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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

फेफड़ों के ऊतकों में ट्यूमर कोशिका दृश्य परिसंचारी के लिए एक फेफड़े औपनिवेशीकरण परख की स्थापना

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/56761
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1, 1, 3, 1,2
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

Summary

एक पशु मॉडल कैंसर मेटास्टेसिस के दौरान फेफड़ों औपनिवेशीकरण को बढ़ावा देने में परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) की भूमिका को समझने की जरूरत है । यहां, हम स्थापित और सफलतापूर्वक vivo परख में एक प्रदर्शन के लिए विशेष रूप से फेफड़ों औपनिवेशीकरण के लिए CTCs पर बहुलक fibronectin (polyFN) विधानसभा की आवश्यकता का परीक्षण ।

Abstract

मेटास्टेसिस कैंसर मौत का प्रमुख कारण है । कैंसर मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने में ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी की भूमिका (CTCs), जिसमें फेफड़े औपनिवेशीकरण CTCs द्वारा गंभीर रूप से जल्दी फेफड़ों मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं में योगदान देता है, जोरदार जांच की गई है । जैसे, पशु मॉडल ही दृष्टिकोण है कि मेटास्टेसिस की पूर्ण प्रणालीगत प्रक्रिया कब्जा कर रहे हैं । यह देखते हुए कि समस्याओं को रक्त वाहिका extravasation को CTCs के योगदान की जांच के लिए पिछले प्रयोगात्मक डिजाइनों में होते हैं, हम vivo फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख जिसमें एक लंबी अवधि के प्रतिदीप्ति सेल-अनुरेखक, carboxyfluorescein में एक की स्थापना की succinimidyl एस्टर (CFSE), निलंबित ट्यूमर कोशिकाओं लेबल और फेफड़ों छिड़काव गैर स्पष्ट करने के लिए किया गया था-विशेष रूप से फंस CTCs फेफड़ों को हटाने से पहले, फोकल इमेजिंग, और ठहराव । पॉलिमर fibronectin (polyFN) सीटीसी सतहों पर इकट्ठे मेटास्टेटिक ट्यूमर ऊतकों की अंतिम स्थापना में फेफड़े औपनिवेशीकरण मध्यस्थता करने के लिए पाया गया है । यहां, विशेष रूप से फेफड़ों औपनिवेशीकरण और extravasation के लिए CTCs पर polyFN विधानसभा की आवश्यकता का परीक्षण करने के लिए, हम अल्पकालिक फेफड़े औपनिवेशीकरण परख जिसमें लुईस फेफड़े कार्सिनोमा कोशिकाओं निलंबित (LLCs) छुरा एफ एन-shRNA (shFN) व्यक्त प्रदर्शन किया या हाथापाई-shRNA (shScr) और CFSE के 20 माइक्रोन के साथ पूर्व लेबल C57BL/6 चूहों में नसों में inoculated थे । हम सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है कि shFN llc कोशिकाओं की क्षमताओं को उपनिवेश माउस फेफड़ों काफी shScr llc कोशिकाओं की तुलना में कम थे । इसलिए, इस अल्पकालिक पद्धति को व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है विशेष रूप से परिसंचरण के भीतर CTCs की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए फेफड़ों उपनिवेश ।

Introduction

मेटास्टेसिस कैंसर मृत्यु का प्रमुख कारण है1,2. प्राथमिक ऊतकों से व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं निलंबन में संचलन में प्रवेश और विभिन्न hematogenous चुनौतियों, जैसे, anoikis, प्रतिरक्षा हमले, और नुकसान से खून का दबाव या ज्यामितीय बाधाओं से कतरनी तनाव के कारण, जीवित रहने से पहले वे कर रहे हैं दूर के अंगों उपनिवेश करने में सक्षम, मेटास्टेसिस3,4,5,6की सफलता तय करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम । इसलिए, जोरदार प्रयास वर्तमान में किया गया है निस्र्पक परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) और correlating ट्यूमर द्रोह, मेटास्टेसिस, और कैंसर रोगियों के जीवित रहने की दर के साथ इन विशेषताओं7,8 , 9. चूंकि कैंसर मेटास्टेसिस की प्रक्रिया विशेष रूप से vivo घटना में एक को दर्शाया गया है, पशु मॉडल केवल दृष्टिकोण है कि मेटास्टेसिस10,11,12 की पूर्ण प्रणालीगत प्रक्रिया कब्जा कर रहे है .

CTCs कई सेलुलर घटनाओं के माध्यम से मेटास्टेटिक ट्यूमर ऊतक बन जाता है दूर अंगों के औपनिवेशीकरण सहित1,2. हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किया मेटास्टेसिस परख13,14,15 एक तरह से दूर के अंगों के सीटीसी औपनिवेशीकरण निरीक्षण प्रदान नहीं करते । इसलिए, सीटीसी औपनिवेशीकरण दृश्य के लिए vivo परख डिजाइन में एक तत्काल जरूरत है । हालांकि vivo में कई और पूर्व vivo शॉर्ट टर्म लंग औपनिवेशीकरण की परख डिजाइन की गई हैं, समस्याएं और नुकसान रहते हैं । उदाहरण के लिए, जबकि ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP)-व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं इन परख22,23में इस्तेमाल किया गया है, यह समय के लिए छुरा transfect और क्लोन ट्यूमर कोशिकाओं के तहत पर्याप्त GFP फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ लेता है माइक्रोस्कोप । इसी तरह, हालांकि लंबी अवधि के सेल अनुरेखक CFSE के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के क्षणिक दाग GFP-व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं को प्रतिस्थापित करने के लिए कार्यरत किया गया है, यह न्याय करने के लिए मुश्किल रहता है कि CFSE-लेबल ट्यूमर कोशिकाओं या संलग्न कर रहे हैं केवल के भीतर मौजूद आबकारी सुदूर अंगों की vasculature16,17.

पॉलिमर fibronectin (polyFN) CTCs की सतहों पर इकट्ठे गंभीर रूप से मेटास्टेटिक ट्यूमर के ऊतकों की अंतिम स्थापना के लिए योगदान करने के लिए पाया गया है18,19,20,21,22 . यहां, हम अल्पकालिक फेफड़े औपनिवेशीकरण परख जिसमें लुईस फेफड़े कार्सिनोमा कोशिकाओं (LLCs) को निलंबित एफ एन-shRNA (shFN) या हाथापाई-shRNA (shScr) और पूर्व-CFSE के साथ लेबल में नसों में inoculated थे C57BL/ 2-3 दिनों के बाद, माउस फेफड़ों पहले फॉस्फेट के साथ perfused थे (पंजाब) पूरी तरह से vasculature के भीतर CTCs को दूर करने के लिए किया जा रहा है और ठहराव फेफड़ों-बस्तियां LLCs के अधीन है । हम स्पष्ट रूप से पता चला है कि फेफड़े-बस्तियां shFN LLCs और ट्यूमर पिंड की संख्या काफी shScr LLCs के साथ तुलना में कम थे, काफी corroborating पर polyFN और CTCs के विकास को सुविधाजनक बनाने के क्षेत्र में विधानसभा की भूमिका फेफड़ों. हमारे अध्ययन वारंट कैंसर मेटास्टेसिस में polyFN की भूमिका के लिए आगे की जांच ।

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Protocol

चूहों पर सभी प्रयोगों हमारे संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया (प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड, NCKU मेडिकल कॉलेज).

1. उपकरणों की तैयारी, संस्कृति मीडिया, और व्यंजन

  1. प्रायोगिक प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, बाँझ सर्जिकल टांके, 26G/0.5 सेमी सुई (पूंछ नस इंजेक्शन के लिए), 3 मिलीलीटर सीरिंज के साथ 24G/3 सेमी सुई (फेफड़ों छिड़काव के लिए), Dulbecco के संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) के साथ प्राप्त करें, trypsin-EDTA समाधान (5 g/L trypsin और ०.५३ mm), भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1x पंजाबस (१३७ mm NaCl, २.७ mm KCl, 10 mm Na2फोटो4, और १.८ mm KH2PO4), और 6 सेमी कल्चरल डिश ।

2. तैयारी और निलंबन में ट्यूमर कोशिकाओं की वसूली

  1. तैयार बाँझ है Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) 10% या 20% FBS युक्त और हौसले से 2 मिमी एल glutamine, 1x पंजाबियों, और ०.०५% Trypsin-EDTA जोड़ें ।
  2. संस्कृति DMEM में कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10% FBS के साथ पूरक और जब तक वहां संस्कृति पकवान में 70-80% संगम है ।
  3. व्यंजन से संस्कृति मीडिया (DMEM) को हटा दें, बाँझ 1x पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ दो बहाकर द्वारा पीछा किया ।
  4. व्यंजन में ०.०५% Trypsin-EDTA की 1 मिलीलीटर को अच्छी तरह से सभी कोशिकाओं को कवर करने के लिए जोड़ें । तुरंत समाधान के ८०० μL निकालें और व्यंजन में केवल २०० μL छोड़ दें । 30 एस के लिए ३७ ° c पर व्यंजन मशीन 1 मिनट के लिए (सेल प्रकार पर निर्भर करता है) और जब तक प्रतीक्षा कोशिकाओं के बहुमत निलंबित राज्य में हैं ।
  5. trypsin की एंजाइमी गतिविधि को रोकने के लिए व्यंजन में सीधे 10% FBS युक्त ताजा DMEM की 1 मिलीलीटर जोड़ें और सख्ती से सेल सस्पेंशन को १००० पिपेट l µ के साथ एक सिंगल सेल सस्पेंशन तैयार करने के लिए पिपेट करें ।
  6. डिश से एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण, और 3 मिनट के लिए १६२ x g पर कमरे के तापमान पर नीचे स्पिन ।
  7. महाप्राण supernatant और १.५ एमएल DMEM 20% FBS और अंत से अधिक अंत में कोशिकाओं के निलंबन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए घुमाने के ट्यूमर कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    नोट: अगर मीडियम रिकवरी के दौरान पीले रंग का हो जाता है तो पुराने मीडियम को 20% FBS वाले फ्रेश मीडियम से एक्सचेंज करें ।

3. प्रतिदीप्ति धुंधला और Carboxyfluorescein Succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ निलंबन में ट्यूमर कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. निलंबन में सेल वसूली के बाद, प्रतिदीप्ति धुंधला खुराक और पूंछ नस इंजेक्शन के लिए titrating के लिए एक Neubauer मतगणना कक्ष में Trypan नीले रंग के साथ उपयुक्त व्यवहार्य सेल संख्या गिनती ।
  2. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १६२ x जी में कोशिकाओं को नीचे स्पिन और निष्फल 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में छर्रों कोशिकाओं reसस्पेंड, 3 मिनट के लिए १६२ x g पर कमरे के तापमान केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया ।
  3. 10% FBS और 0, 5, 10, 20, या ४० µ मीटर CFSE खुराक अनुमापन के लिए युक्त 1x पंजाबियों के ५०० µ एल में छर्रों कोशिकाओं reसस्पेंड, और अंधेरे में 10 मिनट के लिए ३७ ओसी पर सेल निलंबन की मशीन ।
  4. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १६२ x जी में कोशिकाओं को नीचे स्पिन और 1% FBS युक्त DMEM के 4 मिलीलीटर के साथ छर्रों कोशिकाओं को स्थगित । इस धुलाई चरण को तीन बार दोहराएं । अंतिम धोने के लिए अकेले DMEM के 4 मिलीलीटर के साथ छर्रों कोशिकाओं reसस्पेंड ।
  5. CFSE-लेबल किए गए कक्षों को प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्ट करने के लिए (FACS) विश्लेषण किसी एकल कक्ष, या टेल नस इंजेक्शन की प्रतिदीप्ति तीव्रता को बढ़ाता है ।
    नोट: FACS विश्लेषण या पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन करने से पहले बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।

4. फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख

  1. 20 µ m CFSE के साथ लेबल किए गए कक्षों को तैयार करें (३.४ के माध्यम से ३.१ चरणों को देखें) ।
    नोट: ट्यूमर कोशिकाओं लेबलिंग के लिए CFSE के काम खुराक तय, FACS विश्लेषण से अनुमापन परिणाम के आधार पर (चरण ३.३ के लिए देखें) ।
  2. 4-6 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL की पूंछ को गर्म/6 चूहों (6 चूहों) एक halide दीपक के साथ 5-10 मिनट के लिए एक माउस-द्वारा-माउस के आधार पर माउस पूंछ नसों को चौड़ा करने के लिए ।
  3. अच्छी तरह से मिश्रण और महाप्राण CFSE-लेबल एक 1 मिलीलीटर के साथ ट्यूमर कोशिकाओं (26Gx1/सिरिंज, सेल निलंबन में किसी भी बुलबुले से परहेज (5 एक्स 106 कोशिकाओं के एक अंतिम सेल घनत्व के साथ/
  4. ध्यान से 1 x106 CFSE-लेबल DMEM के २०० µ एल में ट्यूमर कोशिकाओं माउस पूंछ नस है, जो एक चूहा निरोधक में दर्ज किया जाना चाहिए में इंजेक्शन ।
    नोट: इंजेक्शन के दौरान, सुई सीधे पूंछ नस लुमेन में रखा जाता है, तो ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से सिरिंज पर मुश्किल धक्का की जरूरत के बिना संचलन में दिया जाना चाहिए. यदि यह कठिन है के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं धक्का, वे सबसे अधिक संभावना पूंछ नस के बाहर इंजेक्ट किया गया है, चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में ।
  5. चूहों कि नसों के दो समूहों में CFSE-लेबल ट्यूमर कोशिकाओं प्राप्त विभाजित: एक समूह फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख में फोकल माइक्रोस्कोपी और ImageJ ठहराव के बाद फेफड़े छिड़काव से गुजरना होगा और एक दूसरे के लिए अकेले छोड़ दिया जाएगा 4-5 दीर्घकालिक फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख में सप्ताह ।
  6. 20, ३८, या ४५ ज और 1x 106 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ नसों में एक समय पाठ्यक्रम के दौरान इंजेक्शन और खुराक पर निर्भर अनुमापन, anesthetize ट्यूमर-50-75 मिलीग्राम के साथ चूहों असर-zoletil ५०, जो एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है और उचित anesthetizer23है ।
    नोट: संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए चूहों की आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करें ।
  7. Longitudinally शल्य कैंची के साथ छाती क्षेत्र के लिए पेट से त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतकों में कटौती । पूरी तरह से दिल और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए सर्जिकल कैंची और संदंश के साथ फुफ्फुस गुहा खोलें ।
    नोट: रक्त वाहिकाओं को काटने से बचने के लिए सावधान रहें ।
  8. फेफड़े कावा के दौरान IVC समाधान के backflow को रोकने के लिए बेहतर वेना कावा (SVC) और अवर वेना छिड़काव (छिड़काव) को बाँझ शल्य टांके के साथ बाँधें ।
  9. फेफड़ों से छिड़काव समाधान नाली के लिए एक विदर (लगभग 2-4 मिमी) खोलने के लिए शल्य कैंची के साथ छोड़ दिया निलय दीवार कट.
  10. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के साथ सही निलय में 1x पंजाबियों इंजेक्षन और फेफड़ों छिड़काव के दौरान लगातार चूषण के साथ सूखा समाधान निकालें जब तक फेफड़े एक लाल रंग से पूरी तरह से पीली बारी ।

5. फोकल माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग और फेफड़ों के विश्लेषण-बृहदांत्र ट्यूमर कोशिकाओं

  1. फुफ्फुस गुहा से अब पीला फेफड़ों निकालें और श्वासनली और सर्जिकल कैंची और24संदंश के साथ संयोजी ऊतक बंधन दूर काटने के द्वारा पांच पालियों अलग ।
  2. एक स्ट्रेचर की तरह फेफड़ों के धारक के रूप में दो धातु छड़ के आसपास एक नायलॉन सीवन घुमावदार द्वारा चित्र में दिखाया गया तैयार करने के लिए दो छड़ के बीच एक स्थान के साथ एक reticulate बनावट का उत्पादन करने के लिए फेफड़ों पालियों की नियुक्ति । एक 6 सेमी डिश में फेफड़ों धारक सेट करें ।
    नोट: फेफड़ों धारक एक फोकल माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस के नीचे फेफड़े पालियों को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  3. दर्ज करें और फेफड़ों के धारक की reticulate बनावट पर फेफड़ों पालियों को ठीक । कवर और 1x पंजाबियों के साथ फेफड़ों पालियों गीला ।
  4. 6-मुख्यमंत्री संस्कृति फेफड़े धारक पर फेफड़ों पालियों आश्रय डिश के लिए प्रतिदीप्ति छवियों को पकड़ने के लिए माइक्रोस्कोपी फेफड़ों-बस्तियां ट्यूमर कोशिकाओं रिकॉर्डिंग पर कब्जा ।
  5. इमेजिंग के लिए, उद्देश्य लेंस का उपयोग करें (5x, MPLN, NA: ०.१, WD: 20, एयर) ।
  6. निबा (उत्तेजना/उत्सर्जन; 470-495 एनएम/510-550 एनएम) के लिए फ़िल्टर व्हील घुमाएं और CFSE को उत्तेजित करने के लिए एक ४८८ एनएम लेजर का उपयोग करें, जो स्पष्ट रूप से फेफड़ों के पालियों में प्रतिदीप्ति डॉट्स की छवियों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए है ।
  7. R690 के लिए फ़िल्टर व्हील घुमाएं (मैतई HP DeepSee लेजर के लिए) के लिए २.० µs/पिक्सेल स्कैनिंग गति के साथ स्कैन और एचवी, लाभ, और ऑफसेट स्तर का अनुकूलन ।
  8. एक 10 µs/पिक्सेल स्कैनिंग गति के साथ माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति छवियों (५१२ x ५१२ पिक्सल) पर कब्जा ।
  9. मात्रा और सांख्यिकीय ImageJ और GraphPad सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के रूप में पहले21वर्णित सूक्ष्म छवियों का विश्लेषण ।

6. दीर्घकालिक फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख

नोट: चरण ४.१ ४.५ के माध्यम से दोहराएँ ।

  1. 4-5 सप्ताह के लिए ट्यूमर सेल टीका के बाद चूहों को कुर्बान करें और Bouin के द्रव25 के साथ अपने फेफड़ों को 1 से 2 दिनों के लिए ठीक करें ।
  2. मात्रा और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर21के साथ चूहों फेफड़ों से ट्यूमर पिंड का विश्लेषण.

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Representative Results

vivo फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख में प्रदर्शन करने से पहले के रूप में चित्र 1a परीक्षण करने के लिए कि निलंबित ट्यूमर कोशिकाओं पर polyFN की मध्यस्थता फेफड़े औपनिवेशीकरण और/या extravasation की सुविधा मेटास्टेसिस में सचित्र, हम पहले अलग titrated CFSE की सांद्रता, एक फ्लोरोसेंट यौगिक कि कोशिका पारगंय और covalently conjugates intracellular अमीन युक्त26,निलंबित ट्यूमर कोशिकाओं में27 अणुओं और समय की काफी लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं में रहता है । हमने पाया है कि ट्यूमर कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से एक खुराक पर निर्भर तरीके से CFSE के साथ लेबल, के रूप में चित्र 1bमें सचित्र थे । CFSE-लेबलिंग में 6 x105 LLC कोशिकाओं/एमएल लगभग 20 µ मीटर में एक पठार के रूप में चित्र 1Cमें सचित्र तक पहुंच गया ।

शारीरिक रूप से फेफड़ों vasculature के भीतर CTCs के प्रवाह में बाधा हो सकती है, जो प्रचुर मात्रा में संकुचित केशिका प्रणाली के कारण, हम चूहों में फेफड़ों छिड़काव प्रदर्शन नसों में इंजेक्शन CFSE-लेबल LLC कोशिकाओं गैर स्पष्ट करने के लिए विशेष रूप से फंस CTCs, के रूप में चित्रा 1a में सचित्र प्रत्येक समय बिंदु पर फेफड़ों को हटाने से पहले के रूप में चित्रा 4में चित्रित किया । छिड़काव से पहले, फेफड़ों स्पष्ट रूप से लाल रक्त की उपस्थिति के कारण थे, के रूप में चित्रा 2 के बाएं पैनल में सचित्र । छिड़काव के बाद फेफड़े पीला हो गया 1x पंजाब के 10-15 मिलीलीटर के साथ, के रूप में चित्रा 2 के सही पैनल में सचित्र ।

perfused माउस फेफड़ों के तुरंत बाद फुफ्फुस अंतरिक्ष से हटा दिया गया था, फेफड़े पालियों अलग कर रहे थे और बर्तन में रखा फेफड़ों धारक पर घुड़सवार के रूप में 1x पंजाब अच्छी तरह से फेफड़ों पालियों को कवर के साथ चित्रा 3 ए में सचित्र । फेफड़े पालियों के रूप में चित्र 3 बी में सचित्र फेफड़ों धारक पर घुड़सवार को फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में चित्रमें सचित्र के अधीन थे । CFSE-ट्यूमर कोशिकाओं बस्तियां फेफड़ों के रूप में चित्र 3 सी के ऊपरी पैनल में सचित्र और चित्र 3 सी के निचले पैनल में सचित्र के रूप में काले और सफेद छवियों में बदल छवि थे छवि जंमू सॉफ्टवेयर के साथ फेफड़ों औपनिवेशीकरण के ठहराव की सुविधा के लिए ।

हम नसों के साथ या तो shScr या shFN LLC कोशिकाओं है कि 20 µ एम CFSE के साथ लेबल थे और 24-72 से एक समय पाठ्यक्रम के लिए इंतजार कर इंजेक्शन से पहले फेफड़े perfusions और फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रदर्शन । 6 चूहों में फेफड़े-बस्तियां ट्यूमर कोशिकाओं के ठहराव के रूप में ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ चित्रा 4a में सचित्र पता चला कि काफी कम shFN llc कोशिकाओं से shScr llc कोशिकाओं ३८ ज और ४५ ज समय अंक में गिना गया, के रूप में चित्र में सचित्र 4B . कारण है कि दोनों फेफड़ों की संख्या-shScr और shFN LLC कोशिकाओं को धीरे से कम हो गया है बहुत सतत cytotoxicity के कारण होने की संभावना भी पहले से ही बृहदांत्र कोशिकाओं के खिलाफ है संचलन प्रतिरक्षा द्वारा लागू । कुल मिलाकर, इन परिणामों का सुझाव है कि polyFN CTCs पर इकट्ठे वास्तव में मध्यस्थता में आवश्यक है LLC कोशिकाओं द्वारा फेफड़ों औपनिवेशीकरण, के रूप में फेफड़ों में मेटास्टेसिस पूरा करने के लिए अग्रणी जिसमें कुछ चूहों नसों में aliquots प्राप्त करने के परिणाम से पता चला CFSE-लेबल shScr और shFN LLC कोशिकाओं फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख के लिए के रूप में 4 चित्रा में सचित्र छोड़ दिया गया aloneuntil फेफड़ों के ट्यूमर पिंड प्रयोगात्मक ट्यूमर मेटास्टेसिस परख में विकसित किया गया के रूप में चित्र 5 ए और 5B में सचित्र ।

Figure 1
चित्रा 1: फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख में ट्यूमर कोशिकाओं लेबलिंग के लिए CFSE सांद्रता के अनुमापन । (ए) प्रक्रियाओं के फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख और प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तृत रूप में प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस परख के लिए योजनाबद्ध चित्रण । (ख) CFSE प्रतिदीप्ति LLC कोशिकाओं है कि CFSE के विभिंन सांद्रता के साथ दाग थे की तीव्रता के लिए FACS विश्लेषण । (ग) प्रतिदीप्ति तीव्रता विभिन्न CFSE सांद्रता के कार्यों के रूप में रची गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: फेफड़ों से पहले और छिड़काव के बाद । (unperfused से पहले फेफड़ों के प्रतिनिधि छवियों; Unperf.) और बाद में (perfused; Perf.) प्रदर्शन फेफड़ों छिड़काव । गोल्ड स्टार: दिल । सफेद तीर: टाई कि बंद IVC/SVC । लाल तीर: एक ही माउस के फेफड़े से पहले और छिड़काव के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिदीप्ति फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए फेफड़े धारक पर perfused फेफड़ों पालियों के बढ़ते । (क) फेफड़ों की योजना-फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए फेफड़े धारक पर बढ़ते. (ख) फेफड़े धारक पर ३ perfused फेफड़े पालियों की एक प्रतिनिधि छवि. (ग) छवि जंमू सॉफ्टवेयर द्वारा ठहराव के लिए CFSE प्रतिदीप्ति के साथ फेफड़े-बस्तियां LLC कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियां । ऊपरी पैनल: नियमित इमेजिंग । लोअर पैनल: उलट काले और सफेद इमेजिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: टाइम कोर्स इमेजिंग, ठहराव, और फेफड़ों के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण shScr और shFN LLC कोशिकाओं फेफड़े औपनिवेशीकरण परख में फेफड़ों छिड़काव के बाद । (क) प्रतिनिधि काले और सफेद छवियां (प्रतिदीप्ति छवियों से परिवर्तित) shScr और shFN LLC कोशिकाओं है कि फेफड़ों के vasculature में विभिंन समय अंक में बृहदांत्र के रूप में व्यापक फेफड़ों छिड़काव के बाद दर्शाया गया था । डॉटेड रेखाएं फोकस्ड फोकल फेफड़े के ऊतकों के क्षेत्रों के किनारे को निरूपित करते हैं । (ख) ठहराव और सांख्यिकीय विश्लेषण फेफड़े-बस्तियां LLC कोशिकाओं में visualized के रूप में (A) द्वारा औसत 5 निरपेक्ष प्रतिनिधि छवियों/फेफड़े पालि/ नोट: प्रत्येक बार प्रत्येक में फोकस फोकल क्षेत्र के औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता को इंगित करता है । डेटा सांख्यिकीय 6 चूहों से विश्लेषण किया गया और मतलब ± एसडी के रूप में रिपोर्ट; एन एस का अर्थ है महत्वहीन; * का अर्थ है p < 0.05; और * * का अर्थ है p < 0.01; दो तरह की ANOVA । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: CFSE में मुंह बंद करने एफ एन अभिव्यक्ति-लेबल LLC कोशिकाओं vivo सीटीसी औपनिवेशीकरण परख में लंबी अवधि में फेफड़ों में ट्यूमर पिंड घटता है । (क) है Bouin द्रव-फिक्स्ड माउस फेफड़ों असर ट्यूमर CFSE से व्युत्पंन पिंड-लेबल shScr या shFN LLC कोशिकाओं । (ख) फेफड़ों में ट्यूमर पिंड के लिए ठहराव और सांख्यिकीय विश्लेषण । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में सूचित कर रहे हैं; : p < 0.001; n = 6 प्रति समूह; न बिगड़ा टी-टेस्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

साथ में दीर्घकालिक फेफड़े औपनिवेशीकरण परख, अल्पावधि पद्धति हम यहां कार्यरत को सुदूर अंगों में CTCs द्वारा vivo फेफड़ों औपनिवेशीकरण में मूल्यांकन स्पष्ट रूप से अनावरण किया और CTCs में बस्तियां पर इकट्ठे polyFN की विशिष्ट भूमिका विभेदित फेफड़ों, जो फिर extravasation और मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं18,19,20,21के लिए नेतृत्व किया । हालांकि लंबी अवधि के सेल ट्रैकर के साथ लेबलिंग कोशिकाओं CFSE हमें करने के लिए तीन दिन से पहले फेफड़ों छिड़काव करने के लिए नसों का इंजेक्शन CTCs का पता लगाने और मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए पर्याप्त हरी प्रतिदीप्ति बनाए रखने की अनुमति दी, यह सीधे निर्धारित करने के लिए असंभव था चाहे ट्यूमर कोशिकाओं पोत लुमेन के भीतर स्थित थे या पहले से ही रक्त वाहिकाओं से extravasated था । इस समस्या को हल करने के लिए, लाल फ्लोरोसेंट rhodamine-संयुग्मित dextran जो गैर विशेष रूप से endothelia पर व्यक्त lectins के लिए बाइंड करने में सक्षम है फेफड़ों vasculature के दौरान फेफड़ों छिड़काव लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है28,29, 30. तथ्य यह है कि CFSE एक दीर्घकालिक सेल ट्रैकर है के बावजूद, अपनी प्रतिदीप्ति तीव्रता हर कोशिका विभाजन27आधी है, यह लेबलिंग तकनीक में उपयोग करने की क्षमता सीमित । इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, यह पता लगाया जाना चाहिए कि CFSE की लेबलिंग खुराक vivo प्रयोगों में की पूरी अवधि के लिए जासूसी करने के लिए रहने के लिए पर्याप्त है और कोशिकाओं पर लागू किसी भी उपचार सेल पर कोई प्रभाव नहीं है कि प्रसार. क्योंकि फेफड़ों की तुलना और ठहराव-बस्तियां shScr और shFN CTCs अलग चूहों में किया गया था, यह तर्क दिया जा सकता है कि दो समूहों के बीच मतभेद व्यक्तिगत भिंनता के कारण थे । इस तरह के परिवर्तन को बाहर करने के लिए, अलग fluoresce रंजक के साथ लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के दो प्रकार के एक मिश्रण (जैसे, CFSE/सेमी-दिी) या GFP/dsRed के साथ छुरा transfected नसों के फेफड़े में एक ही जानवर में इंजेक्शन concomitantly हो सकता है औपनिवेशीकरण परख31,३२,३३। यह ध्यान देने योग्य बात है कि क्लोनिंग सेल क्लोनिंग तकनीक है कि बाहर छुरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन transfected पर्याप्त मजबूत प्रतिदीप्ति३४,३५के साथ सेल क्लोन तरह का प्रयास किया है से उत्पंन प्रभाव के लायक है, ३६ , ३७ क्लोन कोशिकाओं को पूरी विषम आबादी३८,३९,४०प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रतिनिधि बना सकते हैं । यदि ट्यूमर कोशिकाओं में किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक स्थिर अभिकर्मक फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख के लिए वांछित है, एक पूरे के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं के अभिकर्मक दक्षता तरक्की बेहतर सेल क्लोनिंग से मूल विशेषताओं का संरक्षण करना चाहिए पर्याप्त प्रतिदीप्ति४१,४२के साथ आबादी ।

फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख में फेफड़ों छिड़काव कदम है कि कुछ नसों में इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं में आवश्यक हैं, के बजाय विशेष रूप से फेफड़ों केशिका प्रणाली को गिरफ्तार करने, यांत्रिक फंस रहे है और फेफड़ों के केशिका नेटवर्क के भीतर जाम हो जाते है फेफड़े केशिका लुमेन४३,४४की चौड़ाई से CTCs के औसत रूप से बड़ा व्यास के कारण ऊतकों । फेफड़ों perfusing बिना फेफड़े-बस्तियां ट्यूमर कोशिकाओं के ठहराव गलती से यांत्रिक रूप से ठेला कोशिकाओं४५,४६,४७गिनती द्वारा एक अनुमान में परिणाम हो सकता है । फेफड़ों में perfused होने के बावजूद भी अतिरिक्त समस्याएं बनी रहती हैं । उदाहरण के लिए, यह अभी भी अंतर है कि फेफड़ों बस्तियां ट्यूमर कोशिकाओं लुमेन endothelia पर स्थित है या पहले से ही रक्त वाहिकाओं से extravasated है मुश्किल है । इस समस्या को हल करने के लिए, Rhodamine-संयुग्मित dextran के साथ रक्त वाहिकाओं धुंधला aforementioned के रूप में उपयोगी हो सकता है30,४८,४९। वैकल्पिक रूप से, यदि ट्यूमर extravasation के ठहराव वांछित है, कैल्शियम-chelator EDTA/EGTA या trypsin, एक गैर-विशिष्ट चिढ़ाना, छिड़काव बफर में इस्तेमाल किया जा सकता है कैल्शियम पर निर्भर है और स्वतंत्र ट्यूमर सेल आसंजन की घटनाओं५० , ५१ , ५२. इस प्रकार, फेफड़ों के ऊतकों में शेष ट्यूमर कोशिकाओं को extravasated के रूप में माना जा सकता है.

फेफड़ों बस्तियां ट्यूमर कोशिकाओं के ठहराव के लिए, perfused फेफड़ों अक्सर पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोपी के अधीन हैं । हालांकि, ऊतक गहराई के measurability ऊतक autofluorescence और प्रतिदीप्ति तितर बितर प्रभाव के लिए भाग में कारण सीमित है, गहरा ऊतकों undetectable५३,५४प्रतिपादन । एक पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोप की तुलना में उच्च संवेदनशीलता के साथ एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप में ऐसी समस्याओं को हल करने के लिए उपयुक्त है कि पास-अवरक्त विकिरण दो में इस्तेमाल किया-यूवी से जैविक नमूनों द्वारा काफी कम अवशोषण के साथ फोटॉन उत्तेजना या ब्लू-ग्रीन लाइट तकनीक अधिक इमेजिंग मोटी नमूनों५५,५६,५७के लिए उपयुक्त बनाता है । फेफड़ों बस्तियां ट्यूमर कोशिकाओं कई प्रतिनिधि फोकल छवियों, जो एक व्यक्ति जानवर के पूरे फेफड़ों में फेफड़ों बस्तियां ट्यूमर कोशिकाओं की पूरी संख्या में शामिल नहीं है में ट्यूमर सेल संख्या औसत से गिना जाता है । फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख में पूरे फेफड़ों यों तो, ट्यूमर कोशिकाओं luciferase के साथ छुरा transfected कार्यरत हो सकता है और perfused फेफड़ों फिर IVIS इमेजिंग की उपस्थिति में निलंबित ट्यूमर कोशिकाओं की नसों में टीका के अधीन किया जा सकता है luciferin४६,५८,५९. वैकल्पिक रूप से, perfused फेफड़ों टुकड़ों में भरती किया जा सकता है और एंजाइमी के साथ पाचन के अधीन, जैसे, collagenase, निलंबन६०,६१में एकल कोशिकाओं को रिहा. प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ प्रतिदीप्ति रंजक या छुरा transfected के साथ ट्यूमर कोशिकाओं तो प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) विश्लेषण५६,६२के साथ quantified जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डॉ मिंग-मिन चांग और सुश्री हां, उनके तकनीकी समर्थन के लिए सीन चेंग शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । इस काम का समर्थन किया था ताइवान के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (सर्वाधिक-103-2325-B-006 -009, सबसे ज्यादा-104-2325-बी-006-001, सबसे-105-2325-बी-006-001, और सबसे-106-2320-बी-006-068-MY3) और स्वास्थ्य और कल्याण मंत्रालय (MOHW106-TDU-बी-211-144004) । हम भी चिकित्सा के कॉलेज, राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय के कोर अनुसंधान प्रयोगशाला से समर्थन के लिए आभारी हैं, उनकी बहु के लिए फोटॉन फोकल माइक्रोस्कोप ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271

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कैंसर अनुसंधान अंक १३६ मेटास्टेसिस फेफड़ों औपनिवेशीकरण परख फेफड़ों छिड़काव घूम ट्यूमर कोशिकाओं Carboxyfluorescein Succinimidyl एस्टर पॉलिमर Fibronectin Extravasation
फेफड़ों के ऊतकों में ट्यूमर कोशिका दृश्य परिसंचारी के लिए एक फेफड़े औपनिवेशीकरण परख की स्थापना
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