Summary
本议定书描述了一种使用计算机辅助精子分析和冷却装置进行鱼类精子评估的程序。该软件对基于精子运动的鱼类精子质量进行了快速、准确和定量分析, 可作为水产养殖中提高繁殖成功率的有用工具。
Abstract
对于配子质量评价, 有创新的, 快速的和定量的技术, 可以为水产养殖提供有用的数据。建立了精子分析的计算机系统来测量几个参数, 最常用的测量方法之一是精子运动。
最初, 这种计算机技术是为哺乳动物的物种设计的, 虽然它也可以用于鱼类精子分析。鱼类具有特定的功能, 可以影响精子评估, 如激活后的短期运动时间, 并在某些情况下, 适应较低的温度。因此, 有必要对软件和硬件组件进行修改, 使运动分析更有效地进行鱼精子分析。对于哺乳动物精子, 加热板用于维持精子的最佳温度。然而, 对于某些鱼类来说, 使用较低的温度来延长运动的持续时间是有利的, 因为精子保持活性不到2分钟。因此, 在分析时, 包括在光学显微镜上, 冷却装置是必要的, 在恒定温度下冷藏样品。该协议描述了使用精子分析软件和新的冷却装置对鱼类精子运动进行分析以优化结果。
Introduction
繁殖的功效取决于配子 (卵和精子) 的质量1,2。这是促成受精成功的主要因素, 允许3、4的存活后代的发育。对配子质量的方便评价是确定标本生育潜能的最佳工具。
混合精子的多男性是一个常见的做法, 生产许多水生商业物种4。然而, 男性之间的精子变异可能导致精子的竞争, 因此, 并非所有的男性都同样贡献的基因池5。从这个意义上说, 正确评估个别的射精/精子特征, 如运动, 是获得有关男性生育潜能的歧视性信息的根本。直接观察精子的运动可以产生不准确和主观的数据, 因为它需要时间和经验, 这导致缺乏一致性和不相容的结果6,7。然而, 有许多创新, 快速和定量的技术, 可以提供可靠的精子质量分析2,4。
通过计算机辅助精子分析, 提供准确的精子质量数据8。这项技术包括开发与相衬显微镜相关的软件, 它允许对精子运动进行评估。然而, 运动参数的限制因素是摄像机的帧速率。个体精子轨迹是基于精子头质心位置的连续帧的视频录音, 这是相关的鞭毛运动模式3,9,10, 11. 测量的主要动力学参数为直线速度 (VSL)、曲线速度 (VCL) 和平均路径速度 (VAP)。VSL 是精子所采取的起始点和终点之间的距离除以时间。VCL 是沿精子精确轨迹的真实速度。VAP 是沿着导出的轨迹平滑路径的速度。这些参数允许额外的动力学信息, 包括线性 (LIN), 直线度 (STR), 抖动 (WOB) 和跳动测量, 如振幅的横向头部运动 (ALH) 和节拍交叉频率 (光华)4,10。
精子分析系统最初用于哺乳类, 而系统的要求之一是在捐献者的体温下操作 (约37摄氏度)。该软件还可用于鱼类;但是, 有必要对精子分析结果的误差进行一些适应性的调整。在一些鱼类, 如鲑鱼和鳗鱼8,12, 施肥发生在低温 (约4°c)2,4。因此, 应开发冷却装置, 以避免不舒适的工作条件。此外 , 鱼精子在中 immotile , 需要渗透休克激活运动。对于淡水物种, 活化剂介质应具有低渗渗透, 而对于海洋物种则应为高渗介质。然而, 对于某些物种, 作为鲑鱼, 离子浓度也可能是重要的3,4,9。活化后, 鱼类精子的特征是运动速度的快速下降 (少于2分钟)13、14和高速, 对于确定最佳帧速率以获得可靠数据15至关重要。
本研究的目的是设计和应用用于鱼类精子样品的冷冻系统。此外, 该协议还定义了如何根据种类确定标准协议的最佳帧速率。使用这项议定书在鱼类精估的背景下打开新的门, 用欧洲鳗鱼作为模型。
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Protocol
涉及动物问题的程序已获得批准 (2015/变现/豌豆/00064) 的一般方向的农业生产和牲畜在大学 Politècnica de València。
1. 在圈养的欧洲鳗鱼中收集精子
注: 使用欧洲鳗鱼雄性在水箱中保持海水和循环系统在恒温 (20 摄氏度)。通过每周腹腔注射 (人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 来治疗激素; 1.5 的每克鱼体重)。在淡水中逐渐开始使用3天的鱼, 然后用海水替换 (水箱中总水的 1/3) 每2天, 直到达到37.0 克/毫升的盐度。
- 麻醉24小时后, 通过激素注射获得更好的精子质量样品。
- 预先准备麻醉: 添加300毫克的苯佐卡因到100毫升70% 乙醇。混合好, 并存储在4摄氏度。
- 在5升的系统水的柔性桶中稀释苯佐卡因, 以获得60毫克/升的最终浓度, 并适当混合。
- 用系统水和苯佐卡因把鱼转到水桶里。等几分钟, 直到鱼平静下来。
- 用清水清除生殖器区, 用吸水纸干燥, 以避免粪便、尿液或海水污染精子样本。
- 在腹部使用温和的压力, 并将精子样本收集到15毫升的塑料管用真空泵。精子体积可达6-7 毫升, 取决于雄性。
- 将精子样本保持在4摄氏度, 至少1小时, 直到进行动力分析。
2. 冷冻和稀释精子样本
- 预先准备稀释解决方案。
注: 精子样本应稀释在特定于每个物种的扩展剂解决方案。- 制备鳗鱼精子样品的非活化剂培养基 (P1 培养基)。添加0.42 克碳酸氢钠, 1.828 克氯化钠, 0.127 克氯化镁, 0.56 克氯化钾和0.037 克氯化钙到250毫升蒸馏水。混合好溶化。存储在4摄氏度。
- 将冷却器块设置为4摄氏度, 以保持样品在恒温下的温度。等到温度稳定下来。
- 使用特定于每个物种的稀释溶液稀释精子样本。
注: 稀释率为特定物种, 必须定义为规范该协议。首先, 根据在运动前分析中获得的浓度来估计精子浓度, 如步骤3和4所述。通过这种分析, 也可以根据运动的百分比选择最佳精子样本。在此之后, 研究员可以开始收集数据的实验使用最好的样本与正确的浓度。- 稀释鳗鱼精子样品在 P1 培养基中的比例为1:50。为制备500µL 的鳗鱼稀释精子, 添加50µL 的新鲜精子样本和450µL P1。混合好。
3. 评估精子运动参数
-
建立软件的运动模块
- 将冷却器的温度设定在4摄氏度, 等到它稳定下来。
- 打开软件并选择运动模块。如有必要, 请创建用户名和密码。
- 在开始精子分析之前, 选择属性并选择所需的参数。
- 点击物种 |鱼。
- 根据每个物种的最佳技术条件, 选择每秒帧数和图像数量。将两个选项设置为每秒120个图像。
- 选择负对比度。这是必须的精确重建精子轨迹16。
- 选择相应的计数室和摄像机的刻度。为实验中使用的放大透镜校准摄像机。将 SpermTrack10 设置为计数室和10X 刻度。
注: 一般而言, 在计数室和10X 放大透镜的深度10µm 是推荐的条件, 因为它们提供了更好的聚焦所有精子和捕获最高数量的细胞。然而, 建议对每个物种的运动分析的最佳条件进行前期研究。 - 调整每个物种的粒子面积和连通性。设置最小粒子面积在2µm2和连通性在7µm。
注意: 对于鱼来说, 粒子面积的最小值介于2-5 µm 之间, 连通性取决于精子速度和帧速率。 - 保存设置。
- 选择捕获。
-
用软件分析欧洲鳗鱼精子
- 将0.946 克商业盐添加到25毫升蒸馏水中, 用 2% BSA 制备活化剂溶液 (人工海水)。
- 采取500毫升活化剂溶液 (人工海水) 和地方在冷却器块。
注意: 一般来说, 鱼精子是由渗透休克事件激活的, 虽然对某些物种来说, 离子浓度也很重要。对于淡水物种, 活化剂介质应具有低渗渗透, 而对于海洋物种则应为高渗介质。 - 将计数室置于冷却阶段, 等到温度稳定到4摄氏度。
- 混合活化剂和稀释精子激活精子, 并启动运动视频记录后5-10 秒激活。
- 取4µL 活化剂溶液并放置在计数室中。
- 通过摇动离心3次, 轻轻地融汇稀释的精子, 以避免精子细胞的损伤。
- 服用0.5 µL 稀释精子, 与活化剂混合, 并迅速将盖子放在计数室中。
注意: 此步骤不应超过5秒, 以尽快开始分析。 - 关注精子细胞并找到最佳视觉区域, 这是由少量的精子 (150 到200细胞) 定义的, 以避免细胞间的拦截 (补充图 1A)。选择捕获视频以获取精子轨迹, 并根据速度进行分离。
- 选择 "捕获" 以获取3到7个字段, 这是在结果中获取较低可变性的最佳间隔, 并继续进行。记录视频直到120s 后激活, 以避免在计数室的封面上凝结。
- 选择 "退出" 可拥有所有字段的一般视图。
4. 获取动力数据
- 选择域 |部分 |保存并选择一个文件名。单击 "保存"。
注意: 电子表格提供了精子轨迹的部分数据、图表和图像的平均值。 - 选择常规数据 |文件名 |保存。
注: 数据为各个领域的个体精子提供了动力学值。
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Representative Results
精子运动时间效应分析
在欧洲鳗鱼的情况下, 静态精子的百分比从十五年代增加到120s 在激活以后 (从24.4% 到 40.7%), 并且移动的进步精子的百分比减少 (从36.9% 到 20.9%)(图 1A和1B)。根据速度, 精子细胞显示速度随着时间的推移 (图 1C和1D) 减少。快速速度的精子比例下降了约 23% (从49.4% 到 26.6%), 中等速度精子的比例增加了约7%。
帧速率和计数室的影响
不同的物种需要不同的帧速率来获得最佳结果。俄罗斯鲟鱼每秒需要150帧 (fps;图 2A);鲤鱼需要 100 fps (图 2B);对于格雷林, 200 fps 是不够的, 以获得最佳的动能结果 (图 2C)。这些结果不依赖于所测试的计数室的深度 (图 2A-2C)。
精子亚群结构
精子亚群的识别是基于统计分析的。第一步是确定主成分 (主成分分析;PCA) 从完整的运动数据集。然后, 利用 PCA 后获得的精子衍生指标进行聚类处理。
对于这项研究, 我们使用大西洋鲑鱼精子, 显示四不同的亚人口, 命名为: 慢非线性 (低林, str 和 VCL), 快速非线性 (低 STR, 高 VCL), 快速线性 (高林, str 和 VCL) 和最快的线性 (最高林, str, 和 VCL)。这些亚人口的分布随世代不同, 从野生动物到养殖的物种 (图 3)。
图 1: 时间后活化对欧洲鳗鱼精子累进和运动的影响。A 和 B) 累进的百分比分别为15和 120s;和 C 和 D) 的运动百分比的速度随着时间的推移 (15 和120s 后激活, 分别).累进分为三组: 渐进性运动细胞 (白色;VCL 平均值: 114.5 18.2 和 101.4, 分别为15和120s 的34.5 µm/秒), 无渐进运动细胞 (灰色;VCL 平均值: 84.8 17.4 µm/秒为十五年代和 84.6 120s 16.5 µm/秒) 和静态精子 (黑色)。精子速度分为4组: 快速 (VCL 平均值: 119.3 到13.7 µm/秒为十五年代和 118.9 * 13.3 µm/秒为 120s; 白色), 中等 (VCL 平均值): 79.7 秒15.5 µm/秒十五年代和 79.6 @ 15.5 µm/秒 120s; 浅灰色), 慢 (VCL 平均值: 32.9 6.5 µm/秒为十五年代和 32.6 120s 6.6 µm/秒; 深灰色) 和静态 (黑色)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 三种淡水鱼类的帧率和计数室的影响:(a) 俄罗斯鲟鱼 (B) 鲤鱼和 (C) 格雷林。精子分析是在 50, 100, 150 和 200 fps, 使用两个不同深度的商业计数室 (10 和20µm)。黑色圆圈代表了每个物种的最佳帧速率。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 三代大西洋鲑鱼的精子亚群结构: 野生雄性 (F0), 以及在圈养 (F1 和 F2) 中产生的前两代.在聚类分析后, 观察到四个亚群: 慢非线性精子 (低林、STR 和 VCL; 簇 1; 黑色), 快速非线性精子 (下 STR, 高 VCL; 簇 2; 深灰色), 快速线性精子 (高林, STR 和 VCL; 簇 3;中间灰色) 和最快的线性精子 (最高林, STR 和 VCL; 4 组; 浅灰色)。请单击此处查看此图的较大版本.
补充图 1。不同的视觉区域从运动分析欧洲鳗鱼精子定义为 (A) 最佳和 (B) 最坏的细胞浓度.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这个协议中使用的精子分析软件已经被全世界的研究人员用于不同的物种, 包括鱼类。然而, 鱼有一些特定的特点, 可以影响精子评估。在活化的瞬间, 鱼精子表现出很高的速度, 在活化后迅速下降, 并导致短暂的运动时间。此外, 繁殖的温度是物种依赖性的, 在某些情况下, 可能是大约4°c2,4,8,12。因此, 有必要对提高鱼类精子分析系统的效率进行一些适应。动力参数的基本原理是对运动精子的连续图像进行采集和分析。大多数系统使用标准帧速率 (16、25、30、50或 60 fps), 因为硬件和软件的限制为17、18、19、20、21、22。然而, 一些研究表明, 较高的帧速率增加了一些速度参数, 如 VCL, STR, 光华15,23,24。这是特别重要的, 当需要评估精子的 hyperactivation 和发现精子的最大速度11,17,18,19,25. 在分析温度方面, 光学显微镜用的冷却板, 以及在恒温下冷藏样品的新技术也可以改善分析的时间。本研究为解决鱼类精子运动分析和温度敏感性两个主要问题提供了方法。尽管研究结果侧重于一些淡水物种, 但这种方法可用于海洋物种, 尽管应为每个物种调整活化培养基。
在市场上, 有一系列的产品, 甚至不同版本的同一产品。即使系统可能有相同的原则, 每一个都有不同的细节导致结果不兼容26,27,28。此外, 对鱼类精子质量的评价仍有方法和技术上的局限性。精子活化技术和活化后分析时间是影响精子质量评价29、30的两个重要因素。在精子样本活化和图像稳定之间的时间应该是大约5秒, 因为第一秒钟 (5-20 s 的时间间隔) 提供最有用的数据2,4。由于玻璃滑动的凝结问题, 精子分析的时间可能会受到限制。然而, 鱼类精子保持活跃, 运动不到两分钟2。在技术层面上, 有必要知道 "最优" 帧速率, 以获得详细信息, 准确地重建精子轨迹15。在较低帧速率下, 弹道的细节丢失, 特别是对于快速和非线性精子, 而在较高帧率, 信息成为冗余15,31。对某些鱼类来说, 帧速率 (高达 250 fps) 不足以找到某些鱼类的精子的最大速度, 如格雷林和鲑鱼。这种变异是特定物种的, 必须为每个物种定义, 以标准化协议, 并获得可靠的结果15,23,24。计数室的深度可能限制鱼的大鞭毛的运动, 精子不能达到最大速度11,32,33。此外, 当细胞相交时, 该软件可能对实际精子的检测有一定的限制。
对精子质量的经典评价是在对其浓度和运动百分率的估计的基础上进行的主观分析, 可以产生变异的结果。然而, 计算机系统提供了快速、准确和定量的运动参数测量。这一客观分析给出了大量的数据, 并减少了结果34、35、36、37的变异性。精子运动行为的反应取决于分析的温度, 不同物种38、39、40之间的变化。精子分析的最佳温度可以提供精子速度和运动期的持续时间, 类似于生殖38,40的自然条件。因此, 用冷却装置进行精子分析软件, 提高了鱼精子质量的评价。
精子质量分析结果可以提高精子亚群对鱼类精子特征和质量的认识, 这可能是41、42所有动物物种精子评估的未来。在实际水平上, 该技术可以作为高品质育种者的指标, 有助于获得更多的关于精子选择过程的信息, 人工授精的精量计算, 基于速度和累进的精子竞争, 以及生育潜能。所有这些知识可以应用到不同的研究领域, 包括水产养殖和保护项目, 这刺激了对鱼类精子储存和冷冻保存的兴趣在过去的几十年2,13。由于环境问题, 毒理学效应也得到了特别的关注, 并研究了基于精子运动特性的 phylogenetical 研究的发展43,44。
这项工作表明了如何优化的鱼精子运动分析的自动软件, 提高了结果。标准化的协议必须考虑到分析的温度和帧率, 这可能是不同的, 取决于物种。然而, 分析鱼类精子的运动有两个关键步骤, 研究者应该注意。由于粪便、尿液和水 (海水或淡水) 的污染, 精子收集是第一个关键步骤, 可以摧毁样本。另一个关键点是与精子活化的瞬间和录像的开始有关。这一步应尽快进行, 以收集数据时, 精子有剧烈的运动。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目从成本协会 (粮食和农业成本行动 FA1205: AQUAGAMETE, 以及欧洲联盟2020《玛丽玛丽·斯卡洛多斯卡·居里-居里项目》下的研究和创新方案中获得了资金 (GA 642893)。我们要感谢 PROiSER 的科学团队, 特别是本德雷利伯纳乌的学生, 他积极参与了这个项目的录像记录。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
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