Summary
Kvantifiering av givare-derived celler krävs för att övervaka engraftment efter stamcellstransplantation hos patienter med hemoglobinopathies. En kombination av flow flödescytometri-baserade cell sortering, koloni bildandet assay och efterföljande analys av kort tandem repetitioner kan användas för att bedöma spridning och differentiering av stamfäder i erytroid facket.
Abstract
Förekomsten av ofullständig chimärism noteras i en stor andel av patienter efter benmärgstransplantation för thalassemi större eller sicklecellanemi. Denna observation har oerhörda konsekvenser, som efterföljande terapeutiska immunmodulering strategier kan förbättra kliniska resultat. Konventionellt, används polymerasen kedjar reaktion-baserad analys av short tandemupprepningar för att identifiera chimärism givare-derived blodkroppar. Men denna metod är begränsad till kärnförsedda celler och inte kan skilja mellan dissocierade encelliga härstamningar. Vi tillämpade analys av short tandemupprepningar flöda flödescytometrisk-sorterade hematopoetiska stamceller och jämfört detta med analysen av short tandemupprepningar som erhållits från utvalda burst-forming unit - erytroid kolonier, och båda samlas in från benet märg. Med denna metod kan vi demonstrera olika proliferation och differentiering av givare celler i erytroid facket. Denna teknik är berättigad att slutföra nuvarande övervakning av chimärism i den stamcellstransplantation inställning och kan således vara tillämpad i framtiden kliniska studier, stamcellsforskning och design av genterapeutiska prövningar.
Introduction
Allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) är endast tillgängliga läkande metod för en mängd olika medfödda genetiska störningar i det hematopoetiska systemet, att uppnå sjukdomsfri överlevnad på mer än 90% för annars mycket äventyras och begränsad livslängd patienter1. Effekten av detta viktiga terapeutiska verktyg har optimerats genom att begränsa toxiciteten av pre- och efter transplantation regimer2, men också genom insatser som syftar till att upprätthålla stabil transplantatfunktion, som kvantifieras genom noggrann övervakning av givare-derived celler3,4,5.
I allmänhet, innebär komplett chimärism (CC) total ersättning av lymphohematopoietic facket av givare-derived celler, medan begreppet mixed chimärism (MC) används när givare - och mottagare-härledda celler förekommer samtidigt i olika proportioner. Split chimärism (SC) betecknar samexistens av mixed chimärism hos encelliga härstamningar, såsom i erytroid facket. Snabb bestämning av chimärism status efter HSCT är kritisk, eftersom det kan bidra till att identifiera patienter som är mottagliga för återfall och inleda efterföljande immunmodulerande strategier, såsom donator lymfocyt infusioner eller minskning av immunsuppressiva terapier6.
Flera metoder har utvecklats för att övervaka engraftment efter HSCT. Isotyping av immunglobuliner och analys av cytogenetik har dålig känslighet och är begränsad i sin förmåga att upptäcka polymorfism7,8. Införandet av fluorescerande i situ hybridisering (FISH) kan förbättra känsligheten i chimärism övervakning efter HSCT, men är begränsad till sex-felaktigt organtransplantationer9. För närvarande, polymeras-kedjereaktion (PCR) är den mest utbredda metoden som används för att upptäcka chimärism och bygger på konventionell agaros-akrylamid gelelektrofores av variabeln antal tandemupprepningar (VNTRs) eller kort tandem upprepas (misstänkta). Rutinmässigt används är kvantitativa PCR kunna upptäcka en extremt liten andel av kvarvarande donatorcellerna efter HSCT. Den största begränsningen av studierna hittills är att MC upptäckt är nästan uteslutande begränsad till närvaro av kärnförsedda celler, i stället för mogna erytrocyter, nämligen celler att är funktionellt avgörande för patienter drabbade av hemoglobinopathies. Hos patienter med olika blodgrupper är det värt att komma ihåg att cytofluorometric analys är att identifiera chimärism röda blodkroppar genom att utnyttja monoklonala antikroppar riktade mot erytrocyt antigenerna ABO och C, c, D, E och e10 , 11. ett annorlunda, men mycket intressant sätt att bedöma chimärism i erytroid släktlinje är kombinationen av flöde flödescytometrisk sortering av erytroid stamfäder och val av olika erytroid stamceller typer av odling i clonogenic analyser, följt av analys av STR12. Detta tillvägagångssätt är kunna kvantifiera relativa andelar av givare-kontra-mottagare chimärism i erytroid facket och kan utnyttjas i strategin för att upprätthålla benmärgen graften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolering av hematopoetiska benmärgsceller av multi-parameter fluorescens-aktiverad Cell sortering
- prov färgning
- innan processen startar, följande objekt måste samlas och förberedd:
- Gradient media för beredning av mononukleära celler (GM), 50 mL koniska rör
- 12 x 75 mm flöde rör för färgning celler
- färgningen buffert: fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 3% fetalt kalvserum (FCS)
- pipetter < / l Jag >
- FC block och färgning antikroppar (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Med denna fluorokrom kombination finns det försumbar spridningseffekter till andra kanaler, men någon annan lämplig fluorokrom kombination är också möjligt.
- Ersättning pärlor (om nödvändigt)
- Suspension buffert: Hank ' s balanserad Salt lösning (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
- Trypan blå och hemocytometer
- Samling rör: alla rika medier med hög serum rör (som innehåller 1 mL FCS + 25 mM HEPES) kan användas för insamling av sorterade celler.
- Benmärg prov: vanligtvis krävs informerat samtycke för benmärgsbiopsi från höftbenskammen på baksidan av höftbenet. Benmärgsprov är än höll i hepariniserad sprutor på RT till färgning. Följande protokoll steg utförs i enlighet med riktlinjerna i institutionens ' s mänskliga forskningsetisk kommitté för mänsklig välfärd.
- Generera en enda cellsuspension av benmärgsprov. Tillsätt 3 mL GM till centrifugröret. Noggrant lager i 4 mL av den enda cellsuspensionen på GM lösningen. Centrifugera vid 550 g under 30 minuter vid 20 ° Celsius (C) (broms är avstängd). Dra i det övre lagret som innehåller plasma och trombocyter med steril pipett, lämnar det mononukleära celllagrar ostört på gränssnittet. Överföra lagret av mononukleära celler till ett sterilt centrifugrör med steril pipett.
- Efter tvätt med 5 mL färgning buffert, resuspendera cellerna i 2 mL suspension buffert och avgöra cellkoncentrationen. Placera 5 µL cellsuspension i ett provrör med skruvlock. Tillsätt 95 µL av 0,2% Trypan blå fläck. Blanda noggrant. Låt stå i 5 min i rumstemperatur. Fyll en hemocytometer när det gäller cell räknar. Under mikroskopet, ser om icke-viabla färgas och räkna de viabla cellerna.
- Centrifugera cellerna vid 250 g i 10 min vid 20 ° C, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i färgning buffert vid en koncentration på upp till 1 x 10-6 per 100 µL.
- Blockera FcR genom användning av 2,5 µg Fc Block per 1 x 10 6 celler på is för 10-15 min.
- Lägg till lämplig kombination av 10 µg mAb att fläcken 1 x 10 6 celler och inkubera i 20 minuter vid 4 ° C i mörker, följt av en tvätt steg med 3 mL färgning buffert. Rätt ersättning färgas små delprover av celler (eller helst ersättning pärlor) med enda antikroppar vardera; en alikvot återstående ofärgade.
- Justera koncentrationen till 20 x 10 6 celler/mL.
- Uppsättning upp och optimera cell Sorteraren. Processen för att ställa upp en flödescytometer och programvara är standardiserad med en detaljerad instruktion som tillhandahålls av företaget och behöver utföras av lämpligt utbildad personal.
- innan processen startar, följande objekt måste samlas och förberedd:
- Sortering på cell Sorteraren
- förbereda insamling rör från steg 1.1.1.9.
- Ställa in en mall som innehåller en bivariate tomt att Visa framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC).
- Kör cellerna och justera FSC/SSC för att placera befolkningen av intresse i skala
- Spela in negativ kontroll röret.
- Kör enda positiv kontroll rören; registrera data för varje tub.
- Beräkna ersättning antingen manuellt eller automatiskt med funktionen som tillhandahålls av programvaran förvärvet.
- Förvärva experimentella provet och utfärda utegångsförbud för dem på en bivariate FSC/SSC dot tomt ( figur 1A) att inkludera både lymfatisk och myeloida celler. Utesluta midjekort jacka och aggregat genom att jämföra de olika signalerna av FSC (dvs, höjd, bredd och area) ( figur 1B). Visualisera singlet cellerna på en bivariate dot tomt visar CD45 och CD36 ( figur 1 c). Händelser som är positiva för CD45 är leukocyter (inklusive deras stamfäder), de negativa för CD45 och positivt för CD36 är erytroid stamfäder. Använd Usenets verktyg för att definiera CD36 + (om önskas, dessa celler kan delas upp ytterligare i CD36 hög och låg uttrycker celler) och CD45 +-celler. Visualisera CD45 + händelser i en annan dot tomt visar CD34 och SSC parametrar. Användning gating verktyg för att definiera CD34 + celler (leukocyt föräldraparets) och SSC hög celler (myeloida celler i olika stadier av differentiering).
- När gates har bestämts, grindarna kan väljas för att sortera in externa samling rören.
- Fortsätt med sortering vid 4 ° C tills det nödvändiga antalet celler har erhållits
- Utföra en efter sortera analys för att bestämma renheten av de sorterade cellpopulationer ( figur 1E, 1F).
2. Clonogenic Assay
- beredning av reagens
innan du börjar, behöver följande produkter samlas in och förberett:- pipetter, 100 mm plattor
- Trypan blå och hemocytometer
- Bered humant rekombinant erytropoietin (EPO) 500 U/ml i sterilt PBS som innehåller minst 0,1% humant serumalbumin. Dela denna lösning i små portioner och hålla på-20 ° C för att undvika upprepad frysning-tining.
- Förbered slutföra Iscove ' s ändrad Dulbecco ' s Medium (IMDM) med slutliga koncentrationer av 5% FCS, 2 mM glutamin, 100 enheter/mL Penicillin/Streptomycin (PS). Lägg till humant rekombinant erytropoietin (EPO) vid olika koncentrationer i separata brunnar till komplett IMDM medium: 3 enheter EPO per brunn, 6 enheter EPO per brunn och 12 EPO enheter per brunn (1 x, 2 x, 4 x EPO respektive).
- Beredning av benmärg celler
- 10 mL benmärg provet spädas med 20 mL PBS är långsamt lager ovanpå 15 mL täthet lutning medium i en 50 mL konisk tub, upprätthålla tydliga gränssnitt mellan de två faserna och du nder sterila förhållanden. Sedan Centrifugera 15 mL koniska rören på 550 x g i 30 min i rumstemperatur (RT) med som 9-acceleration och retardation anges som 0 (eller broms OFF).
- Efter centrifugeringen, bort gränssnittet i en ny 50 mL tub och lägga PBS till en slutlig volym 50 ml.
- Efter centrifugering med 250 g under 10 minuter vid 10 ° C avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i fullständig IMDM medium på cirka 0,5 x 10 6 celler/mL. Ta 10 µL cellsuspension i ett mikrorör, blanda med samma volym av Trypan blå lösning (0,4%) och räkna med en hemocytometer.
- Oillval: CD34 + celler berikas av magnetiska cell sortering med Milteny CD34 pärlor enligt de instruktioner som ges av tillverkningen. Den största fördelen med denna berikning steg är att upptäcka kvaliteten på hematopoetiska stamceller, som odlas på en halvfast matris till med 50 ng/mL stamceller faktor (SCF), 20 ng/mL granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF), 20 ng/mL interleukin-3 (IL-3), 20 ng/mL interleukin-6 (IL-6), 20 ng/mL granulocyt granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF) och 3 olika koncentrationer av EPO som i 1.4.
- Späd cellerna till 0,1 - 0,15 x 10 6 mononukleära celler/mL eller 2 x 10 3 CD34 + celler/mL genom att lägga till komplett IMDM medium kompletteras med EPO och överföring 300 µL till 3 mL Methocult H4434 medium. Efter agitation och en kort inkubation för 5 min tallrik tre gånger 1,1 mL på en 35 mm maträtt. Två av dessa kultur rätter tillsammans med en tredje - fylld med vatten - placeras i 100 mm plattor.
- Celler odlas i en fuktad 37 ° C inkubator med 5% CO 2 i 14 dagar.
- Analys av kolonier
- kolonier poängsätts enligt deras morfologi med ett inverterat Mikroskop med 40 X förstoring i en kultur maträtt markerade med ett scoring rutnät. Enligt vår analys, de koloni bildar enheterna (CFU) klassificeras i 4 kategorier: multipotential stamceller (CFU-GEMM), granulocyt-makrofag stamceller (CFU-GM), brast bildar enheten-erytroid (BFU-E) och kolonibildande enhet-erytroid (CFU-E). Se tillverkarens ' anvisningar för ytterligare kolonin underklassificering.
- För vidare analys, återvinns celler från CFU assay plattan separat enligt 4 kategorier genom att avbryta i rumstemperatur för 4 mL PBS som innehåller 2% FCS/IMDM. Efter centrifugering vid 400 g i 10 minuter vid 4 ° C, cellerna är resuspended i PBS, räknade och bearbetas för DNA-extraktion.
3. Analys av chimärism
- DNA isolering
- Pellet cellerna genom centrifugering vid 400 g i 10 min.
- Isolera DNA med en blod DNA extraktion kit (QIAmp DNA blod utvinning kit). Pre värma eluering bufferten (AE) vid 37 ° C att öka avkastningen av eluerade DNA.
- Mätning av DNA-koncentrationen med Nanodrop ND-1000 spectra fotometer. Prover med OD 260/280 mellan 1.8-2.0 används för ytterligare analys.
- Späda DNA med DNAase gratis H 2 O till 0,1 ng/µL i en total volym på 50 µL.
- STR-analys
- ställa in PCR-reaktionen genom att blanda reaktionsblandning, AmplTaq guld DNA-polymeras och Profiler Plus Primer Set med 20 µL genomiskt DNA (0,1 ng/µL) enligt handboken (primer kitet innehåller den omärkta grundfärger i buffert för att förstärka de STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, och D7S820 och den kön markör amelogenin). Inkludera nuclease-fritt vatten som negativ kontroll och 9947A som positiv kontroll. Före transplantationen DNA från både givare och mottagare ingår också.
- Utför PCR-reaktion med Eppendorf mastercycler lutning med följande villkor: 95 ° C under 11 min, 28 förstärkning cykler av 95 ° C i 1 min, 59 ° C i 1 min och 72 ° C i 1 min, följt av 60° C för 45 min.
- Uppsättning upp fragment analys reaktion genom att lägga till 12 µL Hi-Di Formamid och 0,5 µL GeneScan 500 ROX storlek Standard (alla Applied Biosystems) till 1 µL av PCR-produkten. På första och sista ståndpunkt behövs en alleliska stege (Genotyper Amp Fl STR Blue, Green II och gul, Applied Biosystems).
- Starta elektrofores och förvärv med instrumentet elektrofores.
- Analysera Loci, alleler och peak höjder av prover och kontroller med programvara 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Separation av lymphohematopoietic stamfäder FACS cellen sortera
Här visar vi resultat från sortering av nödvändiga cellpopulationer för nedströms STR analys. Benmärgsceller var fläckade V450-konjugerad anti-CD45, FITC-konjugerad anti-CD36 och APC-konjugerad anti-CD34. Befolkningen av intresse är de megakaryocyt erytroid stamfäder (MEP), nucleated cellerna som ansvarar för utvecklingen av erytrocyter. Dessa celler uttrycker CD36, men är negativa för den gemensamma leukocytantigen CD45 (figur 1 c). Om nödvändigt, kan dessa celler ytterligare differentieras baserat på deras CD36 uttryck nivå. Flera ytterligare populationer kan sorteras för att tjäna som kontroller. Vi sorterade CD45 + CD34 + lymfoida/myeloida prekursorer som en annan progenitor cell befolkningen och CD45 + celler med hög SSC signal som mogen myeloida celler (figur 1 d). Sortering utfördes med en BD FACSAria I-instrument. Efter sortering, erytroid progenitor cell renhet var > 85% (figur 1E) och myeloida cell renhet var > 95% (figur 1F).
Figur 1 . Sortering av erytroid stamceller och myeloida stamceller efter FACS. Figur 1A/1B visar på FSC-A vs. SSC-A, FSC-H vs. FSC-A och användning av en polygonverktyget gate för att välja befolkningen av intresse. 1 C indikerar MEP på CD45 vs. CD36; 1 D visar mogna myeloida celler. Andelen positiva celler i 1E och 1F visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Generation av burst-bilda enheter - erytroid kolonier
Vissa celler härstammar från benmärgen och åtskilda av CD34-specifika magnetiska pärlor verkar föröka sig och differentiera. Efter en 14-dagars inkubationstid på de halvfasta medium kolonierna bildas. Stimulering med olika koncentrationer av EPO utökades kraftigt bildandet av framstående röd (erytroid) kolonier (figur 2).
Figur 2. Generation av en Burst-forming Unit-erytroid (BFU-E). Visas är en representativ lågenergi-photomicrograph en BFU-E koloni. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| MNC: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| CFU-E | 2 | 2 | 2 |
| BFU-E | 9 | 10 | 8 |
| CFU-GM | 30 | 30 | 29 |
| CFU-GEMM | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ celler: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| CFU-E | 1 | 1 | 0 |
| BFU-E | 5 | 11 | 6 |
| CFU-GM | 25 | 26 | 32 |
| CFU-GEMM | 0 | 2 | 3 |
Tabell 1. Analys av kolonier i osorterade benmärgsceller och CD34 + markerade celler. Kolonier poängsätts enligt deras morfologi med ett inverterat Mikroskop med 40 X förstoring i en kultur maträtt markerade med ett scoring rutnät. Enligt vår analys, kolonierna klassificeras i fyra kategorier: kolonibildande enhet-erytroid (CFU-E), burst-forming unit-erytroid (BFU-E), granulocyt-makrofag stamceller (CFU-GM) och multipotential stamceller (CFU-GEMM).
Analys av chimärism
Chimärism analysen utförs med hjälp av AmpFlSTR Profiler Plus Kit (Applied Biosystems, Kalifornien) enligt tillverkarens protokollet på ABI Prism 310 genetiska Analyzer (Applied Biosystems, Kalifornien). Analysen utförs med GeneMapper programvara (Applied Biosystems, Kalifornien). Loci D21S11, D7S820, FGA och vWA användes för att beräkna resultat (procentandel av mottagare och donator-specifika DNA).
| Prov | Mottagarens DNA | Givare DNA |
| CD45 | 25% | 75% |
| CD36hi | 25% | 75% |
| CD36lo | 55% | 45% |
| CD34 | 25% | 75% |
Tabell 2. Procent mottagare och donator-DNA i celler från fluorescens-aktiverad Cell sortering av benmärgsceller. Chimärism givare celler i specifika cellulära härstamningar från lymphohematopoietic facket ges.
| Prov | Mottagarens DNA | Givare DNA |
| BM-MNC | 24.71% | 75,29% |
| BM-CD34 |
Tabell 3. Procent mottagare och donator-DNA i celler från Clonogenic analysen. Chimärism givare celler i specifika cellulära härstamningar från lymphohematopoietic facket ges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med den aktuella studien är att ge publiken en kombination av två metoder för analysera givare/mottagare chimärism i erytroid föräldraparets efter HSCT hos patienter som behandlas för hemoglobinopathies: 1.) fluorescens-aktiverad cell sortering av hematopoetiska stamceller i benmärgen prov följt av analys av short tandemupprepningar och 2.) kolonibildande enhet växer av benmärgsceller, klassificering av kolonier i olika stamceller följt av analys av short tandemupprepningar. Nyhet i denna strategi ligger i att kombinera tekniker i ett protokoll att utvärdera givare/mottagare chimärism i enskilda kolonier.
Vikten av detta tillvägagångssätt kan hittas i samband med mixed chimärism efter HSCT för patienter som behandlas för hemoglobinopathies. Flera studier har visat att en betydande andel av patienterna express en låg andel av givare myeloida celler som korrelerar med att av erytroid föregångare celler und resulterar i långvarig stabil blandat hematopoetiska chimärism3, 11. däremot i samma patienter en hög andel av givare-derived röda blodkroppar (2 till 5 gånger högre än för mogna leukocyter) noteras och föreslår att den ineffektiva erytropoesen sker i ett senare skede av erytroid utveckling. Dessa observationer har tillskrivits benägenheten för accelererad apoptos i givaren erytroblaster och varaktigheten av T- och B-kvarstående lymfocyter ansvarar för att tillåta en blandad transplantatavstötning14,15. I samband med immunmodulering efter hematopoetisk stamcellstransplantation vi nyligen visat att ändring av immunsuppressiv behandling efter hematopoetisk transplantation för ß-thalassemi resultat i en selektiv fördel för den genetiskt korrigerade erytroid fack, ger en 2 till 2.5 gånger förstärkning av kvarvarande givare stammen celler12. Denna observation stöder nyttan av att bestämma givare-kontra-restvärde erytroid progenitorceller, eftersom det ger en förståelse för detta fenomen och stöder framtida kliniska prövningar studera genterapi för behandling av hemoglobinopathies. I själva verket kan andelen gen-modifierade kärnförsedda celler krävs för att uppnå en terapeutisk nivå av cirkulerande röda blodkroppar vara liknande den som observerats hos patienter behandlade med stamcellstransplantation för hemoglobinopathies.
För att fastställa en fullständig bild av givare erytropoes vi ändrade protokollet och tillhandahålla en detaljerad, steg för steg experimentell metod. Det kritiska steget i detta protokoll är processen för att ställa upp en flödescytometer och programvara, som är standardiserat med detaljerade instruktioner och måste utföras av lämpligt utbildad personal. Presentation av våra protokoll i formatet visualiserade tillåter publiken att följa våra protokoll enkelt. Vi jämförde våra PCR-resultat med genomiskt DNA från erytroid föräldraparets erhållits från kolonibildande enheter i BM prover kontra DNA erhållits från FACS-sorterade erytroid benmärgen stamfäder. Givare engraftment data från de två synsätten överensstämmer i princip. Dock oftast mindre variation hittades i produktproverna kolonibildande enheter. Detta beror sannolikt på givaren röda blodkroppar prekursorer i in vitro-analys jämfört med de obehandlade och sorterade givare motsvarigheterna förbättrad överlevnad. I detta ljus, kan detta protokoll utvidgas genom att artificiellt skapa blandade chimära kombinationer med kända andelen friska stamfäder och stamfäder från ett antal patienter med olika hemoglobinopathies. Clonogenic analys och utvärdering av chimärism bör återspegla i-satte proportioner.
Även om en exakt förståelse av mekanismerna som är involverade i en viss miljö saknas, är den metod som presenteras här av största vikt för att ge relevant information för rutinmässig övervakning av engraftment och prognostiska informationen i klinisk praxis. Försök att rädda transplantatfunktion begränsas av risken för att utveckla graft - versus - host sjukdom och kan styras av seriell engraftment övervakning. Slutligen, denna metod kan också tillhandahålla en användbar bas för forskningsområden som arbetar för att förbättra vården av patienter med hemoglobinopathies, särskilt de som drabbats av akut graft - versus - host sjukdom och autoimmuna sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
