Summary
ويصف هذا البروتوكول إجراء تقييم الحيوانات المنوية الأسماك باستخدام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب وأجهزة التبريد. ويعطي البرنامج السريع، دقيقة، والتحليل الكمي لجودة الحيوانات المنوية الأسماك استناداً إلى حركية المني، التي يمكن أن تكون أداة مفيدة في تربية الأحياء المائية في تحسين نجاح الاستنساخ.
Abstract
لتقييم نوعية مشيج، هناك تقنيات مبتكرة وسريعة، والكمية التي يمكن أن توفر بيانات مفيدة لتربية الأحياء المائية. ووضعت النظم المحوسبة لتحليل الحيوانات المنوية لقياس العديد من المعلمات وواحد لقياس الأكثر شيوعاً هو عدد الحيوانات المنوية الحركة.
في البداية، صمم هذا تكنولوجيا الحاسوب لأنواع الثدييات، على الرغم من أنه يمكن استخدامها أيضا لتحليل الحيوانات المنوية الأسماك. الأسماك لها السمات المحددة التي يمكن أن تؤثر على الحيوانات المنوية التقييم مثل فترة زمنية قصيرة حركية بعد التنشيط، وفي بعض الحالات، التكيف مع انخفاض درجات الحرارة. وبالتالي، من الضروري تعديل مكونات البرامج والأجهزة لجعل تحليل حركية أكثر كفاءة لتحليل الحيوانات المنوية الأسماك. للثدييات من الحيوانات المنوية، يتم استخدام لوحة التدفئة للحفاظ على درجات الحرارة المثلى للمني. ومع ذلك، لبعض أنواع الأسماك، أنها مفيدة لاستخدام درجة حرارة أقل لإطالة فترة حركية، نظراً للحيوانات المنوية تبقى نشطة لأقل من 2 دقيقة. ولذلك، أجهزة التبريد ضرورية للثلاجة العينات في درجة حرارة ثابتة على مر الزمن التحليل، بما في ذلك في المجهر الضوئي. ويصف هذا البروتوكول تحليل عدد الأسماك الحيوانات المنوية الحركة باستخدام البرمجيات لتحليل الحيوانات المنوية وتبريد جديدة من الأجهزة تحسين النتائج.
Introduction
فعالية الاستنساخ يعتمد على نوعية كل الأمشاج (البيض والحيوانات المنوية)1،2. وهذا هو العامل الرئيسي الذي يسهم في نجاح الإخصاب، مما يتيح وضع ذرية صالحة3،4. تقييم جودة مشيج مريحة هو أفضل أداة لتحديد إمكانات الخصوبة من عينة.
خلط الحيوانات المنوية من الذكور متعددة ممارسة شائعة في إنتاج العديد من الأنواع التجارية المائية4. بيد أن تنوع الحيوانات المنوية بين الذكور يمكن أن يؤدي إلى المنافسة الحيوانات المنوية ونتيجة لذلك، ليس جميع الذكور على قدم المساواة تساهم الجينات5. وبهذا المعني، التقييم الصحيح لميزات السائل المنوي/المني الفردية، مثل حركية، أمر أساسي للحصول على معلومات تمييزية فيما يتعلق بخصوبة الذكور الفردية المحتملة. الملاحظة المباشرة لعدد الحيوانات المنوية الحركة يمكن أن تنتج بيانات غير دقيقة وغير موضوعية كما أنه يتطلب الوقت والخبرة، مما يؤدي إلى عدم الاتساق وعدم التوافق بين نتائج6،7. ومع ذلك، هناك العديد من تقنيات مبتكرة وسريعة والكمية التي يمكن أن توفر الحيوانات المنوية موثوقة نوعية تحليل2،4.
تم تطوير تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب لتقديم بيانات دقيقة عن نوعية الحيوانات المنوية8. وتشمل هذه التكنولوجيا تطوير البرمجيات المرتبطة مجهر تباين المرحلة التي تسمح تقييم لعدد الحيوانات المنوية الحركة. ومع ذلك، هو عاملاً يحد من المعلمة حركية معدل الإطار لكاميرا الفيديو. المني كل المني والمسارات تستند رئيس الموقف centroid في إطارات متتالية من تسجيلات الفيديو، الذي يرتبط بحركة flagellar أنماط3،،من910، 11. هي المعلمات الحركية الرئيسية قياس سرعة الخط المستقيم (VSL) والمنحنية الخطوط السرعة (VCL) ومسار متوسط السرعة (برنامج عمل فيينتيان). VSL هو المسافة بين نقطة البداية ونقطة النهاية التي اتخذتها المني مقسوماً على وقت. VCL هي السرعة الحقيقية على طول المسار الدقيق اتخذتها المني. هو برنامج عمل فيينتيان سرعة على طول طريق ممهدة مشتقة من المسار. تسمح هذه المعلمات معلومات حركية إضافية، بما في ذلك الخطي (لين) والاستقامة (STR) وتمايل (وب) وقياسات الضرب مثل السعة لحركة الرأس الأفقي (آلة) والتردد عبر فوز (معامل التركيز الأحيائي)4،10.
كانت في الأصل تستخدم نظام تحليل الحيوانات المنوية لأنواع الثدييات، ومن متطلبات النظام تعمل في درجة حرارة الجسم للجهة المانحة (حوالي 37 درجة مئوية). يمكن أيضا استخدام هذا البرنامج للأنواع السمكية؛ على الرغم من ذلك، من الضروري إجراء بعض التعديلات لتقليل الخطأ في نتائج تحليل الحيوانات المنوية. في بعض أنواع الأسماك، مثل السلمون وثعبان البحر8،12، يحدث الإخصاب في درجة حرارة منخفضة (حوالي 4 درجات مئوية)2،4. وبالتالي، ينبغي وضع أجهزة التبريد لتجنب ظروف العمل غير مريح. وباﻹضافة إلى ذلك، المني الأسماك اسم في السائل المنوي وتتطلب حدوث صدمة ناضح بتنشيط حركية. المتوسطة المنشط لأسماك المياه العذبة، ينبغي أن يكون osmolality ناقص التوتر، بينما ينبغي أن تكون المتوسطة مكثف للأنواع البحرية. ومع ذلك، لبعض الأنواع، كالسلمون، تركيز أيون يمكن أيضا هامة3،،من49. بعد التنشيط، تتميز بانخفاض سرعة حركية (أقل من 2 دقيقة)13،14 والسرعة العالية، ويجري حيوية لتحديد معدل الإطار الأمثل للحصول على بيانات موثوق بها15الأسماك الحيوانات المنوية.
أهداف هذه الدراسة هي لتصميم وتطبيق نظم التبريد لعينات الحيوانات المنوية من الأسماك. وبالإضافة إلى ذلك، يعرف هذا البروتوكول كيفية تحديد معدلات الإطار الأمثل لوضع بروتوكولات قياسية تبعاً للأنواع الأحيائية. استخدام هذا البروتوكول يفتح أبواباً جديدة في سياق التقييم المنوي الأسماك، استخدام ثعبان البحر الأوروبي كنموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإجراءات التي تشمل مواضيع الحيوان وقد وافق (2015/VSC/البازلاء/00064) بالاتجاه العام للإنتاج الزراعي وتربية الماشية في València دي Politècnica Universitat.
1-جمع الحيوانات المنوية من ثعبان ناضجة في الأسر
ملاحظة: استخدام ثعبان الذكور الاحتفاظ بها في خزانات مياه البحر ونظام إعادة تدوير في درجة حرارة ثابتة (20 درجة مئوية). علاج بالهرمونات عن طريق الحقن داخل أسبوعية (تروج المشيمية البشرية (hCG)؛ 1.5 وحدة دولية كل غرام من الأسماك من وزن الجسم). التأقلم الأسماك تدريجيا بدءاً من 3 أيام في المياه العذبة متبوعاً باستبدال مع مياه البحر (1/3 من إجمالي المياه في الخزان) كل يومين حتى وصلت إلى ملوحة من 37.0 غ/مل.
- تخدير ثعبان البحر 24 ساعة بعد حقن هرمون للحصول على عينات مع تحسين نوعية الحيوانات المنوية.
- إعداد التخدير مسبقاً: إضافة 300 ملغ البنزوكائين إلى 100 مل إيثانول 70%. يخلط جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تمييع البنزوكائين في دلو مرنة مع 5 لتر من الماء النظام للحصول على تركيز نهائي من 60 مغ/لتر، وتخلط بشكل صحيح.
- نقل الأسماك إلى الدلو مع نظام المياه والبنزوكائين. انتظر لبضع دقائق حتى تهدأ الأسماك.
- مسح منطقة الأعضاء التناسلية بالماء وتجفيف مع ورقة ماصة لتجنب تلوث العينات المنوية بالبراز والبول أو مياه البحر.
- تطبيق ضغط لطيف في منطقة البطن وجمع عينات الحيوانات المنوية في أنابيب بلاستيكية 15 مل باستخدام مضخة فراغ. حجم الحيوانات المنوية يصل إلى 6-7 مل، اعتماداً على الذكور.
- الاحتفاظ بعينات الحيوانات المنوية في 4 درجات مئوية على الأقل 1 ح حتى يجري تحليل حركية.
2-الثلاجة وتمييع عينات الحيوانات المنوية
- إعداد الحل ديلوتير مسبقاً.
ملاحظة: ينبغي أن تضعف عينات الحيوانات المنوية في الموسع حل محدد لكل نوع من الأنواع.- تعد المتوسطة غير منشط لعينات الحيوانات المنوية ثعبان البحر (P1 المتوسطة). إضافة ز 0.42 من بيكربونات الصوديوم، 1.828 ز كلوريد الصوديوم، 0.127 ز كلوريد المغنيسيوم، 0.56 غ من كلوريد البوتاسيوم و 0.037 غ من كلوريد الكالسيوم إلى 250 مل ماء المقطر. مزيج جيد حل. مخزن في 4 درجات مئوية.
- تعيين كتلة برودة في 4 درجات مئوية للمحافظة على العينات عند درجة حرارة ثابتة. الانتظار حتى تستقر درجة الحرارة.
- تمييع عينات الحيوانات المنوية باستخدام حل ديلوتير المحددة لكل نوع من الأنواع.
ملاحظة: نسبة تخفيف أنواع معينة ويجب أن تحدد لتوحيد البروتوكول. أولاً، تقدير تركيز الحيوانات المنوية استناداً إلى تركيز حصل في تحليل ما قبل حركية استخدام البرمجيات، كما هو موضح في الخطوتين 3 و 4. مع هذا التحليل، من الممكن أيضا لتحديد عينات الحيوانات المنوية أفضل استناداً إلى النسبة المئوية للحركة. بعد ذلك، يمكن بدء الباحث لجمع البيانات للتجربة باستخدام عينات أفضل مع التركيز الصحيح.- تمييع عينات الحيوانات المنوية ثعبان البحر المتوسط P1 بنسبة 01:50. إعداد 500 ميليلتر من ثعبان البحر تضعف الحيوانات المنوية، إضافة 50 ميكروليتر من عينة الحيوانات المنوية الطازجة وميليلتر 450 من P1. مزيج جيد.
3-تقييم المعلمات حركية الحيوانات المنوية
-
إنشاء وحدة حركية من البرمجيات
- تعيين مرحلة برودة في 4 درجات مئوية والانتظار لحين أن يستقر.
- افتح البرنامج وحدد وحدة حركية. قم بإنشاء اسم المستخدم وكلمة المرور إذا لزم الأمر.
- حدد خصائص واختر المعلمات المطلوبة قبل البدء في تحليل الحيوانات المنوية.
- انقر فوق الأنواع | سمكة.
- تحديد الإطارات في الثانية و عدد الصور، اعتماداً على أفضل الظروف التقنية لكل نوع من الأنواع. تعيين كلا الخيارين في 120 صورة في الثانية الواحدة.
- اختر التباين السلبية. وملزمة لتعمير مسارات المني16دقيقة.
- حدد المقابلة عد الدائرة و حجم كاميرا الفيديو. معايرة كاميرا فيديو لعدسة التكبير المستخدمة في التجربة. تعيين SpermTrack10 كدائرة العد ومقياس X 10.
ملاحظة: بشكل عام، على عمق 10 ميكرون في قاعة فرز الأصوات وعدسة تكبير من 10 X هي الموصى بها الشروط نظراً لأنها توفر أفضل تركيز جميع المني والقبض على أكبر عدد من الخلايا. ومع ذلك، من المستحسن جعل دراسة الظروف المثلى لتحليل حركية من كل نوع من الأنواع سابقة. - ضبط مساحة الجسيمات و الاتصال لكل نوع من الأنواع. تعيين مجال الجسيمات الحد الأدنى 2 ميكرومتر2 والربط في 7 ميكرومتر.
ملاحظة: للأسماك، يعتمد الحد الأدنى لقيمة الجزيئات مجال يتراوح بين 2-5 ميكرومتر، والربط على سرعة المني ومعدل الإطار. - حفظ في الإعداد.
- حدد لقطة.
-
تحليل الحيوانات المنوية ثعبان مع البرمجيات
- إعداد الحل المنشط (مياه البحر الاصطناعي) عن طريق إضافة 0.946 غ من الملح التجاري إلى 25 مل ماء المقطر مع جيش صرب البوسنة 2%.
- تأخذ 500 مل من محلول منشط (مياه البحر الاصطناعي) ووضع في كتلة برودة.
ملاحظة: بشكل عام، الحيوانات المنوية الأسماك يتم تفعيلها من خلال حدث صدمة ناضح، على الرغم من أن بعض الأنواع يمكن أن يكون تركيز أيون أيضا مهم. المتوسطة المنشط لأسماك المياه العذبة، ينبغي أن يكون osmolality ناقص التوتر، بينما ينبغي أن تكون المتوسطة مكثف للأنواع البحرية. - وضع قاعة فرز الأصوات تحت مرحلة التبريد والانتظار حتى تستقر درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية.
- مزيج المنشط والحيوانات المنوية المخفف تنشيط المني والبدء في تسجيل بين 5-10 ق بعد تنشيط الفيديو حركية.
- تأخذ 4 ميليلتر الحل المنشط ومكان في قاعة فرز الأصوات.
- بلطف تجانسه الحيوانات المنوية المخفف بالهز ميكروسينتريفوجي 3 مرات لتجنب حدوث تلف في خلايا المني.
- تأخذ 0.5 ميليلتر تضعف الحيوانات المنوية وخلط مع المنشط ووضع الغطاء في قاعة العد بسرعة.
ملاحظة: هذه الخطوة لا ينبغي أن تأخذ أكثر من 5 s لبدء التحليل وقت ممكن. - تركز على خلايا المني وإيجاد منطقة بصرية أفضل، التي تعرف بعدد قليل من المني (150 إلى 200 الخلايا) لتجنب اعتراض بين الخلايا ("تكميلية الشكل" 1A). حدد التقاط الفيديو للحصول على المسارات المني، الذي يتم فصله وفقا للسرعة.
- حدد التقاط للحصول على حقول 3 إلى 7، وهي الفترة الزمنية الأمثل الحصول على تقلب الدنيا في النتائج، والمضي قدما كما كان من قبل. تسجيل الفيديو حتى 120 s التنشيط بعد تفاديا للتكثيف على الغطاء من قاعة الفرز.
- حدد الخروج ليكون رأي عام لكافة الحقول.
4-الحصول على بيانات حركية
- حدد حقول | الجزئي | حفظ واختر اسم ملف. انقر فوق حفظ.
ملاحظة: جدول يوفر قيم المتوسط الحسابي الجزئي البيانات والمخططات والصور من المسارات المني. - حدد البيانات العامة | اسم الملف | حفظ.
ملاحظة: البيانات توفير القيم الحركية للمني الفردية في جميع الميادين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل تأثير الوقت على عدد الحيوانات المنوية الحركة
في حالة ثعبان البحر الأوروبي، زادت النسبة المئوية للمني ثابتة من 15 ثانية إلى 120 s بعد التنشيط (من 24.4 في المائة إلى 40.7 في المائة)، والنسبة المئوية للجوال المني التدريجي قد انخفض (من 36.9% و 20.9%) (الشكل 1A و 1B). استناداً إلى سرعة، خلايا المني أظهر انخفاضا في السرعة على مر الزمن (الشكل 1 ود 1) انخفضت. وانخفضت النسبة المئوية للمني بسرعة السريع حوالي 23% (من 49.4 في المائة إلى 26.6 في المائة) وزيادة نسبة المني مع سرعة متوسطة حوالي 7%.
تأثير على معدل الإطار ودائرة العد
تتطلب الأنواع المختلفة الإطار معدلات مختلفة لتحقيق أفضل النتائج. سمك الحفش الروسي يتطلب 150 من الإطارات في الثانية (fps؛ الشكل 2 (أ))؛ الكارب العادي يتطلب 100 fps (الشكل 2)؛ و التيمالوس، 200 إطارا في الثانية لم يكن كافياً للحصول على نتائج مثلى الحركية (الشكل 2). هذه النتائج لا تعتمد على عمق عد اختبرت الدائرة (الشكل 2 ألف-2 ج).
هيكل الفئات السكانية الفرعية الحيوانات المنوية
ويستند تحديد الحيوانات المنوية يتدنى في التحليل الإحصائي. والخطوة الأولى هي تحديد أصل مكونات (تحليل المكونات الرئيسية؛ محكمة التحكيم الدائمة) من مجموعة كاملة من البيانات حركية. ثم، يتم تنفيذ إجراءات التجميع مع المؤشرات المستمدة من الحيوانات المنوية التي تم الحصول عليها بعد محكمة التحكيم الدائمة.
لهذه الدراسة، قمنا باستخدام الحيوانات المنوية السلمون الأطلسي التي أظهرت أربعة الفئات السكانية الفرعية المختلفة، المسمى: بطء غير الخطية (انخفاض لين والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة و VCL)، بسرعة غير الخطية (أقل بالإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، VCL عالية)، سريع الخطي (عالية لين والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة و VCL) وأسرع الخطي (لين أعلى والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة و VCL). توزيع هذه الفئات السكانية الفرعية متنوعة على امتداد الأجيال من الحيوانات البرية لتربيتها منها (الشكل 3).
الشكل 1 : تأثير التنشيط بعد انتهاء الوقت على التدرج وحركية الحيوانات المنوية ثعبان. A و B) النسبة المئوية من التدرج في 15 و 120 ثانية، على التوالي؛ وجيم ودال) النسبة المئوية للحركة على أساس السرعة على مر الزمن (15 و 120 s التنشيط بعد، على التوالي). وقسمت التدرج في ثلاث مجموعات: خلايا متحركة التدريجي (الأبيض؛ يعني VCL قيمة ± SD: ± 18.2 و 101.4 114.5 ± 34.5 ميكرومتر/s ل s 15 و 120، على التوالي)، لا خلايا متحركة التدريجي (الرمادي؛ يعني VCL قيمة ± SD: ± 17.4 84.8 ميكرومتر/ق 15 ق و 84.6 ± 16.5 ميكرومتر/s ل 120 s)، والمنى ثابتة (أسود). سرعة المني وقسمت إلى أربع مجموعات: السريع (VCL يعني قيمة ± SD: 119.3 ± 13.7 ميكرومتر/s عن 15 ثانية و 118.9 ± 13.3 ميكرومتر/ثانية ل 120 s؛ والأبيض)، متوسطة (VCL يعني قيمة ± SD: 79.7 ± 15.5 ميكرومتر/ق 15 ق و 79.6 ± 15.5 ميكرومتر/s ل 120 s; رمادي فاتح) ، بطيء (VCL يعني قيمة ± SD: 32.9 ± 6.5 ميكرون/s 15 s و 32.6 ± 6.6 ميكرومتر/s ل 120 s; رمادي داكن) وثابت (أسود). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تأثير معدل الإطار وقاعة فرز الأصوات في ثلاثة أنواع أسماك المياه العذبة: (A) سمك الحفش الروسي (ب) الكارب والتيمالوس (ج). وأجرى تحليل الحيوانات المنوية 50، 100، 150 و 200 إطارا في الثانية، باستخدام العد التجاري هما الدوائر بأعماق مختلفة (10 و 20 ميكرومتر). دائرة سوداء يمثل معدل الإطار الأفضل لكل نوع من الأنواع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الحيوانات المنوية الفئات السكانية الفرعية هيكل من ثلاثة أجيال من سمك السلمون الأطلسي: الذكور البرية (F0)، والأجيال اثنين الأولى المنتجة في الأسر (F1 و F2). بعد تحليل الكتلة، لوحظت الجمهرات الفرعية الأربعة: بطء المني غير الخطية (منخفض لين، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، وواو؛ المجموعة 1؛ والأسود) والمنى غير الخطية (STR السفلي، VCL عالية؛ المجموعة 2؛ رمادي داكن) بسرعة وسريعة الخطي المني (لين عالية والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة وواو؛ المجموعة 3؛ المتوسط رمادي) وأسرع الخطي المني (أعلى لين، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، وواو؛ المجموعة 4؛ ورمادي فاتح). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1. المناطق البصرية المختلفة من تحليل حركية الحيوانات المنوية ثعبان يعرف بأنه (أ) أفضل وتركيز الخلية (ب) أسوأ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
برمجيات تحليل الحيوانات المنوية المستخدمة في هذا البروتوكول قد استخدمت الباحثين في جميع أنحاء العالم لمختلف الأنواع، بما في ذلك الأسماك. ومع ذلك، قد الأسماك بعض السمات المحددة التي يمكن أن يؤثر على تقييم الحيوانات المنوية. وأظهرت المني الأسماك عالية السرعة في لحظة التنشيط التي تنخفض بسرعة، ويؤدي إلى وقت قصير لحركية بعد التنشيط. وإلى جانب ذلك، درجة حرارة الاستنساخ تعتمد على الأنواع، وفي بعض الحالات، يمكن أن يكون حوالي 4 ° C2،،،من48،12. وبالتالي، من الضروري إجراء بعض التعديلات لتحسين كفاءة نظام محوسب لتحليل الحيوانات المنوية الأسماك. هو المبدأ الأساسي للمعلمة حركية اقتناء وتحليل الصور المتعاقبة من المني متحركة. تستخدم معظم الأنظمة معدلات الإطار القياسي (16، 25، 30، 50 أو 60 fps) بسبب القيود المفروضة على الأجهزة والبرمجيات17،،من1819،20،،من2122. ومع ذلك، أظهرت بعض الدراسات أن معدل إطار أعلى الزيادات بعض المعلمات السرعة، مثل VCL، شارع، معامل التركيز الأحيائي15،،من2324. هذا مهم بشكل خاص عندما يكون ذلك ضروريا لتقييم هايبراكتيفيشن للمني والعثور على السرعة القصوى المني11،17،،من18إلى19، 25-فيما يتعلق بدرجة الحرارة للتحليل، لوحة تبريد للمجهر الضوئي، وتكنولوجيا جديدة العينات في درجة حرارة ثابتة في الثلاجة يمكن أيضا تحسين التحليل على مر الزمن. هذا العمل يقدم نهجاً لحل مشكلتين من المشاكل الرئيسية المرتبطة بالأسماك حركية الحيوانات المنوية التحليل وحرارة العاطفة. على الرغم من النتائج التي تركز على بعض أنواع المياه العذبة، يمكن أن تستخدم هذه المنهجية للأنواع البحرية، على الرغم من أن المتوسط التنشيط ينبغي تكييف لكل نوع من الأنواع.
في السوق، وهناك مجموعة واسعة من المنتجات أو إصدارات مختلفة حتى من نفس المنتج. حتى لو كان قد نظم نفس المبدأ، كل واحد له تفاصيل مختلفة أسفرت عن عدم التوافق بين نتائج26،،من2728. وإلى جانب ذلك، تقييم جودة الحيوانات المنوية الأسماك يمكن أن يكون لا يزال القيود المنهجية والتقنية. هي تقنية تنشيط الحيوانات المنوية ووقت التحليل بعد التنشيط اثنين من العوامل الأساسية التي تؤثر على الحيوانات المنوية نوعية التقييم29،30. يجب أن يكون الوقت بين تفعيل عينات الحيوانات المنوية واستقرار الصورة لتسجيلات الفيديو حوالي 5 s منذ الثواني الأولى (الفاصل الزمني من 5-20 s) توفر بيانات مفيدة للغاية2،4. وقت تحليل الحيوانات المنوية قد تكون محدودة بسبب مشاكل التكثيف على الشريحة الزجاجية. ومع ذلك، المني الأسماك تظل نشطة مع حركة نشطة لأقل من دقيقتين2. على مستوى تقني، من الضروري أن نعرف أن معدل الإطار "الأمثل" للحصول على المعلومات التفصيلية التي تعطي تعمير مسارات المني15دقيقة. في انخفاض معدلات الإطار، تفاصيل المسار يتم فقدان، خاصة بالنسبة للمني بسرعة وغير الخطية، بينما في أعلى معدلات الإطار، تصبح المعلومات زائدة15،31. لبعض أنواع الأسماك، معدل الإطار (تصل إلى 250 fps) قد لا تكون كافية للعثور على السرعة القصوى للمني لبعض أنواع الأسماك، مثل التيمالوس وسمك السلمون. هذا الاختلاف هو أنواع معينة ويجب أن تحدد لكل نوع من الأنواع توحيد معايير البروتوكول والحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها15،،من2324. عمق غرفة الفرز قد تحد من حركة السوط كبيرة من الأسماك والمنى لم يستطع الوصول إلى الحد الأقصى للسرعة11،،من3233. وعلاوة على ذلك، قد يكون البرنامج بعض القيود في الكشف عن المني الحقيقي عندما يكون هناك تقاطع بين الخلايا.
التقييم الكلاسيكي لجودة الحيوانات المنوية هو إجراء تحليل ذاتي على أساس تقدير تركيز والنسبة المئوية للحركة، التي يمكن أن تنتج تقلبه على النتائج. ومع ذلك، يوفر نظام محوسب لقياسات بارامترات حركية سريعة ودقيقة والكمية. هذا التحليل الموضوعي ويعطي كمية كبيرة من البيانات، ويقلل من تباين النتائج34،35،،من3637. استجابة السلوك حركية الحيوانات المنوية يعتمد على درجة حرارة التحليل، وتختلف بين الأنواع38،،من3940. درجة الحرارة المثلى لتحليل الحيوانات المنوية يمكن أن توفر سرعة الحيوانات المنوية ومدة فترة حركية مماثلة للظروف الطبيعية للإنجاب38،40. ولذلك، يحسن برمجيات تحليل الحيوانات المنوية مع أجهزة التبريد بتقييم نوعية الحيوانات المنوية الأسماك.
ويمكن تحسين نتائج تحليل نوعية الحيوانات المنوية المعرفة حول خصائص الحيوانات المنوية الأسماك ونوعية تستند إلى الفئات السكانية الفرعية الحيوانات المنوية، التي قد تكون المستقبل لتقييم الحيوانات المنوية في جميع الأنواع الحيوانية41،42. على مستوى عملي، هذا الأسلوب يمكن أن يكون مؤشرا لمربي عالية الجودة، ويساعد على الحصول على مزيد من المعلومات حول الحيوانات المنوية عملية الاختيار، حساب الجرعات المنوي للتلقيح الاصطناعي، الحيوانات المنوية المنافسة على أساس السرعة والتدرج و الخصوبة المحتملة. يمكن تطبيق كل هذه المعرفة إلى حقول البحث المختلفة بما في ذلك برامج تربية الأحياء المائية والمحافظة عليها، مما حفز على الاهتمام بتخزين الحيوانات المنوية الأسماك ونعد في العقود الأخيرة2،13. التأثيرات السمية تزداد أيضا اهتماما خاصا بسبب المشاكل البيئية، فضلا عن دراسات تطوير الدراسات فيلوجينيتيكال استناداً إلى الحيوانات المنوية حركية الخصائص43،44.
وقد أظهرت هذا العمل كيفية تعظيم الاستفادة من البرامج التلقائية لتحليل حركية الحيوانات المنوية الأسماك يحسن النتائج. توحيد البروتوكول يجب أن تراعي درجة الحرارة من التحليل، ومعدل الإطار، التي يمكن أن تكون مختلفة تبعاً للأنواع الأحيائية. بيد أن تحليل عدد الحيوانات المنوية الحركة الأسماك له اثنين من الخطوات الحاسمة أن الباحث ينبغي إيلاء اهتمام. جمع الحيوانات المنوية هو الخطوة الأولى الحاسمة التي يمكن أن تدمر عينة بسبب التلوث بالبراز والبول والمياه (مياه البحر أو المياه العذبة). النقطة الحرجة الأخرى يرتبط بلحظة تفعيل الحيوانات المنوية وبداية تسجيلات على أشرطة فيديو. هذه الخطوة ينبغي أن يتم بأسرع لجمع البيانات عندما يكون المني حركة قوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من رابطة التكلفة (الأغذية والزراعة تكلفة العمل FA1205: أكواجاميتي، وبرنامج الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث والابتكار تحت ماري سكلودوفسكا كوري المشروع إعجاب (GA لا 642893). ونود أن نشكر فريق علمي من برويسير، على وجه التحديد للطالب ألبرتو فندريل بيرنابيو، لمشاركته النشطة في تسجيل الفيديو من هذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
