Summary
Biz bir yöntem tarafından grip A virüs viral hemagglutinin hedef insan veya fare monoklonal antikorlar bağlama için gerekli kritik artıkları tanımlamak açıklar. İletişim kuralı diğer virüs yüzey glikoproteinlerin ve onların karşılık gelen nötralize antikorlar için adapte edilebilir.
Abstract
Grip virüsleri uyum ve konak immün yanıt kaçmasına görmeyeteneği sergi. Virüsü yüzey glikoproteinlerin üzerinde antijenik yapılan değişiklikler aracılığıyla bir yoludur. Kaçış türevleri üretimi nasıl virüs bağışıklık algılama kaçış elucidating ve antikor bağlama için gerekli kritik artıkları belirlenmesinde güçlü bir yöntemdir. Burada, bir protokol nasıl grip A virüs kaçış türevleri viral hemagglutinin (HA) karşı yönettiği insan veya fare monoklonal antikorlar (mAbs) kullanarak oluşturmak açıklar. Bizim tekniğin kullanımı ile daha önce iki kafa veya roman kuş H7N9 HA SAP hedefleme antikorlar bağlama için gerekli kritik artıkları ile karakterizedir. İletişim kuralı diğer virüs sistemleri için kolayca adapte edilebilir. Analizleri kaçış versiyonlarının antijenik drift tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) conferring direnci ve virüs sağlık, belirlerken, modelleme ve aşılar ve/veya tedavi tasarımı önemlidir.
Introduction
Benzer şekilde diğer RNA virüsleri, grip A virüs antijenik türevleri çok sayıda her yuvarlak çoğaltma1,2,3nesil için izin veren bir hataya polimeraz sahip. Bir virüs grip uyum ve ile antikor bağlama kaybına neden mutasyonlar yüzey glikoproteinlerin üzerinde bir birikimi yoluyla elde antijenik drift insan bağışıklık yanıtı kaçmasına hayret verici bir yeteneği var. Viral yüzey glikoproteinlerin, HA ve neuraminidase (NA), antijenik sürüklenme gerek reformulate ve aşı her yıl yönetmek gerektirir.
Teknolojik gelişmeler yalıtım ve antijen spesifik antikorların üretimi aşı indüklenen mAbs4,5,6,7,8sayısının yüksek vermiştir. Buna karşılık, geniş grip A virüsleri nötralize mAbs epitopları karakterizasyonu birkaç evrensel grip aşısı adayların9,10,11gelişimi büyük ölçüde destekli, 12,13,14. Antijenik ayak izi bir mAb elucidating nötralizasyon yapısal belirleyicileri ortaya çıkarır ve aşı tasarım bilinçli bir yaklaşım sağlar. Ancak, gerçekçi de yapısal olarak viral antijen15, epitopları eşlemek için mAbs x-ışını kristalografisi veya cryo-elektron mikroskobu aracılığıyla geniş panelleri ayırdetmek laboratuarlar için maliyet-etkin olmadığı 16 , 17 , 18.
X-ışını kristalografisi veya cryo-elektron mikroskobu pahalı donanımları, özel teknikler ve potansiyel olarak geniş bir veri oluşturmak için gereken saat miktarını gerektirir. Alternatif ve daha hızlı bir yaklaşım hataya RNA'ya bağımlı üzerinden çeşitli viral nüfus hızlı nesil kullanan RNA polimeraz epitopları mAbs19,20, belirlemek için kaçış mutantların oluşturmak için 21,22,23. Kaçış türevleri üretimi herhangi bir özel ekipman veya teknik gerektirmez ve geleneksel laboratuvar Kimyasalları ve ekipmanları ile gerçekleştirilebilir.
Burada, grip HA tanımak mAb bağlama için gerekli kritik artıkları eşleme için izin veren bir yöntem açıklanmaktadır.
Protocol
dikkat: bakım ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile ele gerekir Biyogüvenlik seviye 2 sınıf patojenler grip virüsleri (örneğin, H1, H3) nüfus dolaşan vardır. İşleme virüslerin kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylanması gerekir. Aşağıdaki iletişim kuralı Sina Dağı, Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi.
Not: viral çoğaltma inhibe HA özel antikorlar genellikle kategorize i) veya küresel baş üstüne reseptör bağlama sitesinin bitişik olarak bağlamak ve II) distal reseptör bağlama bağlama etki alanı küresel baş yan tarafında ve SAP bölge ha içerir. Reseptör bağlama sitesi hedef antikorlar nişan hedef hücre yüzeyinde sialik asit motifleri önlemek ve bir hemaglütinasyon inhibisyon (hı) yöntemi kullanılarak ölçülebilir. HI-negatif, antikorlar sapı özel antikorlar gibi hala viral çoğaltma inhibe olabilir ama sadece nötralizasyon deneyleri kullanarak değerlendirilebilir.
1. kategorize antikorlar HI ve dayalı nötralizasyon faaliyetleri
- HI tahlil
- bir 96-şey V-alt plaka, 1 x PBS 25 µL 2-12 sütunlarda ekleyin.
- MAb 7B2 (kafa özgü), 6F12 (SAP-özel) 23 ve bir izotip kontrol 100 µg/ml 1 x PBS ve aliquot 50 µL seyreltilmiş antikor hazırlıkları sütun 1 oranında seyreltin. Ayrıca 1 x PBS ( şekil 1A) 50 µL ekleyerek mAb kontrolümü dahil.
- Sütun 2 sütun 1 25 µL aktararak antikorların logosuna 2 kat seri dilutions gerçekleştirmek ve böyle devam eder. Son 25 µL sütundaki 12 ( şekil 1A) atın.
Not: antikor kontrol bir satır eklemek emin olun. - 8 hemaglütinasyon birimleri/25 seyreltilmiş µL virüs hisse senedi için virüs hisse senedi (HA ve NA in A/California/04/09 ile iç kesimleri A/Puerto Rico/8/34 ifade reassortant virüs) oranında seyreltin. Her şey (satır A G) seyreltilmiş virüs stokunun (8 hemaglütinasyon) 25 µL ekleyin.
Not: Son hacmi 50 µL 50 µg/mL başlangıç son konsantrasyon ile antikor ve virüs karışımı olmalıdır. - Incubate 45 dakika süreyle (RT) oda sıcaklığında plaka
- İçin geri titrasyon satır (H), 1 x PBS 50 µL wells H2 H12 için ekleyin. H1 iyi 8 hemaglütinasyon birimleri/25 µL 100 µL ekleyin. Seri olarak iki kat için H2 H1 50 µL aktararak sulandırmak ve böyle devam eder. Son 50 µL iyi H12 üzerinden atmak. Son olarak, 96-şey V-alt plaka bütün wells için 50 µL % 0.5 tavuk kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ekleyin.
Not: Son hacmi 100 µL tahlil mAb örneklerinde olmalıdır: mAb (25 µL), virüs (25 µL) ve RBC (50 µL). MAb kontrol son hacim içermelidir 1 PBS x 25 µL, şunun 25 µL ve RBC 50 µL. - Incubate 4 ° c için 1 h. plaka
- Görsel olarak HI etkinliği için tabak okuyun. Belirli bir antikor için olumlu bir okuma, adım 2.1 kaçış türevlerini oluşturmak için devam edin. Antikor HI-negatif ise, aşağıda antikor hücre kültür tahlil aktivite nötralize varsa değerlendirmek için 1.2 adıma devam.
Not: Koyu kırmızı RBC Pelet 96-şey V-alt plaka bir 45 ° açıyla yükleyen bir gözyaşı damla oluşturacak bir kuyu ( şekil 1B 7B2) ortasına bir HI-aktif mAb olumlu bir okuma simgesiyle gösterilir. Negatif bir okuma ( şekil 1B 6F12 ve hiçbir mAb) iyi bir koyu kırmızı RBC Pelet formu değil. İzotip kontrol de koyu kırmızı RBC Pelet oluşturacak değil ve göz sapı özgü antikor, 6F12 veya yok mAb aynı örnek ( şekil 1B) 23 kontrolü.
- Microneutralization tahlil
- 2 x 10 4 hücreleri/iyi bir doku kültürü'yoğunluğu plaka Madin Darby köpek böbrek (MDCK) hücreleri 96-şey plaka tedavi ve 37 ° C ve % 5 CO 2 17-19 saat için kuluçkaya .
Not: Hücreleri de 4 h kullanmadan önce en az kuyunun uymak için izin. - Yedi ayrı bir 96-şey tabak içinde gerçekleştirmek insan mAb 4D 3 kat seri dilutions 05 5, CR9114 17 veya izotip IgG kontrolde, 200 µg/tosyl ile desteklenmiş mL 1 X en az gerekli orta (MEM) bir başlangıç konsantrasyonu phenylalanyl chloromethyl keton (TPCK)-tedavi tripsin (1 µg/mL) ( Şekil 2).
Not: Satır A 75 µL seyreltilmiş antikor (200 µg/mL konsantrasyonu başlayarak) içermelidir. Seri olarak (3-fold) 25 µL A satırdan satır B için transfer ederek plaka sulandırmak ve böyle devam eder. Satır A h 50 µL son hacmi olmalıdır. İpuçları seyreltme transferler arasında değiştirmek için gerek yoktur. - Seyreltik virüs hisse senedi (HA ve NA in A/Shanghai/1/13 iç kesimi A/Puerto Rico/8/34 ile ifade reassortant virüs) %100 50 doku kültürü bulaşıcı doz (TCID 50)'e / 1 x 50 µL MEM takıma TPCK tedavi ile Tripsin (1 µg/mL) 24. 50 µL/iyi seyreltilmiş virüsü antikoru hazırlıkları (Adım 1.2.2) ekleyin. Hastalık bulaşmamış tek hücre kontrol wells için 1 X MEM 50 µL ekleyin.
- Kuluçkaya virüs-antikor karışımları için 1 h. (%5 CO 2 ile) bir 37 ° C kuluçka
Not: Virüs-antikor karışımları 100 µL toplam hacmi olmalıdır: antikor seyreltme (Adım 1.1.2) 50 µL ve 100 TCID 50 (Adım 1.2.3) içeren virüs 50 µL. - Kuyu medyada Aspire edin ve virüs-antikor karışımları tüm 100 µL eklemek için karşılık gelen wells.
Not: Aspirasyon yapılır 8-kanal aspiratör bağdaştırıcı kullanan bir Vakuma bağlı. Alternatif olarak, bir 8 veya 12 de çok kanallı mikro pipet el ile Aspire için kullanılabilir. Gerek değiştirmek için ipuçları olmadan inoculum Temizleme ve yıkama sırasında tüm aspirasyon antikor en yoğun en düşük yapılır. - Monolayer 1 x PBS 200 µL ile yıkayın. 1 x PBS (aynı derecede içinde adım 1.2.5) 200 µL Aspire edin. Çamaşır, bir kez daha iki yıkar toplam için yineleyin.
- Bulaştırmak monolayer tüm 100 µL/kuyusu monolayer ve bulaştırmak/kuluçkaya 37 ° C'de (ile % 5 CO 2) 1 h. için virüs-antikor karışımları (Kimden adım 1.2.4) ekleyerek MDCK hücre
- Ayrı bir 96-şey plaka enfeksiyon sırasında antikor dilutions başka bir dizi hazır olun. 150 µL ekleme satır a ilgili antikor 100 µg/mL ve 1 x 100 µL MEM ile TPCK tedavi tripsin (1 µg/mL) satırları b H. gerçekleştirin 3 kat dilutions 50 µL A satırdan satır B için transfer ederek takıma , ve benzeri, aşağı satır H. atma satır H. gelen son 50 µL Her biri için Toplam hacim de 100'e eşit µL. kenara.
Not: Antikorlar MEM takıma TPCK tedavi tripsin ile (1 µg/mL) 1 x seyreltilmiş. - Virüs-antikor inoculum kimden adım 1.2.7 monolayer Aspire edin ve tüm 100 µL/kuyusu 1.2.8 adımda hazırlanan uygun antikor seyreltme ile doldurmak.
Not: Eğer iyi yeten 100 µg/mL son antikor konsantrasyon enfeksiyon (Adım 1.2.7), o zaman Yenileyici medya sırasında aynı 100 µg/mL (Adım 1.2.8) son antikor konsantrasyon içermelidir. - Incubate 24 h 37 ° C kuluçka (ile % 5 CO 2).
- 96-şey plakaları medyadan Aspire edin ve 200 µL/kuyu ile 1 x PBS üç kez yıkayın.
- Soğuk % 80 aseton -20, 1 h için 100 µL ile hücreleri tamir ° C.
Not: Çift Kişilik distile (dd) H 2 O (örneğin, % 100 aseton 80 mL artı GKD 2 0 20 mL) % 80 aseton çözüm seyreltilmiş. % 80 aseton çözüm kullanmadan önce buzda soğutulmuş. - 200 µL/kuyu 1 X PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
- Plakayı 200 µL/iyi %5 süt ile 1 X PBS içinde seyreltilmiş ve plakaları RT için 1 h., kuluçkaya bloğu
- Biotinylated anti-grip nükleoprotein (NP) birincil antikor eklemek 100 µL seyreltilmiş 1:2,000 PBS/1% sığır serum albumin (BSA) x 1 ve kaplamalar, RT, 1 h için kuluçkaya
Not: influenza B virüs için bir grip B virüs özel anti-NP antikor kullanılmalıdır. - 1 x PBS ile plakalar üç kez yıkayın.
- Streptavidin-at turp peroksidaz (HRP) eşlenik antikor eklemek 100 µL 1:3,000 1 PBS/1% BSA x seyreltilmiş ve plakaları RT için 1 h., kuluçkaya
- 1 x PBS 200 µL pilakalar üç kez yıkayın.
- 100 µL/kuyuda HRP Substratı reaktif ekleyin ve dik, karanlıkta kuluçkaya
Not: Kuluçka süresi (aşağıda) asidik durdurma arabellek toplamadan önce optimize edilmelidir. Genel olarak, 15-30 dakika yeterlidir. - Gidermek 50 µL/kuyu ile reaksiyon 5 M HCL.
Dikkat: 5M HCl gözler, deride ve müköz membranlarda hasara neden olabilir son derece korozif bir reaktif olduğunu. Bu reaktif eklenmesi uygun kişisel koruyucu ekipman ile Bacalı bir örtünün altında yapılmalı. - Plakaları, 492 okuma nm ve arka plan (kandan hücreleri) kuyu çıkarma.
- Yüzde inhibisyon aşağıdaki formülle hesaplama:
- bir antikor nötralizasyon etkinlik (ve HI hareket yok), 2.2 tutamaçlarından varsa.
Not: vitro nötralizasyon aktivite eksikliği antikorlar HI aktivite eksikliği.
- 2 x 10 4 hücreleri/iyi bir doku kültürü'yoğunluğu plaka Madin Darby köpek böbrek (MDCK) hücreleri 96-şey plaka tedavi ve 37 ° C ve % 5 CO 2 17-19 saat için kuluçkaya .
2. Kaçış Mutant versiyonlarının üretimi
Not: nötralize antikorlar veya HI aktivite eksikliği daha da aşağıda açıklanan belirli iletişim kuralları ile analiz.
- Protokolü 1: HI-pozitif/nötralizasyon pozitif antikorlar ( şekil 3A )
- hazırlamak bir virüs hisse senedi 10 adet/mililitre (PFU/mL) 1 x PBS içinde şekillendirme 6 plak 400 µL cilt.
- Hazırlamak antikor konsantrasyonları artan ilgi, dört dilutions (örneğin, 0, 0.5, 0,05 ve 0.005 mg/mL), 1 x PBS seyreltme başına 100 µL hacmine.
Not: Wild-tipi virüs her zaman paralel ve antikor yokluğunda passaged. Pasajlı bu virüsler dizisi kültür koşulları hücre ve mutasyonlar kaçış adaptasyon arasında ayrım yardımcı olacak. - Mix 100 µL 10 6 virüs her antikor seyreltme 100 µL veya 1 x PBS 100 µL PFU/mL.
- Incubate 37 ° C kuluçka (ile % 5 CO 2) 1 h için. Girdap kısaca. Her karışımı 200 µL özel-patojen ücretsiz (SPF) embryonated tavuk yumurta enjekte.
- 37 ° C'de (CO 2) olmadan 40-44 h. için yumurtaları kuluçkaya
- En az 6 h 4 ° C'de kuluçka tarafından virüs bulaşmış-embryonated yumurta kurban
- Yukarıda açıklanan 24 , 25 olarak yumurtadan, sıvı allantoic hasat.
- 24 , 26 açıklandığı gibi hemaglütinasyon tahlil gerçekleştirin. Tüm allantoic sıvı preparatları hemaglütinasyon titreleri varsa 2 0.005 mg/mL 0.00005 mg/mL aralığında değişen antikor dilutions ile yineleyin.
Not: Mevcut tüm virüs parçacıkları bir HI-pozitif antikor doyurarak bir konsantrasyon nötralize. Bu nedenle, antikor passaging içinde mevcut miktarını azaltmak gerekli olabilir. - Onaylamak HI gerçekleştirerek kaçış türevleri tahlil 24 (Adım 1.1).
Not: HI-aktif antikor HA nişan hedef hücrelerde sialik asit motifleri engelleyin. Bu nedenle, bir virüs onun soydaş antikor huzurunda RBCs (RBC Pelet varlığı) agglutinate yeteneğini kaybeder. Teorik olarak, HI-aktif antikor türevleri kaçış hala sialik asit motifleri bile onun soydaş antikor huzurunda bağlayabilirsiniz ve böylece RBCs (RBC pelet) agglutinate. Faiz antikor HI hala tespit ise, adım 2.1.2 antikor daha yüksek bir başlangıç konsantrasyonu ile kuralından yineleyin.
- Protokolü 2: HI-negatif/nötralizasyon-pozitif antikorlar ( şekil 3B )
Not: HI eksikliği antikorları nötralize karşı kaçış türevlerini oluşturmak için etkinlik, virüsü antikoru miktarda artan huzurunda passaged gerekir.- 1 x 10 6 yoğunluğu bir 6-şey plaka plaka MDCK hücrelerde hücre/iyi ve en az 4 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) kuluçkaya.
- 10 virüs stok seyreltik 6 PFU/mL veya 1 önceki geçiş virüs x 500 µL birimindeki TPCK tedavi tripsin (1 µg/mL) ile MEM.
- Antikor (0,02 mg/mL orijinal geçiş için veya tüm aşağıdaki pasajlar için daha yüksek) 1 tek bir seyreltme hazırlamak MEM TPCK tedavi tripsin 250 µL birimindeki ile x.
- Mix 250 µL seyreltilmiş antikor (+ antikor) 250 µL ile seyreltilmiş virüs veya 1 250 µL MEM (antikor kontrol) x.
- Virüs-antikor karışımı bir 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) 30 dk için kuluçkaya.
- Bir cam Pasteur kullanarak ortamın pipet ve hücreleri monolayer 1 mL 1 X PBS ile yıkayın Aspire edin.
- Karışımlar kuyu içine 500 µL ekleyip bir 37 ° C kuluçka (ile % 5 CO 2) 1 h. için kuluçkaya
- 1 saat sonra 1 2 mL Wells'le ek MEM TPCK tedavi tripsin (1 µg/mL) ile x.
- , Cytopathic etkisi (CPE) mikroskop işaretleri için 48 saat sonrası enfeksiyon hücreleri denetleyin veya viral büyüme 26 algılamaya hemaglütinasyon tahlil gerçekleştirmek.
- Antikor ile desteklenmiş kültürlerde brüt CPE ise, birden fazla cryo-tüpler, etiket süpernatant hasat-80 mağazasında ve geçiş numarası ile ° C.
- Kaydetmek 100 µL MDCKs taze bir monolayer 2 mL 1 x ile enfekte süpernatant ile MEM TPCK-tripsin ve antikor ile desteklenmiştir. Her geçiş için bir antikor kontrol eklemeyi unutmayın.
Not: antikor konsantrasyonu (her iki gün) sonraki pasajda iki kat (veya takdirine bağlı olarak araştırmacının) artırın. - Virüs büyüme hala bile 0.6 mg/mL antikor son bir konsantrasyon ile uygun olana birbirini izleyen her pasajda antikor konsantrasyonu artırmak. Birden çok şişeleri süpernatant her bir geçiş ve mağaza-80 donma ° C.
Not: Antikor kontrol virüs diğerine bir geçiş büyüme doğrulama önemlidir. Hiçbir antikor denetimindeki brüt CPE ama hiçbir CPE ise + antikor grup, bu antikor konsantrasyonu çok yüksek ve hiçbir kaçış türevleri oluşturulan gösterir. Varsa CPE hiç antikor denetiminde brüt ama sadece CPE içinde orta + antikor grup, bu olası kaçış türevleri varlığını gösterir. Sonraki pasajda süpernatant ile 200 µL geçit birime artırmak ve kaçış türevleri oluşturma olasılığını artırmak için antikor konsantrasyonu korumak.
3. Yalıtım arınma kaçış türevleri ile plak
- 1 x 10 6 yoğunluğu bir 6-şey plaka plaka MDCK hücrelerde hücre/iyi ve en az 4 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) kuluçkaya.
- Seyreltik antikorlar 1 x 300 µg/mL 250 µL ve mix hacmine karşılık gelen kaçış mutasyona uğramış virüs 250 µL ile başlayan TPCK tedavi tripsin ile MEM. Antikor yokluğunda pasajlı virüs saf plak olmalıdır.
- Hücreleri medyadan Aspire edin, 1 x PBS ile üç kez yıkayın ve virüs-antikor karışımı (Adım 3.2) tüm 500 µL ekleyin.
- Plakayı 1 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) ileri geri sallamak her 10 min monolayer kurutma önlemek için emin olmak için kuluçkaya.
- Virüs-antikor karışımları Aspire edin ve kuyular antikor (300 µg/mL; adım 3.2) karşılık gelen miktarda içeren kaplama agar medya ile doldurmak.
- 40-44 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) plaka kuluçkaya.
- Görünür plaklar plak malzeme çekme kolaylaştırmak için mavi veya siyah renkli marker ile daire.
- Çekme dört plaklar her kaçış mutasyona uğramış virüs-antikor kombinasyonu gibi MDCK hücreleri veya yumurta antikor yokluğunda pasajlı vahşi tipi virüsler.
- 1 x PBS 100 µL içinde plak resuspend.
- Plak arıtılmış kaçış mutasyona uğramış virüs tüm 100 µL 10 - gün eski SPF embryonated tavuk yumurta enjekte.
- 40-44 h 37 ° C kuluçka (olmadan % 5 CO 2) için yumurta kuluçkaya.
- Virüs (Adım 1.1) varlığını doğrulamak için hemaglütinasyon tahlil gerçekleştirmek.
4. Ayıklama Viral RNA ve analiz, HA sıra değişkenlik
- 200 viral RNA ayıklamak µL kaçış mutasyona uğramış virüs allantoic sıvı fenol ve guanidin isothiocyanate mono-phasic çözeltisi ile.
Dikkat: Fenol ve orta derecede temas ile cildi tahriş öksürük, nefes darlığı neden olabilir bir uçucu sıvı reaktif değil. - Ters transkriptaz kullanımı ile viral RNA HA segmentten yükseltmek ve gene özgü astar grip A HA için segment 27.
Not: Tablo 2'de açıklanan influenza B virüs evrensel astar iki HA yükseltmek (~ 1800 bp) ve NA (~ 1500 bp) 28. - % 1'özel jel RT-PCR ürünü gidermek ve doğru ölçekli bant kesme (~ 1800 bp).
- Jel özü silis-membran dayalı arıtma yordamı kullanarak PCR ürünü ve cDNA sıralama için göndermek.
- Mutasyonlar ayırt tarafından antikor bağlama sözde kaçış varyant üzerinde bulunan ve vahşi-tipi virüs hücre kültür adaptasyon veya immünolojik seçimi nedeniyle pasajlı için gerekli amino asit kalıntı tanımlamak.
- Vahşi türünü içeren PCR ürünü klon veya değişken HA (yazmamalı ve NheI) bir pCAGGs ifade vektör kaçış.
- Antikor kaçış değişken HA için bağlama iki seçenekten birini (veya her ikisini birden) aşağıda açıklanan değerlendirildi.
5. Antikor bağlama analizleri kaçış türevleri
bir yoğunluk 2 x 10 4- ayirt
- plaka 293T hücreleri hücre/iyi bir 96-şey tabak içinde ve (ile % 5 CO 2) 37 ° C kuluçka 24 h için kuluçkaya.
- 0.10 µg/iyi kaçış mutant HA kodlama pCAGGS plazmid hücrelerle transfect, virüs pasajlı HA ve vahşi-türü HA transfection reaktif (kullanımı ile unpassaged).
- 48 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) 96-şey tabakları kuluçkaya.
- Düzeltme ile 100 µL % 0.5 paraformaldehyde 15dk RT., için
Dikkat: Paraformaldehyde bir uçucu sıvı reaktif ve orta derecede temas ile cildi tahriş öksürük, nefes darlığı neden olabilir olduğunu. Olası bir insan kanserojen belirlenmiştir. Ayrıca reaktif Bacalı kimyasal mahallede yapılmalıdır. - Yıkama ile PBS 1 x üç kez. Blok 1 x PBS için 1 h dik olarak sütte % 5 ile
- 1 x PBS ile üç kez yıkayın. 5 µg/mL antikor RT. 1 h için ilgi ile kuluçkaya
- Incubate 1:2,000 1 PBS/1% BSA için karanlıkta RT, 1 h x seyreltme, ikincil antikoru (Anti-insan ya da anti-fare Alexa 488) 100 µL ile.
- 1 x PBS ile üç kez yıkayın. Pozitif veya negatif boyama için floresan mikroskop hücrelerdeyse gözlemlemek.
- Floresan aktif hücre sıralama (FACS)
- 2 x 10 5 yoğunluğu plaka 293T hücreleri hücre/6-şey tabak içinde iyi ve 37 ° C'de (%5 CO 2 ile) 24 h için kuluçkaya
- 0.50 µg/iyi hücrelerle kaçış mutant HA kodlama pCAGGS Plasmid'ler ile transfect, sadece virüs HA ve vahşi-türü HA transfection reaktif kullanımı ile pasajlı.
- 6-şey plakalar (ile % 5 CO 2) 37 ° C'de 48 h için kuluçkaya.
- 48 saat sonra büyüme medya Aspire edin ve 1 x PBS ile iki kez hafifçe yıkamak (monolayer bozulmamış olduğundan emin yapma).
- Hasat FACS arabelleği (1 PBS/2% fetal buzağı serum x) 500 µL transfected 293T hücrelerle.
Not: FACS arabellek kullanmadan önce 4 ºC, önceden soğutulmuş olmalıdır. - Hasat 293T hücreleri 300 x g 5 min için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- FACS arabellek Aspire edin ve mAbs ilgi (1-5 µg/mL son konsantrasyonu) içeren FACS arabellek 200 µL ile resuspend. RT 20 dk. için kuluçkaya
- Santrifüj kapasitesi 300 x g FACS arabellek 4 ° c yıkama iki kez ile 500 µL 5 min için de hücreleri. Dikkatli bir cam Pelet rahatsız olarak Pasteur pipet ile Aspire. Alexa 488 (1:1, 000 son seyreltme) Birleşik ikincil antikor içeren FACS arabelleği 200 µL ile
- resuspend. 20 dakika süreyle 4 ° C'de karanlıkta kuluçkaya
- Hücreleri FACS arabellek 4 ° c yıkama iki kez ile 500 µL 5 min için 300 gr, santrifüj kapasitesi ve dikkatle yıkama arabellek Aspire edin.
- FACS arabellek 500 µL içinde resuspend ve bağlama mAbs ve/veya poliklonal değerlendirmek sera hücrelere transfected HA FACS tarafından ile.
Not: bir untransfected örnek yanı sıra mAb/poliklonal sera kontrolümü denemeye dahil unutmayın.
Representative Results
Biz daha önce kaçış türevleri için insan ve fare mAbs mevsimsel grip virüsü aşısı, H7N9 aşı veya sıralı DNA/rekombinant HA protein aşı4,5 tarafından indüklenen oluşturmak için bu yöntemi varyasyonları kullandık ,6,7. Yukarıda açıklandığı gibi antikorlar ilk bize sonraki4,5ile devam etmek için belirli hangi protokolü hakkında bilgilendirmek için HI ve microneutralization deneyleri kullanarak karakterize. Antikorlar 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 ve 07-4D 05 HI ve nötralizasyon kuş H7N9 virüs (A/Shanghai/1/2013) (Tablo 1) karşı olan bulunmuştur ve böylece Protokolü 1 (Adım 2.1) kullanılmıştır. MAbs etkisiz hale güvenmiyorlarsa 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 ve S6-B01 (Tablo 1), gibi HI aktivite ile Protokolü 2 (Adım 2.2) kaçış türevlerini oluşturmak için kullanılmıştır. Kaçış mutant eşleme antikorlar birçoğu viral HA4,5 (şekil 4) farklı yerlerde kritik artıkları tanımak ortaya koydu. Var HI-pozitif antikorlar çoğunluğu kaçış iken, H7 HA daha önce raporlanmış antijenik sitelere yakın mutant artıkları, HI-negatif antikorlar sapı bölge4' te,5 kaçış mutantların nokta mutasyonları ile oluşturulan .
| Antikor | Merhaba etkinliği | NEUT aktivite |
| 07-5D 03 | + | + |
| 07-5F01 | + | + |
| 07-5G 01 | + | + |
| 07-4B03 | + | + |
| 07-4E02 | + | + |
| 07-4D 05 | + | + |
| 41-5E04 | - | + |
| 045-051310-2B06 | - | + |
| 042-100809-2F04 | - | + |
| S6-B01 | - | + |
Tablo 1: Antikor HI ve nötralizasyon etkinlik tablosunun. On H7 özel mAbs ile deneysel bir H7N9 aşı aşı bireyler izole farklı vitro antiviral faaliyetleri5sergi.
| İleri astar (5'-3') | Astar (5'-3') ters | Thermocylcer koşulları | ||||||||
| IAV | TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG | ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | 60 dk 42 ºC, 94 ° C'nin 2 dk/5 döngüsü için 20 94 ° C'nin s, 30 50 ºC s ve 3 dk 30 sn için 68 ° C'nin 40 devredir 20 94 ºC takiben s, 30 58 ° C'nin s ve 3 dk 30 sn ile 68 ºC 10 min için bir son uzantısı saat için 68 ºC | |||||||
| IBV | GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC | CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC | 60 dk, 30 dk 55 ºC, 94 ° C'nin 2 dk/5 döngüsü için 20 94 ° C'nin 45 ºC s, 30 40 ºC 40 devredir 20 94 ºC tarafından takip için 3 dk 30 sn, 68 ºC ve s s , 30 58 ° C'nin s ve 3 dk 30 sn ile 68 ºC 10 min için bir son uzantısı saat için 68 ºC | |||||||
Tablo 2: evrensel grip virüsü astar. Grip A27 ve B28 virüsleri ve onların anılan sıraya göre thermocycler koşulları astar çift HA kesimleri amplifikasyon için.
Şekil 1: HI tahlil. (A) A şematik bir HI tahlil kurmak iki fare H1 özgü mAbs 7B2 (kafa özgü) ve 6F12 (SAP-özel bir 96-şey V-alt plaka ve (B) bir HI tahlil23sonuçlarını örneği kullanarak) etkinliğini test etmek için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Microneutralization tahlil. İki insan mAbs 4 d 055 ve CR911417etkinliğini test etmek bir microneutralization tahlil ayarlamak için bir şema. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: üretimi kaçış mutantların. Önerilen metodoloji HI ve antikor tarafından sergilenen microneutralization aktivite bağımlı olacaktır. (B) nötralize HI-negatif antikor antikor miktarlarda artan ile birden çok pasajlar içerebilir(a)karşı kaçış mutantların üretimi nötralize HI-pozitif antikorlar yumurta, tek bir pasajda gerektirir hücre doku kültürü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: bir epitope Haritası roman kuş H7N9 kaçış mutant türevleri ile oluşturulan HA örneği. Aşı indüklenen antikorlar H7N9 grip aşı kaçış mutant varyantlarını oluşturmak için kullanılan bir aday ile aşı bireyler izole. Her kalıntı kırmızı temsil kritik amino asitler bir mAb verimli bağlama için gerekli konumunu belirtti. Veri Dunand-Henry ve ark., 20154adapte edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Kaçış mutantların tespit artıkları çoğunluğu doğru olmasına rağmen bu yaklaşım önemli uyarılar nokta mutasyonlar kaçış versiyonlarının mutlaka moleküler ayak izi tarafından belirlenen antikor içinde eşleşmeyebilir ki biridir yapısal analiz. Bu konformasyon değişikliğine mutasyona uğramış kalıntı, allosteric efekti benzer konuma distal yeteneğini bir mutasyon belirli bir kalıntı, kaynaklanmaktadır. Bu yöntem yalnızca antikorları nötralize için uygulanabilir olduğunu başka bir kısıtlamadır; vitro seçici basınç eksikliği antikorlar mutantlar kaçmak için yol değil. Ancak, bu sınırlama bir panel tarafından daha önce karakterize nötralize antikorlar oluşturulan kaçış versiyonlarının kullanımı ile aşılabilir. Tan vd. H7N9 virüsü nötralize mAb bir kaçış türevi bir sigara nötralize antikor7epitope eşleştirmek için kullanılır.
Yine de, kaçış türevleri üretimi aracılığıyla antikorlar epitopları elucidating kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu, ikisi de ekipman geniş bir yatırım gerektiren bir alternatif sağlar. Alanin tarama veya peptid tarama/kesme mutantlar kullanarak mAbs en az bağlama bölgesinin belirlemek için diğer alternatifleri vardır. Mutagenesis tarama alanin peptid tarama doğrusal epitopları30ile sınırlı ise29, eleme sırasında çok sayıda değişik oluşturma çalışmalarında önemli miktarda gerektirebilir. Bu protokol için açıklanan yöntem hiçbir özel ekipman veya tekniği gerektirir ve hatta kaçış değişik-in ilgi antikorlar oluşturmak için değişikliğin varolan vitro nötralizasyon deneyleri kullanır.
İletişim kuralı için birden çok pasajlar (örneğin, SAP özel antikorlar) gerektiren üreten kaçış değişik yüksek antikor pasajda 0 başlangıç konsantrasyonu bağlıdır. Dikkatli yan tarafındaki err ve yarım günlük yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu bir antikor düşük bir günlüğüne başında ve güçlü virüs büyümesi için izin vermek iyidir. Araştırmacı yüksek titresi virüs kültür düşük immünolojik basıncı varlığında viral topluluk içinde büyük bir genetik varyasyon olacak spekülasyon olabilir. Kaçış türevleri için aşağıdaki pasajlar antikor konsantrasyon yavaş yavaş artırarak seçilebilir. Önceki geçiş antikor konsantrasyon aynı miktarda koruyarak virüs büyüme azaltır olay bu viral süpernatant miktarı sonraki pasajda artırılabilir.
Evrensel grip aşıları çoğunluğu HA sapı bölgenin doğru sağlam antikor yanıtı temin için amaçtır. SAP özel antikorlar için kaçış versiyonlarının grip virüsü fitness ve immünolojik basıncı arasındaki ilişki tanımlamada önemli analizlerdir. İlginçtir, kaçış mutasyona uğramış virüs sapı özgü mAbs kaynaklanan tüm zayıflatılmış vivo içinde fare LD50 çalışmaları4' te edildi. Bu çalışmalar güçlü bir durumda aşı sapı tabanlı platformlar için sağlar. Ayrıca, bu protokol küçük molekül inhibitörleri gibi anti-yayılmacı diğer bileşikler için kaçış mutantların tanımlamak için kullanılabilir. Son olarak, bu metodoloji grip virüsü yüzey glikoproteinlerin için sınırlı değil, ama aynı zamanda daha çok diğer viral glikoproteinlerin epitopları belirlemek için uygulanabilir.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Bu proje kısmen Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları gelen federal fonları ile finanse edilmiştir, Ulusal Sağlık enstitüleri, bölümü sağlık ve insan Hizmetleri, CEIRS altında HHSN272201400008C (F.K.) sözleşme; NIH U19AI109946-01 (F.K.); ve P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
References
- Shaw, M. L., Palese, P. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).
- Nelson, M. I., Holmes, E. C.
- Lauring, A. S., Andino, R. Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses. PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).
- Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains. J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).
- Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., Lee, P. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Tan, G. S., Leon, P. E., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).
- Smith, K., Garman, L., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Steel, J., Lowen, A. C., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Wang, T. T., Tan, G. S., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).
- Impagliazzo, A., Milder, F., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).
- Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses. Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).
- Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate. mBio. 7 (2), e00257 (2016).
- Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).
- Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies. Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).
- Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin. Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).
- Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants. J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).
- Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Geneva: World Health Organization. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J Vis Exp. (97), e52421 (2015).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J Vis Exp. (42), e2057 (2010).
- Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).
- Zhou, B., Lin, X., et al. Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics. J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).
- Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. Exploring and designing protein function with restricted diversity. Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).
- Chen, C. -W., Chang, C. -Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J Vis Exp. (121), e55417 (2017).
