Summary
모 세관 전자 초점 단백질과 매우 작은 생물 학적 샘플에서 그들의 isoforms의 상세한 특성을 사용 하는 항 체 기반, 磁, 높은 처리량 기법입니다. 다음 자동화 하 고 운반할 방식 검색 및 특정 단백질과 그들의 isoforms의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Immunoblotting 생물학 견본에서 단백질 특성에 대 한 많은 실험실에서 일상적인 기술 되고있다. 대체 전략을 제공 하는 다음 프로토콜, 기존의 immunoblotting 모 세관 (cIEF), 많은 장점을가지고 초점 전자 비교. 이는 완전 한 서쪽 더 럽 히 절차 수행 ultrathin 모 세관 내부 항 체 기반, 자동, 급속 한, 및 양적 방법입니다. 이 기술은 젤 막,도 말의 스트립 전송 필요 또는 기존의 immunoblotting에 일반적으로 필요한 영화를 x 선 하지 않습니다. 여기, 단백질 분리 (전자 포인트, pI) 그들의 책임에 따라, 사용 하 여 보다는 microliter (400 nL) 총 단백질 lysate의. 전기 이동 법, 후 단백질 자외선 빛 치료, 기본 및 보조 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용)에 의해 모 세관 벽에 움직일 수 있다 항 체 외피, 누구의 바인딩을 통해 감지 향상 화학 (ECL), 점령 하 고 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라에 의해 기록 된 수 있는 광 신호를 생성 한다. 디지털 이미지 분석 될 수 있다 및 계량 (피크 지역) 소프트웨어를 사용 하 여. 이 높은 처리량 절차 한 번;에 96 샘플을 처리할 수 있습니다 매우 민감한, picogram 범위의; 단백질 검출 그리고 자동화 때문에 높은 재현성 결과 생산입니다. 이러한 측면의 모두 매우 귀중 한 때 (예를 들어, 조직 샘플 및 생 검) 샘플의 수량 제한 요소입니다. 기술은 더 넓은 응용 프로그램 뿐만 아니라, 약물 또는 항 체, 바이오 마커 발견 및 진단 목적으로의 심사를 포함 하 여 있다.
Introduction
모 세관 전자 초점 (cIEF) 그들의 충전1,2,3에 근거 하 여 단백질을 확인 하는 자동화 된, 모 세관 기반 immunoassay입니다. 그것은 매우 재현 하 고 신속 하 고 양적 단백질과 그들의 post-translationally 수정된 isoforms를 해결 하기 위한 능력입니다. 그것은 서쪽에 게 더 럽 히기와 같은 기존의 방법에 대안을 선물 한다. 매우 쉽게 액세스할 수 있는 샘플;에 풍부한 단백질의 존재 확인에 대 한 좋은 서쪽에 게 더 럽 히기 다양성, 시간 소비, 및 정확한 정량 모두 존재 도전, 특히 생물학 조직 샘플을 검사 하는 경우. 실제로, 다양성 서쪽 blotting에 고유의 문제는, 거기에 수많은 단계 참여, 로드 및 SDS 페이지 젤의 실행, 전송, 막에는 단백질의 다양 한 시 약으로 부 화 (예., 기본 및 보조 항 체, ECL), x 선 필름4에 개발. 현재, 서쪽 더 럽 히 기술 chemiluminescent 신호 (디지털 westerns)의 디지털 기록의 구현 개선 이다. 최근, 자동화 된 서쪽 더 럽 히 시스템 개발 되었습니다, 즉 모 세관 서 부, 보다 핸 즈 프리 하 고 젤 무료 시스템입니다. 전체 분석 결과 시스템3,4에 샘플 플레이트 (샘플 모든 필요한 시 약을)의 로드에 따라 자동입니다. 악기는 단백질 분리 등 모든 단계를 수행 합니다 다른 단계, 그리고 개발 및 정량화 chemiluminescent 신호 사이 모 세관 벽, 항 체 외피 단백질의 동원 정지 세척. 따라서, 여기에 제시 된 cIEF 절차는 높은 해상도 감도 제공 합니다.
이 메서드는 중요 한 신호를 생성 고 단백질1의 picograms에서 측정할 수 있습니다. 우수한 재현성 높은 감도이 기술을 임상 샘플의 분석을 위해 매우 유용 하다. 그것은 수 탐지 뿐 아니라 단백질의 포스트 번역 상 수정 (예: 다른 phosphorylated 단백질 isoforms) 구별. 이 기술을 성공적으로 사용 되었습니다 다른 신호 통로4,5 암3, 새로운 치료제 개발을 목표로 하는 임상 연구를 해 부하 고 단백질 바이오 마커 및 약물 발견에 대 한 큰 가능성이 있다 .
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Protocol
1. 세포 문화, 자극, 및 세포의 용 해
참고:이 방법은 많은 세포 유형으로 사용할 수 있습니다. 방법을 설명 하기 위해 예를 들어 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)를 사용 하 여 설명 되어 있습니다.
- 적절 한 보충과 내 피 세포 기저 매체에서 10 cm 배양 접시 젤라틴 코팅에 HUVECs 문화 ( 재료의 표참조), 또한 5 %FCS, 표 피 성장 인자 (5 ng/mL), 혈관 내 피 성장 인자를 포함 하 고 (VEGF: 0.5 ng/mL), 기본적인 FGF (10 ng/mL), 인슐린과 같은 성장 인자 (20 ng/mL), 하이드로 코 티 손 (0.2 µ g/mL), 및 의약품 (1 µ g/mL).
- 내 피 세포 기저 매체 1 %FCS 더 성장 인자 보충 보충 셀 밤새 굶 어.
- 모든 매체를 발음, 한 접시 (제어), 내 피 세포 성장 인자 (기아 매체) 없이 문화 매체의 2 개 mL를 추가 다음 7 분에 대 한 두 번째 접시에 기아 문화 매체의 2 ml에서 50 ng/mL VEGF를 추가 합니다.
- 매체를 발음 하 고 셀 10 mL 실내 온도 PBS로 2 회 세척.
- 페 트리 접시 얼음에는 앞으로이 단계에서 거기에서 그들을 계속 확인 합니다.
- 각 10 cm 접시를 얼음 차가운 세포의 용 해 버퍼 (Bicine/챕 스; 참조 테이블의 재료) 포함 수성 protease 억제제 믹스와 DMSO 억제제 믹스 (인산 가수분해 효소 억제제; 참조 테이블의 재료) 250-400 µ L를 추가 합니다. 적절 한 범위를 보장 하 고 얼음에 10 분 동안 계속 접시를 소용돌이 친다.
참고: 효소와 DMSO 억제제 믹스의 최종 농도 1 x 이어야 한다. - 미리 냉장된 microfuge 관에 셀 스 크레이 퍼와 전송 접시에서 셀 다쳤어요. 최대 플라스틱 하 고 세포를 lyse 5 번 아래로.
- 짧게 4 ° c.에 셀 sonicate sonicator를 다음과 같이 설정: 사이클의 수 = 5, 전원 = 낮음, = 5 초, 30 = s. 이 단계는 휴식 핵 산 및 세포를 lyse을 포함.
참고: 쥡니다 단백질의 변성을 방지 하기 위해 가벼운 해야 합니다. - 소용돌이 관 5 s (아니 지속적으로), 2 번 (3 번), 얼음에 계속에 s.
- 4 ° C에서 15 분 동안 14000 x g에서 원심 분리에 의해 lysate 명확히 다음 즉시 깨끗 한 미리 냉장된 microfuge 관에는 상쾌한을 전송 합니다.
- Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 실험 키트4를 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다.
- 만들기 10 µ L aliquots, 스냅 드라이 아이스 나 액체 질소를 고정 하 고 사용까지-80 ° C에서 저장.
2. 샘플 혼합 준비 (150 µ L 샘플 혼합 계산)
- 먼저, DMSO 억제제 믹스의 1 µ L을 추가 하 여 샘플 희석제 믹스를 준비 (50 x 재고) 및 47 µ L의 샘플 희석제를 protease 억제제 (25 x 재고)의 2 µ L ( 재료의 표참조), 그렇게 DMSO 억제제와 프로 테아 제 억제제의 최종 농도 1 x가 된다. 다음, 단백질 lysates 샘플 희석제 믹스를 사용 하 여 (단계 2.3 참조) 원하는 농도를 희석.
- 표준 3.325 µ L 사다리 ( 테이블의 자료; 60 x 재고 참조) 추가 하 여 ampholyte/사다리/protease 억제제/DMSO 억제제 믹스를 준비 protease 억제제 (25 x), 137.675 µ L ampholyte 프리 믹스 (참조 테이블의에 DMSO (50 x) 억제제의 3 µ L의 6 µ L 재료). 소용돌이 관 최소 15 s 총, 5 한 번에 s (3-4 회), 얼음에 계속.
- DMSO, protease 억제제, 및 pI 표준 사다리의 마지막 농도 1 X, 되 고 모 세관에 있는 단백질 최종 원하는 농도 도달 2.1과 2.2를 1:3 비율에서 단계에서 솔루션을 혼합 (예를 들어, 50 µ g/mL 사용 되었다 그림 2)입니다.
참고: 모 세관에 잘 단백질 농도가 같습니다. - 384 잘 플레이트 분석 결과 템플릿 레이아웃에 따라 적절 한 우물에 샘플 혼합의 10 µ L 로드 (단계 3과 그림 1참조) 얼음에 플레이트를 유지 하 고.
- 희석 주 (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) 및 2 차 항 체 (1:300) 항 체 희석 액 ( 재료의 표참조)의 각 음에 이차 항 체의 기본 및 15 µ L 10 µ L 플라스틱 및.
참고: 일반적으로, 항 체의 높은 농도 기존의 서양 오 점 비교 분석 실험 cIEF 필요 합니다. - Luminol 믹스 및 XDR (1:1 비율, 참조 테이블의 재료)를 함께 과산화와 각 우물에 15 µ L 플라스틱.
참고: 사용 하기 전에 때마다 이러한 솔루션 신선한을 혼합 하 고 얼음에 계속. - 일단 샘플 및 모든 시 약은 접시에 pipetted는, 액체를 회전 하 고 거품을 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 2500 x g에서 격판덮개 원심. 거품은 아직도 존재 하는 경우 얇은 피 펫 팁을 사용 하 여 수동으로 제거.
참고: 샘플 또는 잘; 당 약 20 µ L를 로드 하지 마십시오 그렇지 않으면, 악기 피펫으로 제대로 세척 될 수 없습니다. 모든 시 약을 준비 하는 제조 업체에서 사용 설명서를 확인 합니다.
3. 시스템 소프트웨어 (그림 1) 새로운 분석 결과 서식 파일을 디자인
- 시스템 소프트웨어를 열고 파일 메뉴에서 "새로 만들기"를 클릭 합니다.
- 레이아웃 창으로 이동한 시 약 및 384 잘 판에 샘플에 대 한 위치를 지정 합니다. 최대 384-잘 접시 당 96 웰 스의 최대 사용.
- 시 약 할당 블록에서 잘 곳을 클릭 하 여 확인 합니다. 12 우물의 행 블록을 선택 합니다. 웰 스, 예를 들어, 1-12 또는 13-24, 기본적으로 블록으로 할당 됩니다.
- 레이아웃 창 도구 모음에 이동한 빈 행 블록 또는 샘플, 기본, 보조 또는 luminol 행 블록을 삽입 합니다. 그래서 그들은 쉽게 차별화 하 각 블록 다른 색을 할당 합니다.
참고: 지금까지 우물을 클릭 하면에 검은색 테두리 창에서 새 블록 삽입 될 위치가 블록 주위 볼 수 있습니다. 행 블록 또한 삭제할 수 있습니다. - 프로토콜 창에가 고 접시에 시 약 위치를 선택 하십시오. 그런 다음 샘플 열에서 셀을 클릭 하 고 드롭다운 메뉴에서 시를 선택 합니다.
- 이 같은 방식 기본, 보조, 시 약 위치 및 각 사이클 luminol 선택 합니다.
- 주 또는 보조 항 열에 한 번에 하나씩 셀을 클릭 하 고 필요한 경우 부 화 시간을 변경.
참고: 각 사이클 항목 노트 추가할 수도 있습니다. - 프로토콜 섹션의 '추가' 버튼을 클릭 하 여 주기를 추가 합니다. 1 사이클, 4 사이클, 또는 모든 사이클 (8 사이클의 최대 프로토콜에 추가 될 수 있습니다).
참고: 복사 하 고이 단계에서 주기 정보를 붙여 가능 하다: 한 주기를 선택, 편집, 복사 및 붙여넣기로 이동. - 1 차 및 이차 항 체 그들의 카탈로그 및 희석, 번호 등, 템플릿 창에서의 정체성 같은 샘플에 대 한 정보를 입력 합니다. 실행된 후 분석 중에 유용 선택적 단계입니다.
- 새로운 분석 결과 파일을 저장 합니다. '시작' 버튼을 클릭 하기 전에 신속 하 게 모든 올바른지 확인 레이아웃을 확인 합니다.
4입니다. 프로토콜 cIEF 악기 설정에 대 한
- 모 세관 전자 초점 전기 영동 분리 조건을 설정 합니다. 이러한 15000 µW 및 40 분 이어야 하 고 UV 동원 정지 시간 80 이어야 한다 s. 그러나, UV 동원 정지 시간 80-140 s의 범위 내에서 설정할 수 있습니다 그리고 관심사의 단백질에 대 한 최적화를 할 수 있습니다.
참고: 각 모 세관 아니지만 각 사이클 UV 동원 정지에 대 한 시간 포인트를 설정할 수 있습니다. - 세트 150에 대 한 1 ~ 2 세척, 세척 s 각 세척 (기본값), 그리고 120 분에 대 한 1 차적인 항 체 외피.
- 세트 150 2 2 세척, 세척 s 각 세척 (기본값), 그리고 60 분에 대 한 2 차 항 체 외피.
- 워시 3, 150 2 세척 되어야 설정 s 각 세척 (기본값).
- 설정 노출 시간 때 화학 감지 될 것 이다; 이 30, 60, 120, 240, 490, 그리고 960 해야 s. 모든 단계 (1-8) 단일 모 세관에서 수행 될 것 이다.
5. 분석 결과 파일을 실행
- 모든 준비가 되 면, 시작을 클릭 실행 하려면. 소프트웨어 물 및 모 세관 상자, anolyte 및 catholyte 리소스 트레이 워시 버퍼를 추가 하려면 추가 리필 낭비를 제거 하 라는 메시지가 나타납니다 그리고 마지막으로 냉각된 샘플 트레이 접시를.
참고: 모 세관 상자에서 뚜껑을 제거 하지만 분석 결과 접시에서 뚜껑을 제거 하지 마십시오. 접시에서 뚜껑 때 필요한 악기에 의해 자동으로 제거할 수 있습니다. 이 시 약 증발을 방지할 수 있습니다. - 몇 분 후에 실행 시작 했다, 악기 상태 표시줄은 컴퓨터 화면에 표시 됩니다. 상태 메시지 및 진행률 표시줄 해당 악기의 현재 단계를 볼 수 있습니다.
참고: 처음, 악기 확인 다 분리 쟁반으로 anolyte와 catholyte를 플라스틱으로 진행 12 모세의 첫 번째 블록을 따기, 접시의 뚜껑을 제거 하 고 샘플에서 샘플을 배치 하기 전에 정확한 플레이트는 모세 혈관으로 그리고 마지막으로 전기 이동 법 별거 챔버로. - 볼 두 개의 창이 실행된 요약 화면에서 클릭: 상태 및 분리. 사용자 실행된 진행률을 볼 수 있으며 각 사이클의 전기 이동 법 단계가 완료 되 면 분리 (각 주기의 12 모세 혈관)의 영화를 저장할 수 있습니다. 에 모 세관 전기 이동 법 별거를 관찰, 그 모 세관에 대 한 분리 영화 원하는 주기 그리고 컨트롤 패널에서 재생 버튼을 클릭 하 여 재생 합니다.
- 실행된 파일 실행 완료 시 자동으로 저장할 수 있습니다.
6. 분석 데이터 (그림 s 1)
- 실행된 파일을 열고 분석 화면 탭을 선택 합니다. 그림 S1A, (봉우리) 샘플 그래프에 표시 되는 데이터는 선택한 모 세관 (즉, 1 주기에서 4번째 모 세관)에서입니다.
- 편집 그리고 분석 (그림 S1B)를 클릭 합니다. 이 단계에서 사용자가 변경할 수 pI 범위, 주어진된 실험에 대 한 적절 한 pI 표준 적용, 피크 맞는 추가 있으며 피크 이름을 추가.
참고: pH 5-8 ampholyte를 사용 하 여 (같은 경우 여기) 공기로 때 사용 권장된 표준 사다리 4.9, 6.0, 6.4, 7.0과 7.3의 pIs와 붙일 레이블된 펩 티 드와 하나 이며 pH 3-10 프리 믹스를 사용 하면 권장된 사다리 4.0의 pIs와 하나 4.9, 6.0, 6.4 및 7.3. 2 - 봉우리 탭에 표시 됩니다. 샘플에 대 한 표시 하는 값은 위치, pI, 피크 높이 및 지역, % 영역, 피크 폭, 및 신호를 잡음 (S/N) (그림 S1C). 를 사용 하려면 데이터를 선택 하 고 추가 분석을 위해 데이터를 내보낼.
참고: 데이터만 피크 (그림 S1C) 라벨 후 내보낼 수 있습니다.
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Representative Results
디자인의 새로운 분석 결과: 분석 결과 플레이트 레이아웃 그림 1A에 표시 됩니다. 극대, 96 웰 스 384-잘 접시 12 웰 스의 블록에서에서 각 조건 (항 체)에 대 한 사용할 수 있습니다. 12 우물의 각 블록 A1-A12 또는 A13-A24에서 시작할 수 있습니다. 색상 코드 행 하나 다른 샘플 또는 시 약을 구별할 수 있습니다. 분석 결과 서식 파일 (그림 1B), 그에 대 한 관련 정보에서에서 특정 분석 결과 저장할 수 있습니다, 결과 분석의 나중 단계에서 사용할 수 있는. 그림 1C 는 프로토콜의 요약을 보여 줍니다.
HUVEC lysate에 phosphorylated 및 unphosphorylated 세포 외 레 귤 레이트 키 니 아 제 (pERK1/2, ERK1/2) 단백질의 검출 VEGF와 자극: 일반적으로, 포스트 phosphoproteins, 등 translationally 수정된 단백질은 그들의 낮은 수량 및 과도, 그리고 특정 항 체의 부족 때문에 감지 하기가 어렵습니다. 혈 청 기아를 따라 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) 자극 수용 체 티로신 키 니 아 제 (VEGFR2) MAPK 통로 활성화 하 고 ERK의 인 산화에 결과 활성화 합니다. HUVECs를 사용 하 여 실험, 세포 자극된 또는 VEGF 없이 7 분에서 lysates 사용할 수 있습니다, 그림 2와 같이. 그림 2A ± VEGF 자극 lysates에서에서 pERK1/2의 electropherogram를 보여 줍니다. 분명히, VEGF phosphorylated 단백질 (빨간색으로 설명 된 봉우리)의 매우 높은 유도가 이다. 삽입 치료와 치료 샘플에 대 한 샘플의 비슷한 로드를 나타내는 내 생 로드 제어 HSP 70 (그림 2A ) 삽입, 표시 합니다. (그림 2C왼쪽된 패널) 기존의 immunoblot에 두 밴드 했다 (phosphoERK1, pERK1 및 pERK2)를 발견. 그러나, pERK1/2 단백질 cIEF 분석 (그림 2A)에 의해 ppERK2, pERK2, ppERK1, 및 pERK1에 대 한 4 봉우리로 해결 했다. 마찬가지로, 그림 2B 에서 ± VEGF 자극 lysates ERK1/2의 electropherogram를 보여 줍니다. 삽입 된 동시에 사용 되는 동일한 로드 컨트롤을 보여 줍니다. 해당 ERK1 그리고 ERK2 하 기존의 immunoblot 쇼 두 밴드 (그림 2C오른쪽 패널) cIEF와 함께 pERK1/ERK2 6 봉우리 (그림 2B)에 해당 모든 4 가지 하에 해결 하는 반면 phosphorylated 봉우리와 2 unphosphorylated 봉우리, ERK1 그리고 ERK2 이 보여줍니다 cIEF 가진 장점 중 하나, 그 단백질 isoforms를 해결 하 고 모두 질적 및 양적 평가 수 즉. 또한, 그것은 항 체 단백질 코어 posttranslational 수정 보다는 감독에서 phosphorylated isoforms의 정량적 인 정보를 얻을 수 있습니다.
그림 1 : 분석 결과 플레이트 레이아웃 소프트웨어에서의 설계. (A) 384-잘 접시 레이아웃 모든 시 약의 위치를 정의 하는. 색으로 구분 된 12 잘 행 샘플, 항 체, 및 chemiluminescent 시 약에 대 한 위치를 보여주는. (B) 분석 결과 템플릿 개별 잘 관련 정보를 보여주는. (C) 프로토콜에 대 한 모든 관련 정보를 보여주는 1과 2를 주기. 1 (12 모 세관 색된 상자에 표시)를 주기에서 악기 샘플 a 1에서 (a 1-a 12에서 웰 스) 다음 주 항 체 b 1에서 d 1에서 (B1-b 12에서 웰 스), 이차 항 체 (D1-D12에서 웰 스), 그리고 마지막으로 luminol:peroxide J1에서 XDR (우물에서 J1-J12). 2에서주기, 모든 것은 첫 번째 사이클 같은 걸리는 c 1에서 1 차적인 항 체를 제외 하 고 (C1-C12-우물). 이 그림은 Aspinall O'Dea 외. 20152허가 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : CIEF 분석 결과 및 분석 결과 전통적인 immunoblot phosphorylated 및 총 Mitogen-Activated 단백질 키 니 아 제 (ERK 1/2) 단백질의 검출. (A) PERK1/2, HUVECs에 단백질 대표 electropherogram ±VEGFA cIEF 분석 결과, pERK1/2 항 체에 대 한 조사 뒤 처리. 블루 라인 (unstimulated) 및 운용 (자극된). 봉우리는 다르게 phosphorylated 특권/2 isoforms 전자 포인트 기준으로 구분 표시. 삽입 lysate HSP70 같은 동시에 실행 하는 내 생 제어를 보여 줍니다. (B) 대표 electropherogram ERK1/2 ± 보여주는 VEGFA 자극 lysate. 삽입 된 내 생 컨트롤 HSP70 병렬에서 실행을 보여 줍니다. Electropherogram를 위한 50 µ g/mL lysate 농도 사용 되었다, 20에 해당 모 세관에서 총 단백질의 ng. (C) pERK1/2, ERK1/2 단백질 ±VEGFA (50 ng/mL)에 대 한 기존의 immunoblotting HUVEC 세포 lysate를 자극. 총 레인 당 lysate의 10 µ g immunoblotting 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 그림 S1: 결과 분석의 단계
(A)의 모 세관에서 결과 볼. (B) 분석 결과 파일에 서로 다른 매개 변수 편집/추가. (C) 추가 분석에 대 한 데이터를 내보내기 전에 봉우리 피크 이름을 추가할 수 있다. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
감도 및 단백질의 해상도 proteomic 연구 생물 학적 샘플에 대 한 중요 한 있습니다. 셀에 분 수량에 존재 하는 단백질을 감지할 수 있게 되 고 큰 가치가 있다. cIEF는 향상 된 감도 단백질과 그들의 isoforms4의 검출에 대 한 해상도 제공할 수 있습니다.
이 기술은 많은 proteomic 연구 보고서5,,67에 성공적으로 사용 되었습니다. 그래도, 몇 가지 제한이 연관, 등 모든 주요 항 체 그들은 기존의 immunoblots에서 잘 작동 하는 경우에 신호를 줄 수 있습니다. 아직, 유효한 항 체 때문에이 기술은 아주 새로운 cIEF, 기능 표시의 목록입니다. 마지막으로, 악기 한 번에 미만의 12 샘플 또는 이상의 96 샘플을 처리할 수 없습니다.
cIEF는 기존의 immunoblotting에 대 한 대체 기술입니다 하지만 그것은 동일한 결과 주지 않을 수 있습니다. cIEF까지 뛰어난 해상도 및 기존의 immunoblotting 되도록 표시 되었습니다. 또한, cIEF는 높은 처리량, 강력한, 자동, 운반할, 그리고 매우 중요 한 단백질에 따라 25 개 미만 세포에서 신호를 떨어졌다1분석. 그것은 양적 높은 재현성으로 처리 최소화입니다. 비슷한 크기의 다양 한 단백질 isoforms의 탐지는 쉽게 해결할 수 있습니다. 따라서, 동일한 항 체 나노 그램 양의 샘플4에서 phosphorylated 및 unphosphorylated 단백질 형태에 정량적 인 정보를 제공할 수 있습니다. 기존의 immunoblot 및 cIEF 모두에 의존 하는 비록 항 체 기반 chemiluminescent 탐지, 기존의 immunoblotting에서 단백질 분리 되어 그들의 분자량 기준 반면 같은 몇 가지 중요 한 차이점이 있다 cIEF에 분리는 단백질 충전을 기반으로 합니다. 마지막으로, 단백질은 cIEF에 그들의 네이티브 국가에서 보존 하는 반면, immunoblot에 변성 됩니다. 이 마지막 점은 이유 왜 동일한 항 체 또는 두 방법 모두에서 작동 하지 않을 수 있습니다.
많은 다른 학문은 인간의 환자 샘플3, 인간 결 장 암 샘플4,8,9, 마우스의 종양 조직 또는 다양 한 셀 라인 단백질 인 산화를 공부 하는 cIEF의 응용 프로그램을 설명 했다 10.이 방법의 채택 proteomic 연구 약물 발견, 진단, 바이오 마커 발견, 목적과 연구 신호 등 많은 분야에서에서 급속 한 진보를 홍보할 수 있는.
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Disclosures
저자는 아무 공개.
Acknowledgments
저자는 교수 레나 Claesson-웨일스어, 웁살라 대학, 스웨덴이이 프로젝트 개발을 위한 그녀의 지원에 대 한 감사 합니다. 또한, 저자 로스 스미스와 레나 Claesson-웨일스어, 웁살라 대학 그들의 중요 한 읽기 및 원고를 개선 하기 위한 제안을 위한 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
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