Summary
우리 유전자 교란 구 mutans 의 생성에 대 한 손쉬운, 신속한, 그리고 상대적으로 저렴 한 방법 설명 변종; 이 기술은 다양 한 종의 유전자 교란 종자의 생성에 대 한 적용할 수 있습니다.
Abstract
특정 유전자의 기능 설명에 대 한 일반적인 방법을 야생-타입 스트레인 및 관심사의 유전자 교란 되었습니다 했다 긴장의 비교 phenotypic 분석을 포함 한다. 유전자 장애 DNA 구조 적당 한 항생제 내성 표시 유전자를 포함 하는 박테리아의 변종 유전자 교란의 세대에 대 한 유용 합니다. 그러나, 전통적인 건축 방법, 유전자 복제 단계를 필요로 하는 복잡 하 고 시간이 걸리는 프로토콜을 포함 한다. 여기, 타겟된 유전자 장애 mutans 연쇄 상 구 균에 에서 대 한 상대적으로 손쉬운, 빠르고 비용 효율적인 방법을 설명 합니다. 메서드는 2 단계 융합 연쇄 반응 (PCR) 중단 구조 및 유전자 변환 위한 electroporation 생성 하 이용 한다. 이 메서드는 효소 반응, PCR, 이외의 필요 하지 않습니다 그리고 또한 중단 구성의 디자인 측면에서 더 큰 유연성을 제공 합니다. 고용 electroporation의 유능한 세포 준비를 용이 하 게 하 고 변환 효율을 향상 시킵니다. 현재 메서드는 다양 한 종의 유전자 교란 종자의 생성에 대 한 적응 수 있습니다.
Introduction
유전자 기능 분석은 일반적으로 야생-타입 긴장과 긴장에 관심사의 특정 유전자 중단 되었습니다 phenotypic 비교를 포함 한다. 이 유전자-중단 기술은 다양 한 포유 동물에 박테리아에서 taxa에에서 유전자 기능 분석에 대 한 활용 되었습니다. 유전자 장애 개념은 유전자 교란 스트레인;의 생성에 필요한 이 deoxyribonucleic 산 (DNA) 구문 업스트림 및 다운스트림 영역 대상 유전자의 측면에 융합 항생제 내성 표시 유전자의 구성 되어 있으며 동종 재결합을 통해 게놈으로 통합 됩니다. 유전자 교란 스트레인 항생제를 포함 하는 선택적 미디어를 사용 하 여 격리 될 수 있습니다. 유전자 교란 스트레인의 건설에 사용 되는 기존의 방법 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR), 적당 한 플라스 미드, 제한 된 소화에 유전자의 결 찰에 의해 대상 유전자의 증폭 등의 복잡 한 단계 필요 효소, 그리고 항생제-저항 마커 유전자 삽입을 religation. 이 과정은 시간이 많이 걸리는, 각 단계의 성공에 따라 몇 주 몇 일 복용. 또한, 장애 구문 디자인 대상 유전자의 금지 효소 사이트에 따라 달라 집니다. 이러한 문제를 해결 하려면 DNA PCR 기반 접합 방법1,2 Dictyostelium discoideum3 , Synechocystis sp. PCC68034 의 돌연변이 유전자 교란의 디자인에 대 한 보고 되었습니다. 현재 연구에서 메서드는 상대적으로 손쉬운, 신속 하 고 저렴 한 방식으로, 파괴의 건설에 대 한 수정 된 PCR 기반 방법 (지정 2 단계 융합 PCR)을 이용 하 여 유전자 교란 연쇄 구 균 긴장을 생성 하 개발 되었다 구문 및 electroporation 유전자 변환에 대 한입니다.
PCR는 적절 하 게 genomic DNA, PCR 템플릿으로 항생제 내성 표시 유전자 및 4 쌍의 필요 2 단계 융합 oligonucleotide 뇌관 설계 되었습니다. 첫 번째 단계 (1세인트 PCR), 1 kb 업스트림 측면에 서 지역 1 kb 다운스트림 측면에 서 지역 대상의 대상 유전자의 유전자, 그리고 항생제-저항 마커 유전자 PCR에 의해 증폭 됩니다. 역방향 뇌관 및 증폭의 상류와 하류에 대 한 앞으로 뇌관의 5' 지역 지역, 각각, 측면 15 기지 마커 유전자의 끝에 보완을 포함 됩니다. 5' 영역 마커 유전자 증폭에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 비슷하게 포함 15 기초 대상 유전자의 상류 측면에 서 영역의 아래쪽 끝 고 대상 유전자의 하류 측면에 서 영역의 위쪽 끝을 보완 각각. 따라서, 3 개의 증폭 된 파편 퓨전 사이트에서 겹치는 30-기본적인 쌍 지역 포함. 두 번째 단계 (2차 PCR), 1세인트 PCR 템플릿으로 의해 증폭 3 조각을 사용 하 여 중첩된 한 PCR 뇌관으로 PCR 수행 됩니다. 서식 파일의 상호 보완적인 영역 또한 2차 PCR을 통해 서로 연결 됩니다. 마지막으로, 동종 재결합에 대 한 구문 electroporation 야생-타입 스트레인에 소개 된다. 성공적인 유전자 장애 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 확인 될 수 있습니다. 중단 구조는 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 증폭, 비록 추가 효소 반응, DNA 결 찰 등 DNA 소화, 구조를 생성 하기 위해 필요 하지 않습니다. 또한, 게놈에 삭제 또는 보존 지역 뇌관 디자인에 따라 유연 하 게 선택할 수 있습니다.
현재 작업에서 glucosyltransferase mutans 연쇄 상 구 균에에서 인코딩하는 gtfC 유전자의 전체 코딩 영역의 삭제 연쇄 구 균 종에서 신속 하 고 쉽게 유전자 장애 메서드를 보여 주기 위해 수행 되었다. 또한, gtfB-방해 스트레인 같은 방식으로 생성 된. GtfC 와 gtfB 에 의해 glucosyltransferases cariogenic 치과 biofilm 개발5,6에 기여 한다. 야생-타입의 biofilm 형성 능력 스트레인 (S. mutans WT), gtfC-스트레인 (S. mutans ΔgtfC), 및 gtfB중단-방해 스트레인 (S. mutans ΔgtfB) 평가 했다 대 한 비교 phenotypic 분석. 이 프로토콜 추가 종 유전자 장애에 대 한 2 단계 방법의 응용 프로그램을 확장 하 고 taxa의 넓은 범위에서 유전자 기능 연구에 대 한 수정할 수 있습니다.
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Protocol
1. 뇌관 디자인
- 뇌관 2 단계 융합 PCR 및 유전자 장애의 확인에 대 한 준비.
주: 표 1이 프로토콜에 사용 되는 뇌관 시퀀스를 보여 줍니다. 그림 1 S. mutans Δ gtfC를 생성 하는 데 사용 하는 2 단계 융합 PCR 방법의 개요 그림을 보여준다. - 디자인 뇌관 spectinomycin 저항 유전자 (spc r) 7 게놈에 대상 영역의 교체에 대 한
- . 이 프로토콜 spc r gtfC 유전자의 코딩 지역 전체 바꿉니다.
- 5에서 15 기지 spc r의 위쪽과 아래쪽 끝에 보완을 포함 ' 최대 역의 지역 및 다운-앞으로 뇌관, 각각. 마찬가지로, 5에서 15 베이스 gtfC의 업스트림 측면에 서 영역의 아래쪽 끝 및 gtfC의 다운스트림 측면에 서 영역의 위쪽 끝에 보완을 포함 ' spc r의 지역-앞으로 및 spc r -반전 뇌관, 각각 ( 그림 1A).
참고: 시퀀스의 최대 반전, 아래-앞으로, spc r-앞으로, 및 spc r-반전 뇌관 중단 구성의 사이트에 따라 자동으로 결정 됩니다. - 구성에 최대-앞으로 및 다운 반전 뇌관 디자인 > 1 kb 업스트림 및 다운스트림 측면 gtfC 유전자의 지역 각각. 최대-앞으로의 녹는 온도 (T m)을 설정 하 고 다운-반전 뇌관 최대 반전 및 다운-앞으로 뇌관의 녹는 온도 따라 각각 ( 그림 1A).
참고: T m을 결정 하는 다음 수식에 참조: T m (° C) 2 = (* 나 + * NT) + 4 (* 노스캐롤라이나 + * NG)-5, 어디 * N (A, T, C, 또는 G) 지정 된 id 가진 뇌관 뉴클레오티드의 수를 나타냅니다. - 디자인 2 차 PCR ( 그림 1B)에 대 한 중첩 된 뇌관 (N_up-앞으로 및 N_up 역).
참고: 바깥쪽 뇌관 쌍 (최대-앞으로 및 역방향 다운) 2 차 PCR 뇌관으로 사용 될 수 있습니다, 있지만 중첩 된 뇌관 (N_up-앞으로 및 N_up 역)이이 프로토콜에 설계 되었습니다. 중첩 된 뇌관은 자주 필요 2 차 PCR, 대표 결과에 설명된대로. - 디자인 뇌관 spc r에 대 한 특정. GtfC 장애에 대 한 화면으로 식민지 PCR에 사용 되는 뇌관.
- GtfC의 확인에 대 한 디자인 뇌관 중단.
참고: 이러한 뇌관을 사용 하 여 증폭 PCR 제품 gtfC 또는 spc r 상류 또는 하류 측면 gtfC의 지역 사이 국경에 걸쳐져. 뇌관 세트 ' gtfC 최대-앞으로 및 gtfC 최대 역 '와 ' gtfC 다운-앞으로 및 gtfC 다운 역 ' gtfC에 대 한 특정 및 ' gtfC 최대-앞으로 및 spc r 2 -역 '와 ' spc r 2-앞으로 및 gtfC 다운 역 ' spc r에 대 한 특정 있다.
2. S. mutans에서 게놈 DNA 추출
- 행진 주식 S. 뮤턴트의 UA159 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 한 접시에. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 접시를 품 어.
- 소독된 이쑤시개를 사용 하 여 단일 식민지를 데리 고 BHI 국물의 5 mL에 접종. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 S. 뮤턴트의 문화를 품 어.
- 2000 × g.에서 15 분 동안 원심 분리기 세균성 세포 배양의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 mL에 셀 펠 릿 Resuspend.
- 2000 × g.에서 15 분 동안 원심 분리기 PBS의 200 µ L에서 셀 펠 릿 Resuspend.
- 제조업체에서 제공 하는 지침에 따라 비드 박동 베이스 게놈 DNA 추출 키트를 사용 하 여 정지에서 게놈 DNA를 추출.
유리 구슬 (키트에 포함)를 포함 하는
- 전송 현 탁 액 2.0 mL 샘플 튜브. 세포 현 탁 액을 세포 솔루션 (키트에 포함)의 750 µ L을 추가.
- 단단히 뚜껑과 구슬 박동 장애 기구의 튜브 홀더에 대칭으로 튜브를 놓습니다. 5 분에 대 한 최대 속도에서 프로세스입니다. 10000 × g.에 1 분 동안 구슬 구타 원심 분리기 샘플 2.0 mL 컬렉션 튜브 및 7000 × g .에서 1 분 동안 원심 분리기에서 회전 필터 (키트에 포함)에 상쾌한 전송
- 추가 1200 µ L의 DNA 바인딩 버퍼 (키트에 포함)는 여과 액입니다. 10000 × g.에 1 분 동안 원심 분리기를 2.0 mL 컬렉션 튜브 (키트에 포함) 스핀 열에 혼합물의 800 µ L를 전송
- 흐름을 통해 삭제 열 매트릭스를 세척 하 고 10000 × g. 흐름 통해 삭제에서 1 분 동안 원심, 스핀에 500 µ L 워시 버퍼 (키트에 포함)의 추가 스핀 열 미리 세척 버퍼 (키트에 포함)의 200 µ L을 추가 열 열 매트릭스를 세척 하 고 10000 × g.에 1 분 동안 원심을
- 스핀 열 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 놓고 열 매트릭스를 100 µ L 차입 버퍼 (키트에 포함)의 추가.
- 30 대 분리기 elute 게놈 DNA를 10000 × g에서 s. 260에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 농도 및 순도 추정 nm 및 280 nmusing 분 광 광도 계는 A 260 /A 280 비율이 1.8 보다 크면 확인 하십시오.
3. PCR 증폭
- 수행 1 세인트 PCR PCR 템플릿 (표 1 참조)으로 미 뮤턴트의 WT 게놈 및 합성 spc r 유전자를 사용 하 여. GtfC 유전자의 측면에 서 상류 지역, gtfC 유전자와 뇌관 당로 ( 그림 1A), 위에서 설명한의 3 세트를 사용 하 여 spc r 유전자의 측면에 서 하류 지역 증폭 표 2 및 표 3.
참고: PCR 뇌관, 시 약, 및 증폭 사이클에서 요약 된다 표 1, 표 2 및 표 3, 각각. - 1 %agarose 젤에 PCR 제품 각 충분치 고 젤 밴드 커터를 사용 하 여 해당 밴드 소비 세.
- 스핀 열 및 실리 카 멤브레인 기반 젤 추출 키트를 사용 하 여 젤에서 각 증폭된 DNA 제품을 정화.
- 전송 깨끗 한 microcentrifuge에 젤 조각 튜브와 500 µ L 바인딩 버퍼 (키트에 포함)와 혼합. 젤 조각 완전히 해산 될 때까지 15 분 동안 55 ° C에 혼합물을 품 어.
- (키트에 포함) 스핀 열 컬렉션 튜브 (키트에 포함)로, 스핀 열에 샘플 로드 놓고 30 원심 11000 × g에서 s. 통해 흐름, 워시 버퍼 (키트에 포함)의 600 µ L를 실리 카 막 씻어 30 원심 회전 열 추가 11000 × g에서 s.
- 흐름을 통해 및 실리 카 막 건조 11000 × g에서 2 분 동안 원심 분리기 삭제.
- 스핀 열 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브로, 50 µ L을 추가 차입 버퍼 (키트에 포함), 2 분에 대 한 실 온에서 품 어와
- 11000에서 2 분 동안 원심 분리기 × g elute 증폭 된 DNA를. 260에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 농도 및 순도 추정 nm 및 280 nmusing 분 광 광도 계는 A 260 /A 280 비율이 1.8 보다 크면 확인 하십시오.
- 수행 2 nd 2 단계 융합 표 2에 의하여 PCR 템플릿으로 세 약 아데닌 파편을 사용 하 여 PCR PCR < /st룽 > 및 표 3.
참고: 이러한 증폭 된 조각과 중첩 된 뇌관을 사용 하 여 접합 ' N_up-N_down-리버스와 ' 또는 바깥쪽 뇌관 ' 최대-앞으로 및 역방향 다운 ' ( 그림 1B). PCR 뇌관, 시 약, 및 증폭 주기 각각 표 1, 표 2 및 표 3에 요약 됩니다. - 0.8 %agarose 젤에 PCR 반응 혼합물 (5 µ L)의 1/10을 로드 하 고 적절 한 amplicon ( 그림 1C)의 생성을 확인 하려면 예상된 밴드 크기와 증폭된 밴드 크기 비교.
- 정화 없이 에탄올 강 수에 의해 나머지 최종 PCR 제품 집중.
- 추가 55 µ L의 울트라 순수 물 100 µL.Add에 총 볼륨을 조정 하려면 남은 PCR 혼합물에 3m 나트륨 아세테이트 (10 µ L), pH 5.2, 뒤에 100% 에탄올 (250 µ L)의 2.5 볼륨의 1/10 볼륨. 혼합 하 고 30 분-80에 대 한 동결 ° c.
- 4 ° C에서 15000 × g에서 20 분 동안 원심 분리기 튜브의 하단에 펠 릿에 대 한 확인 하 고 삭제는 상쾌한. 70% 에탄올, 4 ° C에서 15000 × g에서 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL와 펠 릿을 세척 하 고는 상쾌한 삭제. 약 30 분 동안 펠 릿 건조 및 매우 순수한 물 10 µ L로 분해.
4. 유능한 세포 준비 및 셀 변환
- 행진 주식 S. 뮤턴트의 UA159 BHI 한 천 격판덮개에. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 접시를 품 어.
- 소독된 이쑤시개를 사용 하 여 단일 식민지를 데리 고 BHI 국물의 5 mL에 접종. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 S. 뮤턴트의 문화를 품 어.
- 뮤턴트 S. s 문화 2 mL 50 mL BHI 국물의 전송 및 6-8 h 600에서 광학 밀도를 37 ° C에서 품 어 혐 기성 조건 하에서 0.2-0.4 nm (OD 600).
- 4 ° C에서 2000 × g에서 15 분 동안 세포를 원심, 상쾌한, 폐기 및 40 mL 40 mL 10% 글리세롤의 뒤 차가운 물로 두 번 셀 세척.
참고: 잔여 물질에 영향을 미칠 후속 electroporation. - 발음 파스퇴르 피 펫으로 신중 하 게 상쾌한 10% 글리세롤에 셀 펠 릿의 부착 감소. 신선한 10% 글리세롤의 1 mL에 셀 resuspend, 각 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 정지의 50 µ L를 분배 하 고 사용 직전까지-80 ° C에 저장.
- 믹스 50 µ L 약 수 차가운 유능한 세포의 파괴의 5 µ L로 구성 섹션 3에에서 위에서 설명한. (전극 사이의 0.2 cm 거리)와 큐 벳 electroporation에 혼합물을 추가 합니다. 황색 포도상구균 모드 사용 (1.8 k v, 600 Ω, 10 µ F, 1 펄스)의 electroporate electroporation 기구.
- Electroporation 직후 BHI 국물의 500 µ L에서 세포를 일시 중단 하 고 spectinomycin 포함 된 BHI-한 천 배지를 현 탁 액의 50 µ L을 추가.
참고: 추가 보육 시간 후 electroporation 필요 하지 않습니다. 그러나, electroporation 후 1-2 h에 대 한 보육 변환 효율을 향상 시킬 수 있습니다. - 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 2-6 일 동안 접시를 품 어.
참고: 위에서 설명한 대로 S. mutans Δ gtfB가 생성 됩니다. GtfB 유전자의 전체 코딩 영역이 S. mutans Δ에 리스로 마이 신 저항 유전자 8 대체 gtfB. 각 S. mutans 긴장은 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 BHI 국물에 교양.
5. 유전자 장애 및 스토리지의 확인
- 임의의 식민지를 선택 하 고 식민지 PCR 표 2와 표 3을 수행을 PCR 혼합에 그들을 예방. PCR 뇌관, 시 약, 및 증폭 주기 각각 표 1, 표 2 및 표 3에 요약 됩니다.
- Spc r 것인지 1 %agarose 젤에 PCR 반응 혼합물을 로드-특정 DNA 밴드.
- 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 2 일 동안 소독된 이쑤시개와 spectinomycin 포함 된 BHI의 10 mL에 2 차 배양 세포를 사용 하 여 긍정적인 식민지 국물 선택.
- S. mutans Δ의 생성을 확인 gtfC.
- 세포 현 탁 액을 동등 하 게 분할. 위에서 설명한 세포에서 게놈 DNA를 추출 (2.3 단계. 2.5.5에.). GtfC 장애 표 2와 표 3 (표 1)의 확인에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 PCR 템플릿으로 게놈 dna는 PCR을 수행.
참고: PCR 뇌관, 시 약, 및 증폭 사이클에서 요약 된다 표 1, 표 2 및 표 3, 각각. - 2 %agarose 젤에 PCR 혼합물을 로드 하 고 적절 한 amplicon .의 생성을 확인 하려면 예상된 밴드 크기와 증폭된 밴드 크기 비교
- 4 2000 × g에서 15 분 동안 나머지 세포 현 탁 액을 원심 ° C. PBS의 5 mL에 셀 펠 릿 Resuspend.
- 4 2000 × g에서 15 분 동안 원심 분리기 ° C. Resuspend 셀 포함 하는 25% 글리세롤 BHI 국물 1.5 mL에 작은 고-80 ° 오호-20 ° C에에서 저장
- 세포 현 탁 액을 동등 하 게 분할. 위에서 설명한 세포에서 게놈 DNA를 추출 (2.3 단계. 2.5.5에.). GtfC 장애 표 2와 표 3 (표 1)의 확인에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 PCR 템플릿으로 게놈 dna는 PCR을 수행.
6. Phenotypic 분석
BHI 천 배지에- 행진 각 S. 뮤턴트의 스트레인. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 접시를 품 어.
- 소독된 이쑤시개를 사용 하 여 단일 콜로 니를 선택 하 고 적절 한 항생제 없이 BHI 국물의 2 개 mL에 접종. 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 하룻밤 문화 서 스 펜 션의 20 µ L 유리 시험관에 항생제 없이 1% 또는 5% 자당을 포함 된 BHI 국물의 2 개 mL에 접종, 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 하룻밤 경사 위치에 테스트 튜브 셀 문화.
- 소용돌이 유리 시험관 10 s 및 문화 현 탁 액을 가만히 따르다. 시험관 증류수로 세 번 세척. 0.25 %Coomassie 화려한 튜브 벽에 있는 biofilms 얼룩 (CBB) 블루 하 고 다음 1 분에 대 한 품 어의 1 mL을 추가
- 얼룩 솔루션을 가만히 따르다, 증류수와 세 번 시험관을 세척 하 고 건조 테스트 튜브.
- 색상 밀도 CBB 스테인드-biofilm phenotypic 분석에서 biofilm을 형성 하는 능력을 결정 하는 시각의 확장을 모두 평가.
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Representative Results
그림 2 는 그 1세인트 PCR, 각 제품의 크기, 1 %agarose 젤에 관찰 했다 약 1 kb의 예상된 크기와 좋은 계약에. 그림 3 의 2차 PCR 제품의 젤 전기 이동 법 분석을 보여준다. 그림 4 는 S. mutans 식민지 붕괴 구조와 식민지 PCR 제품의 젤 전기 이동 법 분석 변환. 모든 식민지에서 amplicons 예측된 크기의 이었다. 그림 5 는 gtfC 중단 및 젤 전기 이동 법의 PCR 제품의 확인에 대 한 입문서-바인딩 사이트. GtfC-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 증폭 하 여 얻은 PCR 제품 확인 되었다 S. mutans WT, S. mutans ΔgtfC에 PCR 제품 spcr를 사용 하 여 얻은 반면-특정 뇌관 세트 S. mutans ΔgtfC 에 확인 되었다 그러나 하지 S. mutans WT. 각 S. mutans 긴장의 자당 파생 biofilm 형성 능력 보여준다 그림 6 . S. mutans WT 자당;의 존재에 의해 부착 biofilm 형성 되었다 S. mutans ΔgtfB 의 부착 biofilm 형성 능력 있던 보다 S. mutans WT.의 S. mutans ΔgtfC 전시 자당의 매우 낮은 부착 biofilm 형성.
2 단계 융해 PCR 1:Strategy 그림. S의 도식 적인 그림입니다. mutans ΔgtfC 건설 표시 됩니다. 유전자 길이 규모. (A) 상류와 하류 지역 gtfC 및 spcr 의 측면 loci PCR에 의해 증폭 되었다. 뇌관 바인딩 사이트 서식 파일에는 동일한 패턴으로 표시 됩니다. (B) 두 번째 PCR 단계 중첩 된 뇌관으로 PCR 첫걸음에서 증폭 된 3 조각 (서식 파일)로 사용 하 여 수행 되었다. (C) 붕괴 구조 세균성 긴장에 동종 재결합에 대 한 얻은 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
1세인트 PCR 제품의 그림 2: 대표적인 젤 전기 이동 법. GtfC 의 업스트림 측면에 서 지역 및 gtfC 및 spcr 의 다운스트림 측면에 서 지역의 Amplicons 표시 됩니다. M: 분자 감 적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 2노스다코타 PCR 제품의 대표적인 젤 전기 이동 법. 중첩 된 뇌관으로 증폭 제품 고 바깥쪽 뇌관 표시 됩니다. 단단한 화살표 중단 구축의 예상된 크기를 나타냅니다. M: 분자 감 적입니다.
그림 4: 식민지 PCR (A). 로 gtfC 장애에 대 한 심사 S. mutans 식민지에 spectinomycin 포함 된 BHI 천 배지; 각 동그라미 숫자가 나타냅니다 식민지 id입니다. (B) 대표 젤 전기 이동 법의 식민지 PCR 제품; 각 동그라미 레인 번호 그림 4A에서 해당 식민지 ID를 나타냅니다. M: 분자 마커, WT: 야생-타입 게놈 DNA 템플릿으로 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 확인 PCR에 의해 gtfC 장애의. (A) 뇌관 바인딩 사이트; 유전자 길이 아니다 규모. PCR은 S. mutans 게놈 DNA를 템플릿으로 사용 하 여 수행 되었다. 뇌관 세트: gtfC 최대-앞으로 및 gtfC 최대 역 ( gtfC에 대 한 특정); gtfC 다운-앞으로 및 gtfC 다운-리버스 ( gtfC에 대 한 특정); gtfC 최대-앞으로 및 spcr2-리버스 ( spcr에 대 한 특정); spcr2-앞으로 하 고 gtfC 다운 역 ( spcr에 대 한 특정). (B) 대표 젤 전기 이동 법의 PCR 제품; 각 원된 레인 번호 그림 5A에 해당 뇌관을 나타냅니다. 하나의 전기 이동 이미지 마커 밴드를 분할 된다. M: 분자 감 적 (100 기본적인 쌍 사다리). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: Phenotypic 분석 기반 biofilm 개발. 자당 파생 biofilms 각 S. mutans 긴장에 의해 형성 되었다 Coomassie 화려한 파란 얼룩이 진다. WT: S. mutans WT, ΔgtfB: S. mutans ΔgtfB, ΔgtfC: S. mutans ΔgtfC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 뇌관 쌍 | 시퀀스 (5' 3') | 예상된 밴드 크기 (bp) | |
| gtfC 장애에 대 한 2 단계 PCR | |||
| 1 PCR | |||
| 최대-앞으로 최대 역 |
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA |
1,036 | |
| spcr-앞으로 spcr-리버스 |
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT |
1,188 | |
| 다운-앞으로 다운 역 |
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
1,059 | |
| 2 PCR | |||
| N_up-앞으로 N_down-역 |
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3,132 | |
| GtfC 장애의 확인 | |||
| 식민지 PCR 검사 | |||
| S_spcr-앞으로 S_spcr-리버스 |
GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG | 535 | |
| 최종 확인 | |||
| gtfC 최대-앞으로 gtfC 최대 역 |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG |
498 | |
| gtfC 다운-앞으로 gtfC 다운 역 |
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
557 | |
| gtfC 최대-앞으로 spcr2 역 |
위에서 설명한 CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
641 | |
| spcr2 앞으로 gtfC 다운 역 |
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG 위에서 설명한 |
623 | |
| 시 약 | 재고 솔루션의 농도 | 볼륨 | 최종 농도 |
| Dna 중 합 효소 프리 믹스 | 2 × | 25 Μ | 1 × |
| 앞으로 뇌관 | 5 Μ M | 2 Μ | 0.2 Μ M |
| 반전 뇌관 | 5 Μ M | 2 Μ | 0.2 Μ M |
| 템플릿 DNA | 변수 | 변수 | 변수 * * * * * * |
| 이온된 수 | - | 최대 50 μ | - |
표 2: PCR 시 약. * 1세인트 단계 PCR;에 대 한 100 ng. * * 대 한 2차 PCR; 1세인트 단계 PCR amplicon의 각 30-50 ng. 식민지 PCR; 반응 혼합물을 세균성 세포의 직접적인 추가.
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 수 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 2 분 | 1 |
| 변성 어 닐 링 확장 |
98 ° C 55 ° C 72 ° C |
10 s 5 s Amplicon 종속 (1 분/1 kbp) |
35 |
| 마지막 확장 | 72 ° C | Amplicon 종속 (1 분/1 kbp) |
1 |
표 3: PCR 확대 주기.
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Discussion
현재 프로토콜 1세인트 PCR 뇌관 상류와 하류 측면 게놈에서 대상 영역의 영역 약 1kb를 증폭 설계 되어야 합니다. 이러한 긴 측면에 서 시퀀스는 동종 재결합의 효율성을 개선 하는 데 필요한.
뇌관의 시퀀스 (최대 반전, 아래-앞으로, spcr-앞으로, 및 spcr-리버스)이이 프로토콜에서 자동으로 결정 되었다 중단 구성의 사이트에 따라. 각 뇌관 15 기초 5' 영역에서 2차 PCR 서식 파일의 끝에 보완을 포함 되어 있습니다. 더 이상 바인딩 사이트 중단 건설의 보다 효율적인 생산을 수 있습니다. 각 뇌관의 5' 영역에서 적어도 10 보완 기지의 포함9것이 좋습니다.
중첩 된 뇌관 (N_up-앞으로 및 N_up 역) 바깥쪽 뇌관 (최대-앞으로 및 다운 역) 보다는 2차 PCR, 사용 되었다. 2차 PCR 바깥쪽 뇌관의 사용은 어떤 경우에는;에 유용 S. mutans ΔgtfB 에 대 한 중단 구성의 성공적인 증폭 바깥쪽 뇌관 (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여 달성 되었다. 그러나, 부족 한 PCR 증폭, 그림 3에서 같이 2차 PCR 단계 바깥쪽 프라이 머를 사용 하 여 자주 발생합니다. 중첩 된 뇌관의 사용은9이 문제 해결 하기 위해 발견 되었다. 그러나 때 중단 구조는 실질적으로 중첩 된 뇌관을 사용 하 여 증폭 하지은,, 1 PCR에 사용 되는 뇌관의 재설계 해야 합니다.
식민지 PCR 유전자 교란 스트레인의 편리한 검사 수 있습니다. 알려진된 시퀀스의 뇌관은 spcr를 사용 하 여 유전자 교란 스트레인의 세대에 대 한 적용할 수 있습니다. Electroporation은 S. mutans WT, 중단 구문의 도입 electroporation를 사용 하 여 달성 변환 효율은 일반적으로 다른 프로시저에서 사용할 수 이상으로 사용 되었다. 능력을 자극 펩 티 드와 말 혈 청, 또는 말 혈 청을 사용 하 여 변환은 구10,,1112에 널리 허용 됩니다. Electroporation 기구 필요 하지만 유능한 세포 준비 등 관련된 절차는 다른 방법10,11에 비해 훨씬 간단 하 게. 또한, electroporation 동물 복지의 관점에서 것이 좋습니다.
현재 프로토콜 번호 ofantibiotic 표식에 따라 여러 유전자 장애에 적용 됩니다. GtfC-및 gtfB를 생성 하기 위해- S. mutans 긴장, 예를 들어 gtfC에 대 한 DNA 구조를 중단-중단 2 단계 PCR에 의해 건설 S. mutans Δ로 변형 될 수 있습니다gtfB. GtfC 및 gtfB 는 경우에 인접 한, S. mutans ΔgtfC 과 S. mutans ΔgtfB 유전자 사용 해야 합니다 2 단계 PCR에 대 한 템플릿으로 동종 시퀀스를 유지 하기 위해 동종 재결합입니다. 사실, 이중 유전자 교란 S. mutans 긴장 이전이 프로토콜9에 의해 건설 되었다.
S. mutans 에 유전자 장애에 대 한 현재의 프로토콜은 다양 한 종의 유전자 교란 종자의 생성에 대 한 적응 수 있습니다. 이 프로토콜은 기존의 프로토콜에 관련 된 유전자 복제 단계를 필요 하지 않습니다. 또한, PCR는 유일한 필수 효소 반응; 따라서, 플라스 미드 벡터, 대장균, 리가, 그리고 제한 효소 필요 하지 않습니다. 또한, 현재 프로토콜 구문 디자인 대상 유전자의 금지 효소 사이트를 독립적으로 중단 구축의 디자인 측면에서 더 큰 유연성을 제공 합니다. 연구원은 삭제 또는 업스트림 측면에 서 영역의 확대를 위한 역방향 뇌관 및 다운스트림 측면에 서 영역의 확대를 위한 앞으로 뇌관 디자인 게놈에서 보존 하는 영역을 결정할 수 있습니다. 지역 측면에 서는 이들은 즉시 업스트림 그리고 즉시 다운스트림 DNA의 영역의 각각 삭제, 원하는. 이러한 유연성 proximate 유전자의 표현에 극 효과 등 외부의 영향을 감소를 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 과학의 승진 [부여 번호 16 K 15860 T.M. 15 K 15777 햄프셔를]에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
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