Environment

ऑर्गेनोक्लोरीन कीटनाशकों के संपर्क में हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/56800

Summary

हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर पर्यावरणीय ऑर्गेनोक्लोरीन कीटनाशकों (ओसीपी) के प्रभाव को समझना मेटाबोलिक विकारों के कारण ओसीपी के तंत्र की खोज में महत्वपूर्ण है। यह पेपर हेपेटिक माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत करता है।

Abstract

यह पेपर हेपेटोसाइट्स में पर्यावरणीय ऑर्गेनोक्लोरीन कीटनाशकों (ओसीपी) के कारण मेटाबोलिक विकारों के कारण बेहतर समझने के लिए हेपेटिक माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत करता है। हेपजी2 कोशिकाओं को सामान्य आबादी में आंतरिक जोखिम की समकक्ष खुराक पर 24 घंटे के लिए 24 घंटे के लिए ए-हेक्साक्लोरोसाइक्लोएक्लाजेन (ए-एचसीएच) के संपर्क में किया गया था। माइटोकॉन्ड्रिया के नुकसान को दिखाने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) द्वारा हेपेटोसाइट्स में अल्ट्रास्ट्रक्चर की जांच की गई थी। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता, एडेनोसाइन 5'-ट्रिप्होस्फेट (एटीपी) स्तर, ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और हेपजी2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। माइटोकॉन्ड्रिया फ्लोरेसेंस तीव्रता माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट जांच से दागने के बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ देखा गया। लूसिफ़ेरिन-लूसिफ़ेरेस प्रतिक्रिया का उपयोग एटीपी स्तर निर्धारित करने के लिए किया गया था। एमएमपी को cationic डाई जेसी-1 द्वारा पता लगाया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री के तहत विश्लेषण किया गया था। ओसीआर को एक एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर के साथ मापा गया था। संक्षेप में, इन प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया नुकसान की जांच करने के साथ हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने में किया गया था।

Introduction

स्वास्थ्य पर ऑर्गेनोक्लोरीन कीटनाशकों (ओसीपी) के प्रभाव, जैसे प्रजनन हस्तक्षेप, प्रतिरक्षा विषाक्तता, मेटाबोलिक परिवर्तनों का पहले अध्ययन किया गया है^1,^,^2,^,^3। सेलुलर मेटाबोलिज्म का पता लगाने और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का पता लगाने के तरीकों ने वैज्ञानिकों को माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन(यानी)की भूमिका को समझने में सक्षम बनाया है । , माइटोकॉन्ड्रियल स्टेट3 स्तर, लैक्टेट, पायरुवेट, लैक्टेट-टू-पाइरुवेट अनुपात, कोएंजाइम क्यू10, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटोन रिसाव, बायोनेरेग्नेटिक्स, बायोजेनेसिस, और गतिशीलता) उम्र बढ़ने, मोटापा, मधुमेह, हृदय समारोह, कैंसर, और सुरक्षा विषाक्तता^4,^,^5,^,^6,^,⁷जैसे क्षेत्रों में। इस पेपर में, हम ओसीपी के कारण माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का आकलन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।

हमने मानव के आंतरिक जोखिम के बराबर खुराक पर 24 घंटे के लिए हेपजी2 कोशिकाओं को एक प्रतिनिधि ओसीपी (ए-एचसीएच) में उजागर किया। सबसे पहले, टेम को न्यूक्लियी, माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम⁸जैसे हेपेटोसाइट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चर का पालन करने के लिए लागू किया गया था। साधारण माइक्रोस्कोप की तुलना में, TEM कोशिकाओं और सेल घटकों (सेल लाइनों या ऊतक), आकृति विज्ञान, रासायनिक संरचना, साथ ही प्राकृतिक या कृत्रिम सामग्री के कार्य की 2डी और 3डी अल्ट्रा-स्ट्रक्चर का पता लगाने में सक्षम बनाता है जो आधुनिक विज्ञान और प्रौद्योगिकी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता, एडेनोसाइन 5'-ट्रिप्होस्फेट (एटीपी) स्तर, ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और हेपजी2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। मिंटो-ट्रैकर ग्रीन एक माइटोकॉन्ड्रिया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोब है जिसका उपयोग लाइव सेल माइटोकॉन्ड्रियल-विशिष्ट फ्लोरोसेंट स्टेनिंग के लिए किया जा सकता है। हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रिया को मिटो-ट्रैकर ग्रीन सॉल्यूशन और माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता, संख्या और पैटर्न से दाग दिया गया था, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 9 के साथ^देखागया था। माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग जीवित कोशिकाओं को दागने के लिए किया जा सकता है। रोडामाइन 123 या जेसी-1 की तुलना में, माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट जांच माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर निर्भर नहीं करती है। एटीपी का स्तर एक लूसिफ़ेरेस-लूसिफ़ेरिन किट द्वारा निर्धारित किया गया था और प्रोटीन एकाग्रता द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। एटीपी परख किट आम समाधान, कोशिकाओं या ऊतकों में एटीपी के स्तर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह किट फ्लोरोसेंस उत्पन्न करने के लिए फ्लोरोसेसिन द्वारा उत्प्रेरित जुगनू लूसिफ़ेरेस पर आधारित है, जब एटीपी को ऊर्जा प्रदान करने की आवश्यकता होती है। जब जुगनू लूसिफ़ेरेस और फ्लोरोसीन अत्यधिक होते हैं, तो एक निश्चित एकाग्रता सीमा में, फ्लोरेसेंस की पीढ़ी एटीपी की एकाग्रता के आनुपातिक होती है। इसके अलावा इस किट को खासतौर पर एटीपी के केमिल्यूमिनेसेंस को ऑप्टिमाइज करने के लिए डिजाइन किया गया है। एटीपी, सबसे महत्वपूर्ण ऊर्जा अणुओं के रूप में, कोशिकाओं की विभिन्न शारीरिक या रोग प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एटीपी के स्तर में परिवर्तन सेल समारोह में दोषों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा उत्पादन। आमतौर पर एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस या कुछ विषाक्त स्थिति में, सेलुलर एटीपी का स्तर ¹⁰कम हो जाता है। जेसी-1 के साथ एमएमपीएस परख किट एक किट है जो कोशिकाओं, ऊतकों या शुद्ध एमएमपी का जल्दी और संवेदनशीलता से पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट जांच के रूप में जेसी-1 का उपयोग करती है। इसका उपयोग एपोप्टोसिस का जल्दी पता लगाने के लिए किया जा सकता है। cationic डाई जेसी-1 एक फ्लोरोसेंट जांच है जिसका उपयोग एमएमपी का पता लगाने के लिए किया जाता है जिसका विश्लेषण हरे और लाल फ्लोरेसेंस अनुपात के परिवर्तनों द्वारा इंगित प्रवाह साइटोमेट्री के तहत किया जा सकता है। जब एमएमपी अधिक होता है, तो जेसी-1 को माइटोकॉन्ड्रिया के मैट्रिक्स में एक बहुलक (जे-एग्रीगेट्स) बनाने के लिए एकत्रित किया जाता है, जो लाल फ्लोरेसेंस पैदा करता है। जब एमएमपी कम होता है, तो जेसी-1 जमा नहीं हो सकता है, और मोनोमर बनाता है जो हरे रंग की फ्लोरेसेंस¹¹का उत्पादन करता है। इसलिए लाल और हरे रंग के फ्लोरेसेंस का अनुपात एमएमपी के स्तर को प्रतिबिंबित कर सकता है। कोशिकाओं का ओसीआर सामान्य सेलुलर कार्य का एक महत्वपूर्ण संकेतक है¹². यह माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन पर शोध करने के लिए एक पैरामीटर माना जाता है। सेल मिटो तनाव परीक्षण किट माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के प्रमुख मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए एक स्थिर विधि प्रदान करता है। किट गुणवत्ता नियंत्रण और भविष्य कहनेवाला अभिकर्मक के साथ ही सेल माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण प्रदर्शन के लिए एक मानक विधि प्रदान करता है । इसका उपयोग प्राथमिक कोशिकाओं, सेल लाइनों, निलंबित कोशिकाओं और आइलेट्स, नेमाटोड, खमीर और अलग माइटोकॉन्ड्रिया सहित सभी कोशिका प्रकारों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

ओसीआर माप कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति या परिवर्तन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यह सांस लेने की आधार रेखा, प्रोटोन रिसाव, अधिकतम श्वसन, एटीपी कारोबार और आरक्षित क्षमता का पता लगाने के लिए एक बाह्राश प्रवाह विश्लेषक के साथ निर्धारित किया गया था । संक्षेप में, ओसीआर के बेसलाइन माप के बाद, ओसीआर को क्रमिक रूप से ओलिगोमाइसिन (एटीपी कपलर), एफसीसीपी (माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन अनकूपलर) और एंटीमाइसिन ए/रोटेनोन (ऑक्सीजन खपत का अवरोधक) प्रति अच्छी तरह से जोड़ने के बाद पता चला ।

विट्रो में हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए अधिक विशिष्ट प्रोटोकॉल के विकास को सुविधाजनक बनाने के प्रयास में, हम यहां टेम, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, ल्यूमिनोमीटर, फ्लो साइटोमेट्री और एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया क्षति से संबंधित प्रतिकूल परिणामों का अध्ययन करने में भविष्य के आवेदन के साथ प्रयोग प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगों और प्रयोग प्रोटोकॉल प्रासंगिक दिशा निर्देशों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया और नानजिंग मेडिकल विश्वविद्यालय की स्थानीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. TEM द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर

HepG2 कोशिकाओं का संग्रह
1. 100 मिमी व्यंजनों में बीज हेपजी2 कोशिकाएं। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂पर स्टोर करें।
2. 1.5 mLEP ट्यूब में 0.25% EDTA के साथ कोशिकाओं को पचाने।
3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्याग दें।
4. 4-6 x 10⁵ HepG2 कोशिकाओं को ले लीजिए।
2 घंटे के लिए पिपेट और 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के साथ 5% ग्लूटारल्डिहाइड (सॉल्वेंट: डबल डिस्टिल्ड वॉटर) का 1 मिलियनल जोड़ें।
फॉस्फेट बफर (जिसमें एनए 2 एचपीओ 4,_केएच₂पीओ_4,एनएसीएल और केसीएल, पीएच_7.4),15 मिनट प्रत्येक के 1 एमएल के 4 बदलावों में जोड़ें और धोएं। पिपेट के साथ फॉस्फेट बफर को चूसें।
2 घंटे से काले नमूने के लिए 1% ऑस्मियम (सॉल्वेंट: डबल डिस्टिल्ड वॉटर) और 2 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 माइक्रोन जोड़ें।
सावधानी: ओस्मियम अत्यधिक विषैला और अस्थिर पदार्थ है। इसे दवा कैबिनेट में सावधानी से संचालित किया जाना चाहिए।
फॉस्फेट बफर के 1 एमएल के 2 बदलावों में जोड़ें और धोएं, प्रत्येक में 5 मिनट। फॉस्फेट बफर को चूसें।
2 घंटे के लिए 1.5 एमएल ईपी ट्यूब में 2% यूरेबिल एसीटेट सॉल्यूशन (सॉल्वेंट: डबल डिस्टिल्ड वॉटर और एसिटिक एसिड) में दाग।
निर्जलीकरण और 50% एसीटोन, 70% एसीटोन, 90% एसीटोन (सॉल्वेंट: डबल आसुत पानी), पूर्ण एसीटोन के 2 परिवर्तन, 15 मिनट प्रत्येक के माध्यम से जलमग्न।
आरटी में 1.5 घंटे के लिए 2 बूंदों एसीटोन (100%) / एम्बेडिंग एजेंट (1:1) में प्रवेश करें। Epon812 एम्बेडिंग एजेंट, नुस्खा इस प्रकार है: ए: Epon812, 62 एमएल और डीडीएसए, 100 एमएल; बी: Epon812, 100 एमएल और एमएनए 89 एमएल। A:B=2:8 (v:v, सर्दियों में), ए: बी = 1:9 (v:v, गर्मियों में)। एम्बेडिंग मोल्ड्स (चेकर ग्रिड के साथ नरम प्लास्टिक प्लेट) में एम्बेडिंग।
12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 12 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस और फिर 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर क्रमिक रूप से इनक्यूबेट।
अल्ट्राथिन सेक्शन मशीन और टेम (2 माइक्रोम और 500 एनएम) द्वारा अल्ट्राथिन सेक्शन (सबसे बड़ा क्षेत्रफल 0.5 मिमी × 0.3 मिमी से अधिक नहीं हो सकता) को तैयार करें और निरीक्षण करें।

2. माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता का पता लगाने

बीज 2x 10⁴HepG2 कोशिकाओं में 6 अच्छी तरह से प्लेटें। 24 घंटे के लिए एचसीएच जोड़ें।
1 एमएम माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट जांच की अंतिम एकाग्रता तैयार करने के लिए निर्जल डीएमएसओ जोड़ें।
6-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोब सॉल्यूशन (अंतिम एकाग्रता: 200 एनएम) जोड़ें, 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट जांच समाधान निकालें और इमेजिंग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा तैयार सेल कल्चर मीडियम (डीएमईएम) जोड़ें।
फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप (10x) द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरेसेंस का निरीक्षण करें। पता लगाने पर अधिकतम उत्तेजन तरंगदैर्ध्य 490 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 516 एनएम है।

3. सेलुलर एटीपी स्तर की परख

6-अच्छी प्लेटों में बीज HepG2 कोशिकाओं। 24 घंटे के लिए एचसीएच जोड़ें।
6-अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में लूसिफ़ेरेस-लूसिफ़ेरिन एटीपी परख किट से लाइसिस बफ़र्स के 200 माइक्रोन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, नई ट्यूबों में पिपेट के साथ सुपरनेट एकत्र करें।
एटीपी डिटेक्शन बफर के रूप में 1: 5 के अनुपात में एटीपी कमजोर पड़ने के साथ एटीपी डिटेक्शन रिएजेंट को पतला करें।
मानक वक्र निर्धारण तैयार करें: एटीपी लाइसिस बफर द्वारा एटीपी मानक समाधान के 0.5 एमएम को 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 माइक्रोनएम में पतला करें।
आरटी में 5 मिनट के लिए 96-वेल प्लेट में एटीपी डिटेक्शन बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें, और सेल के सुपरनैंट के 100 माइक्रोन जोड़ें, एक ल्यूमिनोमीटर (केमिल्यूमिनेसेंस डिटेक्टर) द्वारा पता लगाएं। मानक वक्र के बावजूद एटीपी एकाग्रता (nmol/L) की गणना करें।
मल्टीमोड रीडर के साथ बीसीए प्रोटीन परख किट द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का पता लगाएं।
1. मानक वक्र निर्धारण की तैयारी: प्रोटीन मानक समाधान के 5 मिलीग्राम/एमएल को 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 और 0.5 मिलीग्राम प्रति मिलीग्राम प्रति एमएल डबल आसुत पानी से पतला करें।
2. 96-वेल प्लेट में सेल के सुपरनटेंट का 1 माइक्रोन जोड़ें और डबल डिस्टिल्ड पानी के 19 माइक्रोन जोड़ें।
3. प्रत्येक अच्छी तरह से बीसीए डिटेक्शन सॉल्यूशंस के 200 μL जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। 562 एनएम के साथ एक मल्टीमोड रीडर द्वारा ओडी (ऑप्टिकल घनत्व) मूल्य का पता लगाएं। मानक वक्र के बावजूद प्रोटीन एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) की गणना करें।
प्रति एमजी प्रोटीन एकाग्रता एटीपी सामग्री को सही करें (यूनिट: एटीपी एकाग्रता/प्रोटीन एकाग्रता, एनएमोल/एमजी)।

4. जेसी-1 द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) मूल्यांकन

6-अच्छी प्लेटों में वरीयता प्राप्त हेपजी2 कोशिकाओं को इकट्ठा करें। 1.5 एमएल ईपी ट्यूब में 0.25% ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को पचाएं, 3 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सुपरनैंट को त्यागें और कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
भंवर और मिश्रण करने के लिए आसुत पानी के 8 मिलील के लिए जेसी-1 (200X) के 50 μL जोड़ें। जेसी-1 (5X) धुंधला रंगाई बफर के 2 एमएल को जेसी-1 डिटेक्शन सॉल्यूशन के रूप में जोड़ें।
कोशिका संस्कृति माध्यम के 0.5 मिलील और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए जेसी-1 डिटेक्शन सॉल्यूशन के 0.5 मिलील के मिश्रण के साथ इनक्यूबेट कोशिकाएं।
4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्याग दें।
जेसी-1 (1X) डाइंग बफर के 1 एमएल के 2 बदलावों में कुल्ला, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 600 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज। और सुपरनिटेंट को त्याग दें।
जेसी-1 (1X) डाइंग बफर के 0.5 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करें, हरे और लाल फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण करें। जब जेसी-1 बहुलक का पता चल जाए तो एक्सेम्बिटेशन लाइट को 490 एनएम और एमिशन लाइट को 530 एनएम तक सेट करें। जब जेसी-1 बहुलक का पता चलता है, तो उत्तेजन प्रकाश को 525 एनएम और उत्सर्जन प्रकाश को 590 एनएम तक सेट करें।

5. ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) माप

4500 कोशिकाओं/100 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से 4500 कोशिकाओं के घनत्व पर 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट में बीज HepG2 कोशिकाओं। 24 घंटे के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से कवर कोशिकाओं को सुनिश्चित करें।
पिछले साहित्य¹³के अनुसार, तैयार अभिकर् ती की उचित मात्रा को उपयुक्त इंजेक्शन बंदरगाह में जोड़ें। पोर्ट ए: ओलिगोमाइसिन (एटीपी कपलर) का 25 माइक्रोन 1 माइक्रोन; पोर्ट बी: एफसीसीपी के 25 माइक्रोन 0.75 माइक्रोन (इलेक्ट्रॉनिक थ्रॉटल कंट्रोल, ईटीसी एक्सीलेटर); पोर्ट सी: 25 माइक्रोन 0.5 के μM एंटीमाइसिन ए/रोटेनोन (माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधक ए और माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधक बी)।
उपयोग करने के लिए तैयार होने तक कोई सीओ₂ के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कारतूस स्टोर करें।
प्रत्येक अच्छी तरह से चल रहे माध्यम को हटाने और नए DMEM को जोड़ने के माध्यम से सेल प्लेट का एक मध्यम परिवर्तन करें। प्रत्येक कुएं के लिए अंतिम मात्रा 180 माइक्रोन है।
परख से पहले 1 घंटे के लिए कोई सीओ₂ के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेल प्लेट स्टोर करें।
सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से ओसीआर रिकॉर्ड करें।
1. ओसीआर सॉफ्टवेयर खोलें।
2. एप्स ड्रॉप-डाउन मेन्यू में सेल माइटो स्ट्रेस टेस्ट किट चुनें।
3. स्टार्ट ऐप बटन पर क्लिक करें।
4. रन स्ट्रेस टेस्ट बटन पर क्लिक करें। सेल स्ट्रेस टेस्ट सेटअप स्क्रीन दिखाई देती है।
5. निम्नलिखित चरण करें:
  1. सेल सीडिंग # बॉक्स में प्रति अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या दर्ज करें।
  2. औसत बेसल ओसीआर बॉक्स में औसत ओसीआर दर्ज करें।
  3. प्रत्येक अभिकर् तार के लिए अंतिम कार्य एकाग्रता दर्ज करें और अभिकर् तारों को इंजेक्ट करें।
    नोट: सेल सीडिंग एकाग्रता के लिए अनुकूलन करते समय अनुकूलन परख चलाने से पहले सेल के लिए औसत बेसल ओसीआर मूल्य का पता लगाया जाना चाहिए था।
  4. नेक्स्ट बटन पर क्लिक करें। समूह जानकारी स्क्रीन दिखाई देती है।
  5. एक रंग चुनने और एक नाम देने के माध्यम से असाइन किए गए कुओं के लिए एक समूह आवंटित करें, और फिर उपयुक्त कुओं पर क्लिक करें।
    नोट: सेल मिटो स्ट्रेस टेस्ट के चलने से पहले विभिन्न समूहों को विभिन्न उपचारों के रूप में परिभाषित किया गया है। स्ट्रेस टेस्ट चलने पर माइक्रोप्लेट के सभी कुओं को एक ही रिएजेंट इंजेक्शन मिलेगा।
  6. नेक्स्ट बटन पर क्लिक करें। स्ट्रेस टेस्ट इंजेक्शन लेआउट स्क्रीन दिखाई देती है।
  7. स्टार्ट पर क्लिक करें। अभी एनालाइजर पर स्ट्रेस टेस्ट चलता है। जब रन खत्म हो जाता है, तो सॉफ्टवेयर में बिंदु एस का पालन करें, कारतूस और सेल प्लेट को हटा दें और त्यागें।

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Representative Results

एचसीएच के संपर्क में आने वाली हेपजी2 कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया क्रिस्टे स्पष्ट रूप से क्षतिग्रस्त हो गए थे। बिखरे हुए माइटोकॉन्ड्रिया को स्पष्ट रूप से विस्तारित, अनियमित आकार, और माइटोकॉन्ड्रियल रिज अपेक्षाकृत असामान्य माइटोकॉन्ड्रियल वास्तुकला(चित्रा 1)के साथ गायब हो गया था।

औसत माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरेसेंस तीव्रता, जो माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिनिधित्व करती है, हेपजी2 कोशिकाओं में कमी आई है जो ए-एचसीएच(चित्रा 2)के साथ-साथ एटीपी स्तर(चित्रा 3)के संपर्क में है। फ्लोरेसेंस तीव्रता और एटीपी स्तर में वृद्धि के साथ धीरे-धीरे कम हो गया। संभवतः, माइटोकॉन्ड्रिया संख्या में कमी, या क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया, मनाया माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता का कारण बना, और फलस्वरूप एटीपी का उत्पादन कम हो गया।

फ्लो साइटोमेट्री के परिणामों ने यह दर्शाया कि नियंत्रण(चित्र 4)की तुलना में लाल/हरे जेसी-1 फ्लोरेसेंस का अनुपात काफी कम था। एचसीएच एक्सपोजर के बाद हेपजी2 कोशिकाओं की ओसीआर को खुराक-निर्भर तरीके से कम कर दिया गया था। नियंत्रण समूह के साथ तुलना में, बेसल श्वसन दर, प्रोटोन रिसाव, अधिकतम श्वसन क्षमता, और एटीपी कारोबार में काफी कमी आई है हेपजी2 कोशिकाओं में 1-HCH(चित्रा 5)के संपर्क में । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन को एचसीएच एक्सपोजर के बाद ख़राब कर दिया गया था ।

इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरण पूरक चित्र 1में दर्शाए गए थे .

चित्रा 1:हेपजी2 कोशिकाओं के प्रतिनिधि टेम माइक्रोग्राफ ए-एचसीएच (ए: 6000 ×, बी: 25000 ×) के संपर्क में हैं। विशिष्ट नुकसान ने हल्का बढ़े हुए माइटोकॉन्ड्रिया (एम), इलेक्ट्रॉन-ल्यूसेंट मैट्रिस, क्षतिग्रस्त क्रिस्टे और ढीले ऑर्गेनेल अंतराल दिखाए। एम: माइटोकॉन्ड्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2:हेपजी2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस का पता लगाना 13- एचसीएच के साथ इलाज किया^गया। माइटोकॉन्ड्रिया (ए) की मात्रा, स्थान और फ्लोरेसेंस तीव्रता फ्लोरेसेंस सूक्ष्म छवियों में दिखाई गई थी और माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस तीव्रता का मात्रात्मक स्तर माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रति सेल (बी)पर आधारित था। *: पी एंड एलटी; 0.05, ***: नियंत्रण की तुलना में पी एंड एलटी; 0.001। प्रत्येक डेटा बिंदु तीन अलग-अलग प्रयोगों से मतलब ± एसईएम था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3:HepG2 कोशिकाओं में एटीपी स्तर¹³. ***: पी & 0.001 नियंत्रण के साथ तुलना में, ##: पी & 0.01 की तुलना में 10 एनजी/एमएल एनए-एचसीएच डेटा को तीन अलग-अलग प्रयोगों के मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4:जेसी-1 धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्री¹³द्वारा एमएमपी पर प्रभाव। (क) फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट्स । वाई-एक्सिस ने लाल से हरे रंग के फ्लोरेसेंस का अनुपात दिखाया । पीई: लाल फ्लोरेसेंस, फिटसी: ग्रीन फ्लोरेसेंस। (ख).**: नियंत्रण के साथ तुलना में पी & 0.01 । प्रत्येक डेटा बिंदु तीन अलग-अलग प्रयोगों से मतलब ± एसईएम था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 5:सेलुलर ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) का पता लगाना। (क) सेलुलर ओसीआर पर एचसीएच के प्रभाव को एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर द्वारा मापा गया था । चार अवधियां सेलुलर बेसल श्वसन दर, एटीपी-सिंथेस-बाधित दर, अधिकतम अकूपल दर, और रोटेनोन-या एंटीमाइसिन-ए-बाधित दर का प्रतिनिधित्व करती हैं। (ख) बेसलाइन, प्रोटोन रिसाव, अधिकतम श्वसन क्षमता, एटीपी टर्नओवर और सर्व क्षमता के लिए ओसीआर परिणामों के मात्रात्मक हिस्टोग्राम । *: पी एंड एलटी; 0.05, **: पी एंड एलटी; 0.01, ***: नियंत्रण की तुलना में पी एंड एलटी; 0.001। प्रत्येक डेटा बिंदु तीन अलग-अलग प्रयोगों से मतलब ± एसईएम था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1:प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरण। (क) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। (ख) लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप। (ग) ल्यूमिनोमीटर । (घ) मल्टीमोड रीडर । (ङ) फ्लो साइटोमेट्री। (च) एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

डिटेक्शन प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक तरीकों का उपयोग है जिन्हें फेनोटाइप से तंत्र तक अध्ययन को कवर किया गया है। इस अध्ययन में, हेपजी2 कोशिकाओं को पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ डीएमईएम में सुसंस्कृत किया गया था। जब कोशिकाएं 40-50% संगम तक पहुंचीं, तो 24 घंटे के लिए 10, 10, 100 एनजी/एमएल जोड़े गए और इनक्यूबेटेड किए गए। हमने सबसे पहले टीईपी का उपयोग किया जिसमें प्रतिनिधि ओसीपी, ए-एचसीएच के कारण हेपेटोसिटे में अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तन दिखाए गए, जो माइटोकॉन्ड्रिया संरचना ((चित्रा 1))की हानि दिखाते हैं। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट धुंधला परख ((चित्रा 2),)लूसिफ़ेरेस-लूसिफ़ेरिन एटीपी परख (चित्र3),)जेसी-1 परख(चित्रा 4) और सेल मिटो तनाव परीक्षण परख ( ((चित्रा 5),)जो आमतौर पर माइटोकॉन्ड्रिया रोग का आकलन किया गया। ये परिणाम अंतर्निहित आणविक तंत्रों की जांच के लिए आधार के रूप में काम करते हैं ।

उपरोक्त तरीकों में जांचकर्ताओं को कुछ चरणों में सावधानियों पर ध्यान देना चाहिए। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेल की तैयारी में, कोशिकाओं की संख्या पर ध्यान दिया जाना चाहिए, ताकि बहुत बड़े ऊतक या सेल ब्लॉक के कारण खराब निर्धारण से बचा जा सके। 5% ग्लूटारल्डिहाइड एक फिक्सेटिव के रूप में कार्य करता है, यह बेहतर है कि आधे साल से अधिक स्टोर न करें ताकि पता लगाने में विफलता से बचा जा सके। फिक्स्ड सैंपल 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या अगले चरण से पहले 1 महीने तक रखे जाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल ग्रीन फ्लोरोसेंट डाई बुझाने में आसान है, और फ्लोरेसेंस शमन को धीमा करने के लिए प्रकाश से बचा जाना चाहिए। सेलुलर एटीपी स्तर परख में, एक बहुआयामी ल्यूमिनोमीटर का उपयोग करते समय जो केमिल्यूमिनेसेंस का पता लगा सकता है, अपारदर्शी ब्लैकबोर्ड या व्हाइटबोर्ड 96-वेल प्लेटों का उपयोग आसन्न छेदों के बीच पारस्परिक हस्तक्षेप से बचने के लिए किया जाना चाहिए। एटीपी, विशेष रूप से नमूने में एटीपी का दरार कमरे के तापमान पर स्थिर नहीं है, और एक्सपीरिटी को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर संचालित करने की आवश्यकता है। एटीपी 6 घंटे तक बर्फ पर स्थिर हो सकता है। जेसी-1 डिटेक्शन सॉल्यूशन तैयार करने में जेसी-1 स्टेनिंग डाइंग बफर (5X) को जेसी-1 (200X) के बाद अच्छी तरह से भंग कर अल्ट्रापुरे पानी के साथ मिलाया जा सकता है, ताकि जेसी-1 डिटेक्शन सॉल्यूशन को पूरी तरह से भंग करना आसान हो जाएगा। जेसी-1 जांच को 30 मिनट के भीतर लोड और धोया जाना चाहिए और अनुवर्ती परीक्षण को पूरा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर बचाया जाना चाहिए। ओसीआर माप में, सेल सीडिंग एकाग्रता के लिए अनुकूलन करते समय, अनुकूलन परख से पहले सेल के लिए औसत बेसल ओसीआर मूल्य का पता लगाया जाना चाहिए।

इन तरीकों की कुछ सीमाएं हैं। एक एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर द्वारा ओसीआर माप सेल प्रयोगों तक ही सीमित है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का पता लगाना पर्याप्त नहीं है क्योंकि माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा मेटाबोलिक उत्पादों को मापा नहीं जाता है, जैसे कि हेपेटोसाइट्स में टीसीए चक्रों में फैटी एसिड और मेटाबोलाइट्स को मापना। इसके अलावा, हेपेटिक फैटी एसिड संश्लेषण और गिरावट के संबंध में जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया और पश्चिमी दाग द्वारा पता लगाया जा सकता है, जो फैटी एसिड मेटाबोलिज्म और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन¹³के आणविक विकारों की पुष्टि कर सकता है। माइटोकॉन्ड्रिया की डिजिटल छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत जीवित कोशिकाओं में कैप्चर किया जा सकता है और फॉर्म फैक्टर (एफएफ) और आस्पेक्ट रेशियो (एआर) मूल्यों के आधार पर माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के परिवर्तनों के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। बायोनेरेटिक एनालाइजर¹⁴का उपयोग करके एक्सट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन रेट (ईएआर) को मापकर माइटोकॉन्ड्रिया के मेटाबॉलिक फंक्शन का भी आकलन किया गया । कुछ माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर एंटीबॉडी (साइटोक्रोम सी, एचएसपी 60, पीएचबी1, एसओडी 1, वीडीसीए और स्टेट3) को^,पश्चिमी दाग^4,^15,^{16, 17}द्वारा मापा जा सकता है।^,^,¹⁷ माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड (टीसीए) चक्र का सम्मान करने वाले एंजाइमों की गतिविधियां, जैसे मैलिक डिहाइड्रोजनेज़, संक्षेप डेहाइड्रोजनेज़, साइट्रेट संश्लेषण, एटीपेस, आइसोसिएट डेहाइड्रोजनेज और α-केटोग्लूटोरेट डेहाइड्रोजनेज़¹⁸सबूत हैं। कोशिकाओं में और अलग जिगर माइटोकॉन्ड्रिया में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के कार्य उच्च संकल्प श्वसन¹⁹का उपयोग कर पाया जाता है ।

हमारे प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, संरचना, स्थान, मात्रा, क्षमता, झिल्ली क्षमता और श्वसन श्रृंखला समारोह का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। ये मूल रूप से विभिन्न पहलुओं से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने में सक्षम हैं। और क्या है, ये तरीके सरल और काम करने में आसान हैं। माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन अध्ययन विभिन्न क्षेत्रों में व्यापक रूप से आयोजित किए गए हैं, जैसे लिवर^20,आंत माइक्रोबायोटा^21,प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल^22,और कुछ सामान्य बीमारियों में, जैसे टाइप 2 मधुमेह^23,पार्किंसंस रोग²⁴ और भड़काऊ आंत्र रोग^25। माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़ी और भी बीमारियां हो सकती हैं और हमारे प्रोटोकॉल प्रासंगिक तंत्रों की जांच में मददगार हो सकते हैं । इसके अलावा, अधिक प्रायोगिक तरीकों के साथ इन प्रभावों के व्यापक और गहन पैमाने पर आगे अनुभवजन्य काम की भी आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नग 81573174, 81570574) द्वारा समर्थित किया गया था; जियांग्सू प्रांत का बकाया युवा कोष (SBK2014010296); चीनी शिक्षा मंत्रालय की अनुसंधान परियोजना (213015A); जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों (पीएपीडी) का प्राथमिकता अकादमिक कार्यक्रम विकास, जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों का प्रमुख प्रमुख विकास; और पर्यावरण रसायन विज्ञान और इकोटॉक्सिकोलॉजी (KF2015-01) की राज्य कुंजी प्रयोगशाला का खुला परियोजना कार्यक्रम।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	700B	The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027	Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode reader be used to detect protein consentration.