en sammensat billede. Hver 5th b-scanning fra OCT billeder blev målt med indbygget calipre på op til ti point på tværs af nethinden. (C) før og efter kompileret billeder er roteret, ved hjælp af billedbehandling software til at justere retinale kar, som giver mulighed for datapunkter i fritliggende retinal region nethinden kan identificeres af billedoverlejring og adskilt. (D) dataene, der er kortlagt i en tabelformat, identisk med fundus billedet array, og opdelt i to grupper (målinger inden for bleb (røde højdepunkter) og dem, ikke der). (E) Data er præsenteret ved hjælp af en 3D overflade plotting funktion, som giver mulighed for visualisering af ger. tykkelse over hele afbildet regionen. Dette giver mulighed for vurdering af kvantitative forskelle mellem injiceres og ikke-indsprøjtning regioner i øjet. Revne i den 3D plot (E) leverer en nem måde at adskille datasæt ger. målinger inden for regionen i den Fritliggende nethinden fra den region, der forblev fastgjort umiddelbart efter injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Program bruges til at trække glas nåle. Programmet parametre opnår glas nåle nyttigt for subretinal af trans-sclera, transchoroidal tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HR-SD-okt giver en simpel metode til karakterisering af potentielle dyremodeller for sygdom hos mennesker til at bestemme deres anvendelighed i test potentielle therapeutics. Evnen til hurtigt og pålideligt karakterisere en potentiel dyremodel af human sygdom er afgørende for processen med terapeutisk drug discovery (fx, udskiftning genterapi, ribozym eller shRNA knockdown genterapi, kombinerede genterapi). HR-SD-okt giver en enkel, hurtig og ikke-invasiv metode til evaluering retinal sundhed, der kan bruges til at karakterisere og overvåge progression af den retinale degeneration i næsten enhver musemodel. OCT billeder kan bruges til at indhente målinger af nogle eller alle af de forskellige lag af nethinden, hvilket kan give en detaljeret vurdering af en ydre retinal (fotoreceptor) degeneration over tid eller virkningen af terapeutiske redningsforsøg på degeneration omfang eller kinetisk tidslinje. HR-SD-OLT kan også bruges til at vurdere giftighed af leverede vektor eller materialer. Den mest betydelige indvirkning på en fotoreceptor retinal degeneration forskningsprogram er evnen til at gøre raffineret målinger af ger. over tid med levende dyr. Man kan afbilde en retinal degeneration tidslinje til at udtrække en tid konstant, som er et kritisk første skridt til at evaluere effekten og toksicitet af kandidat therapeutics i de samme modeller over en tidsmæssig vindue terapeutiske muligheder. Denne teknologi giver også mulighed for betydelige besparelser af dyrebare ressourcer (dyr og tid) i forhold til klassisk slutpunkt histologi ved at tillade forskeren til at identificere abnormiteter i de dyrs kohorte før indtastning af en undersøgelse og fjerne dyr der ikke opfylde eksperimentelle kriterier (f.eks., vellykket subretinal levering).
Behovet for præcis levering af visse therapeutics i mus øjet subretinal plads er udfordrende, og HR-SD-okt giver en præcis visuel bekræftelse af vellykket subretinal injektioner som et kriterium for igangværende optagelse af dyr i den præ-klinisk undersøgelse design. Der kræves omfattende indsats ofte følge dyr injiceres i gen terapi undersøgelser over tid, da disse modeller ofte simulere menneskelig retinal degenerative sygdomme, hvor sygdommen tidslinjer opstå i årtier. Talrige opfølgende undersøgelser er nødvendig for at bestemme terapeutisk virkning eller at vurdere toksicitet. En løsning på denne vigtige udfordring er at have evnen til at identificere og fjerne dyr fra undersøgelse design, der er kirurgisk fiaskoer for levering af den terapeutiske vektor. Evnen til at levere en vellykket injektion for en veluddannet tekniker med års erfaring har henvendt sig til 90% hvis indsprøjte ene øje pr. dyr, og cirka 80% succes hvis indsprøjte begge øjne. Med denne effektivitetsniveau er fjernelse fra undersøgelsen design af dyr med mislykkede injektioner fordelagtig for hypotese testning. Dette ikke kun sparer kritisk tid men giver også mulighed for mere ensartede og forudsigelige resultater. Derudover HR-SD-okt gør det muligt at reducere antallet af dyr kræves for enhver et eksperiment ved at lade de samme dyr skal følges over tid, hvilket mindsker den dyr at dyr variation i både eksperimentelle og kontrol grupper, og giver mere robust statistisk vurdering af hypoteser om den potentielle effekt og toksicitet af kandidat therapeutics.
Omfanget af retinale dækning af en subretinal injektion er typisk ikke 100%, som selv kan være giftige31,32,33,34. Evnen til at skelne mellem transduced og ikke-transduced regionerne er derfor afgørende for ordentlig afprøvning af hypoteser om redning og toksicitet for en bestemt kandidat terapeutisk. Den kreative brug af tilgængelig softwareværktøjer giver mulighed for præcis kortlægning af subretinal injektioner i mus øjet. Den umiddelbare billeddannelse af det injicerede øje giver retning for opfølgende imaging til områder af interesse, og muligheden for at sammenligne regioner, der har været transduced til regioner, som ikke er blevet behandlet inden for den samme verden. Afhængigt af kortlægning præcision ønskes, denne proces kan udføres for hver b-scan eller periodisk prøveudtagning fra ensemble af b-scanninger indsamlet straks post injektion og kompilere alle fundus billeder til et enkelt billede bruge grafik software så at den stykvis kontinuerlig grænsen er nøje kortlagt på fundus billedet. Sammenligne billeder fra umiddelbart efter injektion til opfølgende billeder kræver at billederne justeres således, at måling positioner kan blive kortlagt på fundus billedet, og datapunkterne kan være opdelt injektionsstedet og ikke-indsprøjtning regioner af den nethinden. Kortlægning af synsnerven hoved og de retinale blodkar kan også opnås ved hjælp af denne samme metode, som hjælper i retningen af øjet, når du forsøger at justere efter injektion billeder med efterfølgende opfølgning billeder. Denne information kan bruges i efterfølgende imaging til at identificere område af nethinden hvor injektion var sket. Selvfølgelig, når dyrene er aflivet, kan placeringen af EGFP udtryk, leveret af en AAV vektor som også indeholder en kandidat terapeutisk gen (fx, ribozym), også bruges til at sammenligne placeringen af transduktion med området bestemmes af billedtilknytning, der bygger på placeringen af blodkar. Dette vil give mulighed for identifikation af diffusion af vektor i den efterfølgende lukkede subretinal plads ud over områder af anatomiske udstationering.
Vores succes med brugen af guld NPs at mærke den subretinal bleb var begrænset på grund af toksicitet fremkaldt af de anvendte materialer. Vi vil opfordre yderligere undersøgelse af sådanne materialer at mærke omfanget af subretinal blebs, hvis alternative præparater (varierende dimensioner, overflade ændringer) findes der ikke fremkalde toksicitet.
HR-SD-OLT giver en enorm mængde af oplysninger betydeligt mindre tid og ressourcer, og kan være quantitated for at få flere oplysninger om effekt og toksicitet af potentielle therapeutics i forhold til traditionelle metoder som histologi. Brugen af denne teknologi gør det muligt for forskeren at afhjælpe en af de alvorlige flaskehalse i prækliniske retinal drug discovery35. Musen RIS og HR-SD-okt er kraftfulde værktøjer til at støtte prækliniske retinal gen terapi studier som en del af vores RNA Drug Discovery program. Disse værktøjer kan anvendes bredt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kommercielle relationer: MCB: None; JMS: ingen. Retinal imaging system (RIS)23 anvendes i denne undersøgelse er en roman enhed til væsentlig nytte for enhver gruppe søger at gennemføre gen terapi levering undersøgelser i mus, rotter eller små dyr. Mens forfatterne har ingen konflikter at erklære over for denne enhed på dette tidspunkt, University i Buffalo - SUNY og Veterans Administration har rettigheder i den intellektuelle ejendomsret og kan søge at kommercialisere dette instrument fremover.
Acknowledgments
Dette materiale er baseret på arbejde delvist, understøttet af Institut for veteraner anliggender (VA), Veterans Health Administration, Office for forskning og udvikling (Biomedicinsk Laboratorium forskning og udvikling) (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS er ansat, dels som ansatte læge-videnskabsmand, oftalmologi, af VA WNY; MCB er delvis ansat af VA WNY. Undersøgelsen blev gennemført på, og støttet delvis af Veterans Administration Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Oplysningerne repræsenterer ikke synspunkter Department of veterananliggender eller de Forenede Staters regering. Støttede også, i store del, ved NIH/NEI R01 giver EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 give EY016662 (UB Vision infrastruktur Center, PI: M slagtning, direktør - Biophotonics modul: JMS), en ubegrænset tilskud til Institut for oftalmologi/Universitet på Buffalo fra forskning til at forebygge blindhed (New York, NY), og et tilskud fra Oishei Foundation (Buffalo, NY). Vi anerkender gaven af hC1 transgene RHOP347S linje og exon 1 musen RHO knockout fra Dr. Janis Lem (totter New England Medical Center, Boston, MA), og gaven af Knud-E transgen model i den heterozygous stat på den musen exon 2 RHO knockout baggrund fra Drs. G. Jane Farrar og Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
