Summary
Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.
Abstract
Immunoblotting tornou-se uma técnica de rotina em muitos laboratórios para caracterização de proteínas de amostras biológicas. O protocolo seguinte fornece uma estratégia alternativa, capilar isoeléctrico de focagem (cIEF), com muitas vantagens em relação ao convencional immunoblotting. Este é um método baseado em anticorpos, automatizado, rápido e quantitativo, em que um procedimento completo de mancha ocidental ocorre dentro de um capilar ultrafino. Esta técnica não exigem um gel para transferir a uma membrana, remoção de manchas, ou filmes, que são geralmente necessários para immunoblotting convencional de raios-x. Aqui, as proteínas são separadas de acordo com sua carga (ponto isoelétrico; pI), usando menos do que um microlitro (400 nL) de lisado de proteína total. Após a electroforese, proteínas são imobilizadas nas paredes capilares por tratamento com luz ultravioleta, seguido pelo primário e secundário (peroxidase de rábano (HRP) conjugado) reforçada de incubação do anticorpo, cuja ligação é detectada através de quimioluminescência (ECL), gerando um sinal luminoso que pode ser capturado e gravado por uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD). A imagem digital pode ser analisada e quantificado (área do pico) utilizando o software. Este procedimento de alta taxa de transferência pode manipular 96 amostras de cada vez; é altamente sensível, com deteção de proteína na faixa de picograma; e produz resultados altamente reprodutível devido à automação. Todos estes aspectos são extremamente valiosos, quando a quantidade de amostras (por exemplo, amostras de tecidos e biópsias) é um fator limitante. A técnica tem aplicações mais amplas, incluindo rastreio de drogas ou anticorpos, descoberta de biomarker e fins de diagnóstico.
Introduction
Focalização isoelétrica capilar (cIEF) é um imunoensaio automatizado, baseado em capilar que resolve as proteínas com base em sua carga1,2,3. É altamente reprodutível e capaz de resolver proteínas e suas isoformas post-translationally modificadas rapidamente e quantitativamente. Apresenta uma alternativa aos métodos convencionais, como mancha ocidental. Enquanto mancha ocidental é muito bom para confirmar a presença de proteínas abundantes nas amostras prontamente acessíveis; variabilidade, consumo de tempo e quantificação exacta todos os presentes desafios, nomeadamente aquando da análise de amostras de tecidos biológicos. De fato, a variabilidade é um problema inerente na mancha ocidental, pois há várias etapas envolvidas, tais como carregamento e execução de geles de SDS-PAGE, transferência de proteínas na membrana, incubação com vários reagentes (EG., primário e secundário anticorpos, ECL) e desenvolvimento para filme de raio-x4. Atualmente, a técnica de mancha ocidental está melhorando com a implementação de gravação digital de sinais quimioluminescente (Western digital). Recentemente, um sistema automatizado de mancha ocidental foi desenvolvido, nomeadamente o capilar ocidental, que é um sistema mais mãos-livres e sem gel. O ensaio inteiro é automático após o carregamento de um prato de amostras (amostras com todos os reagentes necessários) para o sistema de3,4. O instrumento irá executar todas as etapas, tais como a separação de proteínas, imobilização de proteínas na parede capilar, a incubação do anticorpo, lava entre diferentes etapas e desenvolvimento e quantificação dos sinais de quimioluminescência. Assim, o procedimento de cIEF aqui apresentado fornece maior resolução e sensibilidade.
Este método é sensível, como os sinais podem ser gerados e quantificados de picogramas de proteínas1. A elevada sensibilidade com excelente reprodutibilidade torna esta tecnologia muito útil para a análise de amostras clínicas. Ele pode detectar bem como distinguir post translacional modificação (por exemplo, proteína fosforilada diferentes isoformas) de proteínas. Esta tecnologia tem sido usada com sucesso para dissecar diferentes sinalização percursos4,5 em estudos clínicos, com o objetivo de desenvolver novas terapêuticas em câncer3, e tem grande potencial para a descoberta de biomarcadores e drogas de proteína .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultura, estimulação e Lysis da pilha
Nota: Este método pode ser usado com muitos tipos de células. Para ilustrar o método, é descrito um exemplo usando células endoteliais da veia umbilical humana (HX).
- Cultura HX na gelatina-revestido, os pratos de Petri de 10 cm em meio basal de células endoteliais com suplementação adequada (consulte Tabela de materiais) e também contendo 5% FCS, fator de crescimento epidérmico (5 ng/mL), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF: 0,5 ng/mL), FGF básico (10 ng/mL), fator de crescimento semelhante à insulina (20 ng/mL), hidrocortisona (0,2 µ g/mL) e ácido ascórbico (1 µ g/mL).
- Morrer de fome as células durante a noite com meio basal de células endoteliais suplementado com FCS 1% e sem suplemento de fator de crescimento.
- Aspire todos médio, adicionar 2 mL de meio de cultura de células endoteliais sem fatores de crescimento (média de inanição) em um prato (controle) e, em seguida, adicionar 50 ng/mL VEGF em 2 mL de meio de cultura de fome em um segundo prato por 7 min.
- Aspire o meio e lavar as células 2 vezes com 10ml de temperatura PBS.
- Certifique-se os pratos de Petri estão no gelo e mantê-los lá desta etapa em diante.
- Adicione 250-400 µ l da mistura inibidor de protease aquosa contendo gelo frio lise tampão (Bicine/CHAPS; ver Tabela de materiais) e mistura de inibidor de DMSO (inibidores da fosfatase; ver Tabela de materiais) para cada placa de 10 cm. Agite a placa para assegurar uma cobertura adequada e mantê-lo por 10 min no gelo.
Nota: A concentração final de protease e o mix de inibidor de DMSO deve ser 1 x. - Raspe as células do prato com um raspador de célula e transferir para um tubo de microcentrífuga pre refrigerada. Pipetar acima e para baixo 5 vezes para lyse pilhas.
- Brevemente, proceda à sonicação as células a 4 ° C. Definir o sonicador da seguinte forma: número de ciclos = 5, poder = baixa, = 5 seg, OFF = 30 s. Esta etapa é incluída para quebrar os ácidos nucleicos e não para lyse pilhas.
Nota: Sonication deve ser suave para evitar a desnaturação das proteínas. - Vórtice do tubo para 5 s (não continuamente), 2 s em um tempo (3 vezes) e manter no gelo.
- Clarificar o lisado por centrifugação a 14.000 x g, durante 15 min a 4 ° C e, em seguida, imediatamente transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga pre-refrigerada limpo.
- Medir a concentração de proteína, usando um ácido Bicinchoninic (BCA) proteína ensaio kit4.
- Faça 10 µ l alíquotas, snap freeze em gelo seco ou nitrogênio líquido e armazenam a-80 ° C até o uso.
2. preparação da mistura amostra (cálculo para 150 µ l amostra Mix)
- Em primeiro lugar, preparar uma mistura de diluente de amostra adicionando 1 µ l do mix de inibidor de DMSO (estoque x 50) e 2 µ l de inibidores de protease (estoque x 25) para 47 µ l de diluente de amostra (ver Tabela de materiais), para que a concentração final de inibidores de protease e inibidores de DMSO torna-se 1 x. Em seguida, dilua o lisado de proteína usando o mix de diluente de amostra para obter a concentração desejada (ver passo 2.3).
- Preparar a mistura de inibidor de inibidor de protease/ampholyte/escada/DMSO adicionando 3.325 µ l padrão da escada (consulte a Tabela de materiais; estoque x 60), 6 µ l de inibidor de protease (x 25), 3 µ l de inibidor de DMSO (50x) a pré-mistura de ampholyte 137.675 µ l (ver tabela de de Materiais). Vórtice o tubo de pelo menos 15 s total, 5 s de cada vez (3 - 4 vezes) e manter no gelo.
- Misturar as soluções de passos 2.1 e 2.2 na proporção de 1:3, para que as concentrações finais de DMSO, inibidores da protease e a escada padrão pI se tornar 1 X, e as proteínas no capilar atingir a concentração final desejada (por exemplo, 50 µ g/mL foi usado para A Figura 2).
Nota: A concentração de proteína no capilar e bem são os mesmos. - Carregar 10 µ l de amostra mistura dentro do poço apropriado, de acordo com o layout de modelo de ensaio de placa 384 (consulte a etapa 3 e Figura 1) e manter a placa no gelo.
- Diluir o primário (pERK1/2, 01:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) e anticorpos secundários (1: 300) com diluente de anticorpo (ver Tabela de materiais) e pipetar 10 µ l de primária e 15 µ l de anticorpos secundários para cada poço.
Nota: em geral, maior concentração de anticorpos são necessários para os ensaios de cIEF em comparação com borrões ocidentais convencionais. - Misturar o Luminol e peróxido de XDR (proporção 1:1; Veja Tabela de materiais) juntos e pipetar 15 µ l em cada poço.
Nota: Misturar esses frescos de soluções cada vez antes de usar e manter no gelo. - Uma vez que todos os reagentes e amostras são pipetados na placa, centrifugar a placa a 2.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C, spin para baixo o líquido e remover as bolhas. Se as bolhas continuam a existir, removê-los manualmente usando a ponta da pipeta fina.
Nota: Não carregue mais de 20 µ l de amostra ou reagentes por alvéolo; caso contrário, a pipeta do instrumento não pode ser lavada corretamente. Certifique-se de seguir o manual de instruções do fabricante para preparar todos os reagentes.
3. criando um novo modelo de ensaio com Software do sistema (Figura 1)
- Abra o software do sistema e clique em "novo" do menu arquivo.
- Vá para o painel de layout e atribuir locais para os reagentes e amostras em uma placa-384. Usam até um máximo de 96 poços por placa de 384.
- Fazer uma atribuição de reagente, clicando em qualquer lugar um poço no bloco. Selecione um bloco de linha de 12 poços cada. Poços, por exemplo, de 1-12 ou 13-24, são atribuídos como um bloco por padrão.
- Vá para a barra de ferramentas do painel de layout e inserir um bloco linha vazia ou uma amostra, primária, secundária ou bloco de linha de luminol. Cada bloco é atribuído uma cor diferente, então eles são fáceis de diferenciar.
Nota: Quando você clicar em um poço, uma borda preta pode ser vista em torno do bloco onde o novo bloco será inserido no painel. Um bloco de linha também pode ser excluído. - Vá para o painel de protocolo e selecione um local de reagente no prato. Em seguida, clique em uma célula na coluna de amostra e selecione o reagente no menu suspenso.
- Dessa mesma forma, selecione os locais de reagente para o primário, secundário e o luminol para cada ciclo.
- Clique em células, um de cada vez, na coluna de anticorpo primário ou secundário e alterar os tempos de incubação, se necessário.
Nota: As notas de entrada para cada ciclo também podem ser adicionadas. - Adicione ciclos clicando no botão 'Adicionar' na seção de protocolo. 1 ciclo, 4 ciclos ou todos os ciclos (um máximo de 8 ciclos pode ser adicionado ao protocolo).
Nota: É possível copiar e colar informações de ciclo nesta etapa: selecione um ciclo, vá para editar e copiar e colar. - Insira as informações referentes à amostra, tais como a identidade dos anticorpos primários e secundários, seus números de catálogo e diluições, etc, no painel de modelo. Este é um passo opcional que é útil durante a análise após a execução.
- Salve o novo arquivo de ensaio. Antes de clicar no botão 'Iniciar', verificar rapidamente o layout para certificar-se de que tudo está correto.
4. protocolo para cIEF configuração do instrumento
- Conjunto de eletroforese de focalização isoelétrica capilar condições de separação. Estes devem ser 15.000 µW e 40 min, e o tempo de imobilização de UV deve ser 80 s. No entanto, o tempo de imobilização de UV pode ser definido dentro do intervalo de 80-140 s e pode precisar de ser otimizado para a proteína de interesse.
Nota: Um ponto de tempo para a imobilização de UV pode ser definido para cada ciclo, mas não para cada capilar. - Conjunto de lavagem lavagens 1 a 2, para 150 s cada lavagem (padrão) e a incubação do anticorpo primário por 120 min.
- Conjunto de lavagem lavagens de 2 a 2, para 150 s cada lavagem (padrão) e a incubação do anticorpo secundário por 60 min.
- Conjunto de lavagem 3, que deve ser 2 lavagens, para 150 s cada lavagem (padrão).
- Definir os tempos de exposição quando quimioluminescência será detectada; Estes devem ser 30, 60, 120, 240, 490 e 960 s. Todos os passos (1-8), realizarão em um único capilar.
5. executar o arquivo de ensaio
- Depois que tudo estiver pronto, clique em Iniciar para começar a correr. O software irá pedir-lhe para remover os resíduos, para reabastecer a água e a caixa capilar, para adicionar anolito e catholyte para a bandeja do recurso, para adicionar o tampão de lavagem e, finalmente, para carregar a placa para a bandeja de refrigeração da amostra.
Nota: Remova a tampa da caixa capilar, mas não remova a tampa da placa de ensaio. A tampa da placa pode ser removida automaticamente pelo instrumento quando necessário. Isto ajuda a prevenir a evaporação de reagente. - Alguns minutos após a execução tem sido iniciada, uma barra de status do instrumento será exibida na tela do computador. Mensagens de status e barras de progresso podem ser vistas correspondente ao estágio atual do instrumento.
Nota: Inicialmente, o instrumento irá verificar se está tudo correto antes prosseguindo para pipetar o anolito e catholyte para a bandeja de separação, escolhendo o primeiro bloco de 12 capilares, retirar a tampa da placa e colocar as amostras da amostra placa para os capilares e então finalmente na câmara de separação por eletroforese. - Clique sobre a tela de Resumo de execução para ver dois painéis: status e separação. Os usuários podem exibir o andamento da execução, e filmes da separação (os 12 capilares de cada ciclo) podem ser armazenados quando o passo de electroforese de cada ciclo é concluído. Para observar a separação eletroforese em um capilar, reproduzir o filme de separação para o capilar clicando o ciclo desejado e, em seguida, o botão de play no painel de controle.
- O arquivo de execução pode ser armazenado automaticamente após a conclusão da execução.
6. analisar os dados (Figura S1)
- Abra o arquivo executado e selecione a guia de tela de análise. Na Figura S1A, os dados mostrados (picos) no gráfico de exemplo são do capilar selecionado (ou seja, 4th capilar do ciclo 1).
- Clique em Editar e, em seguida, análise (Figura S1B). Nesta fase, os usuários podem alterar o intervalo de pI, aplicar o padrão de pI apropriado para um determinado experimento, adicionar um ajuste de pico e adicionar um nome de pico.
Nota: Quando usar um pH 5-8 ampholyte premix (como é o caso aqui), a escada padrão recomendada para usar é um com peptídeos fluorescente etiquetados com pIs de 4.9 6.0, 6.4, 7.0 e 7.3, e ao usar um pH premix de 3-10, a escada recomendada é um com pIs de 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 e 7.3. 2 - Os resultados são exibidos na guia de picos; os valores exibidos para as amostras são posição, pI, pico altura e área, % área, largura de pico e sinal de ruído (S/N) (Figura S1C). Escolha quais dados usar e exportar os dados para posterior análise.
Nota: Os dados só podem ser exportados depois etiquetar o pico (Figura S1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design de um novo ensaio: Um layout de placa de ensaio é mostrado na figura 1A. Màxima, 96 poços podem ser usados na placa de 384 em blocos de 12 poços para cada condição (anticorpo). Cada bloco de 12 poços pode começar na A1-A12 ou A13-A24. Linhas de código de cores permitem distinguir amostras ou reagentes de um para o outro. No modelo de ensaio (figura 1B), as informações pertinentes para que pode ser armazenado ensaio específico, que pode ser usado em fases posteriores da análise do resultado. A Figura 1 mostra o resumo do protocolo.
Deteção da proteína fosforilada e unphosphorylated extracelular regulamentado da quinase (pERK1/2 e ERK1/2) em HUVEC lisado estimulada com VEGF: Em geral, post proteínas translationally modificadas, tais como fosfoproteínas, são difíceis de detectar por causa de sua baixa quantidade e natureza transitória e ausência de anticorpos específicos. Vascular estimulação do fator de crescimento endotelial (VEGF) fome de soro a seguir ativa receptores tirosina quinase (VEGFR2) que leva a ativar o caminho de MAPK e resulta em fosforilação de ERK. Para experimentos usando HX, lysates de células estimuladas com ou sem VEGF para 7 min pode ser usada, conforme mostrado na Figura 2. Figura 2A mostra a electroferograma de pERK1/2 de ± lysates VEGF-estimulado. É evidente que, com VEGF há muito alta indução de proteínas fosforiladas (picos delineadas em vermelho). A inserção mostra o controle de carregamento endógena HSP 70 (Figura 2A de encastrar), indicando o carregamento semelhante de amostras para amostras não tratadas e tratadas. Em immunoblot convencional (Figura 2painel esquerdo) apenas duas bandas foram detectados (phosphoERK1; pERK1 e pERK2). No entanto, pERK1/2 proteínas foram resolvidas em 4 picos para ppERK2, pERK2, ppERK1 e pERK1 pelo cIEF análise (Figura 2A). Da mesma forma, a Figura 2B mostra a electroferograma de ERK1/2 de ± lysates VEGF-estimulado. A inserção mostra o mesmo controle de carregamento utilizado em paralelo. Um convencional immunoblot mostra apenas duas bandas correspondentes ERK1 e ERK2 (Figura 2o painel direito) Considerando que, com o cIEF, o pERK1/ERK2 foi resolvido em 6 picos (Figura 2B) correspondente a todos os 4 diferentes fosforilada picos e 2 picos unphosphorylated, ERK1 e ERK2. Isto demonstra uma das vantagens com cIEF, designadamente que isoformas de proteínas podem ser resolvida e avaliadas tanto qualitativa como quantitativamente. Além disso, é possível obter informações quantitativas das isoformas fosforiladas de um anticorpo dirigido para o núcleo de proteína, ao invés da modificação pós-traducional.
Figura 1 : Concepção de layout de placa de ensaio no software. (A) de layout de placa 384 definindo a posição de todos os reagentes. Código de cores 12 linhas bem mostrando a localização de amostras, anticorpos e reagentes quimioluminescente. (B) um ensaio modelo mostrando informações relevantes com bem individual. (C) protocolo mostrando todas as informações relevantes para o ciclo 1 e 2. No ciclo 1 (12 capilares como mostrado na caixa colorida), o instrumento tem amostra de A1 (poços de A1-A12) seguiram por anticorpo primário de B1 anticorpo secundário (poços de B1-B12), de D1 (poços de D1-D12) e finalmente luminol:peroxide XDR de J1 (poços de J1-J12). Na 2ªciclo, tudo é o mesmo que o primeiro ciclo, exceto que ele toma o anticorpo primário de C1 (poços de C1-C12). Esta figura foi modificada com a permissão de Aspinall-O'Dea et al . 20152. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Deteção das proteínas fosforiladas e totais de Mitogen-Activated proteína quinase (ERK 1/2) pelo cIEF ensaio e ensaio immunoblot tradicional. () Electroferograma representante para pERK1/2 e proteínas em HX tratados ±VEGFA seguido de ensaio cIEF, vasculhados a procura de anticorpos pERK1/2. (Unstimulated) linha azul e linha vermelha (estimulada). Picos de mostram as isoformas de regalia/2 diferentemente fosforiladas separadas com base em seus pontos isoelétrico. A inserção mostra o controle endógeno HSP70 executado em paralelo com a mesma lisado. (B) representante electroferograma mostrando ERK1/2 ± VEGFA-estimulada lisado. A inserção mostra o controle endógeno HSP70 que foi executado em paralelo. Para electroferograma, foram utilizadas concentrações de lisado 50 µ g/mL, que equivale a 20 ng de proteínas totais no capilar. (C) immunoblotting convencional para proteínas ERK1/2 sobre o ±VEGFA (50 ng/mL) e pERK1/2 estimulou o lisado celular total HUVEC. 10 µ g do total lisado por raia foi usado para immunoblotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar S1 Figura: fases da análise do resultado
(A) exibir os resultados de um capilar de interesse. (B) Editar/adicionar parâmetros diferentes para o arquivo de ensaio. (C) é possível adicionar nomes de pico para os picos antes de exportar dados para uma análise mais aprofundada. Clique aqui para baixar esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sensibilidade e resolução de proteínas são cruciais para a investigação de proteomic em amostras biológicas. Há grande valor em ser capaz de detectar as proteínas que estão presentes em quantidades nas células. cIEF pode oferecer melhorou a sensibilidade e resolução para a detecção de proteínas e suas isoformas4.
Esta tecnologia tem sido usada com sucesso em muitos proteomic pesquisa relatórios5,6,7. Ainda assim, várias limitações são associadas, tais como o fato de que nem todos os anticorpos primários podem dar um sinal, mesmo se eles trabalham muito bem em immunoblots convencional. Não há, ainda, nenhuma lista de anticorpos validados mostrado para funcionar no cIEF, uma vez que esta técnica é bastante nova. Finalmente, o instrumento não pode lidar com menos de 12 amostras ou mais de 96 amostras de cada vez.
cIEF é uma técnica alternativa para immunoblotting convencional, mas não pode dar resultados idênticos. cIEF tem demonstrado ser muito superior ao convencional immunoblotting em termos de sensibilidade e resolução. Além disso, cIEF é alto throughput, robusto, automático, robotizado, e altamente sensível, produzir sinais de menos de 25 células dependendo da proteína analisada1. É quantitativa e altamente reprodutível, como manipulação é minimizada. A detecção de várias isoformas de proteínas de tamanhos semelhantes pode ser facilmente resolvida. Assim, o mesmo anticorpo pode dar informações quantitativas sobre as formas de proteína fosforilada e unphosphorylated de quantidades nanograma da amostra4. Embora ambos immunoblot convencional e cIEF dependem de anticorpo baseado deteção quimioluminescente, existem algumas diferenças importantes, tais como em immunoblotting convencional, as proteínas são separadas com base em seu peso molecular, Considerando que no cIEF, separação baseia-se na acusação de proteína. Finalmente, as proteínas são desnaturadas em immunoblot, Considerando que elas são preservadas em seu estado nativo em cIEF. Este último ponto é a razão por que o mesmo anticorpo podem ou não trabalhar em ambos os métodos.
Muitos diferentes estudos têm demonstrado que a aplicação do cIEF para estudar a fosforilação de proteínas de amostras de pacientes humanos3, humano cólon câncer amostras4,8, rato tumor tecido9ou várias linhas de células 10. adopção deste método poderia promover o rápido progresso na investigação de proteomic em muitos campos tais como a descoberta da droga, fins de diagnóstico, descoberta de biomarcadores e estudos de sinalização.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
O autor não tem nenhuma divulgações.
Acknowledgments
O autor agradece Prof Lena Claesson-galês, Universidade de Uppsala, na Suécia, o seu apoio para o desenvolvimento deste projeto. Além disso, o autor agradece Ross Smith e Lena Claesson-galês, Universidade de Uppsala por sua leitura crítica e sugestões para melhorar o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
