Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल कंप्यूटर की सहायता से शुक्राणु विश्लेषण और शीतलक उपकरणों का उपयोग कर मछली शुक्राणु मूल्यांकन की एक प्रक्रिया का वर्णन करता है । सॉफ्टवेयर प्रजनन सफलता में सुधार करने के लिए जलीय कृषि में एक उपयोगी उपकरण हो सकता है, जो शुक्राणु गतिशीलता पर आधारित मछली शुक्राणु गुणवत्ता का एक तेजी से, सटीक और मात्रात्मक विश्लेषण देता है ।
Abstract
gamete गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए, वहां अभिनव, तेजी से कर रहे हैं, और मात्रात्मक तकनीक है कि जलीय कृषि के लिए उपयोगी डेटा प्रदान कर सकते हैं । शुक्राणु विश्लेषण के लिए कम्प्यूटरीकृत प्रणालियों कई मापदंडों को मापने के लिए विकसित किए गए थे और सबसे अधिक मापा में से एक शुक्राणु गतिशीलता है.
शुरू में, यह कंप्यूटर प्रौद्योगिकी स्तनधारी प्रजातियों के लिए डिजाइन किया गया था, हालांकि यह भी मछली शुक्राणु विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मछली विशिष्ट विशेषताएं है कि इस तरह के सक्रियकरण के बाद एक छोटी गतिशीलता समय के रूप में शुक्राणु आकलन को प्रभावित कर सकते है और, कुछ मामलों में, कम तापमान के लिए अनुकूलन । इस प्रकार, यह गतिशीलता विश्लेषण मछली शुक्राणु विश्लेषण के लिए और अधिक कुशल बनाने के लिए दोनों सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर घटकों को संशोधित करने के लिए आवश्यक है । स्तनधारी शुक्राणु के लिए, हीटिंग प्लेट शुक्राणु के इष्टतम तापमान बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, कुछ मछली प्रजातियों के लिए, यह एक कम तापमान का उपयोग करने के लिए गतिशीलता की अवधि को लंबा लाभप्रद है, के बाद से शुक्राणु कम 2 मिनट के लिए सक्रिय रहते हैं । इसलिए, शीतलक उपकरणों ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर सहित विश्लेषण के समय पर लगातार तापमान पर नमूनों प्रशीतित करने के लिए आवश्यक हैं । इस प्रोटोकॉल के विश्लेषण का वर्णन मछली शुक्राणु गतिशीलता के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग शुक्राणु विश्लेषण और नई शीतलक उपकरणों के लिए परिणामों का अनुकूलन ।
Introduction
प्रजनन की प्रभावकारिता दोनों gametes (अंडे और शुक्राणु) की गुणवत्ता पर निर्भर करता है1,2. यह प्रमुख कारक है कि सफल निषेचन के लिए योगदान देता है, व्यवहार्य वंश3,4के विकास की अनुमति । gamete गुणवत्ता का सुविधाजनक मूल्यांकन एक नमूना की उर्वरता क्षमता को परिभाषित करने के लिए सबसे अच्छा उपकरण है ।
एकाधिक पुरुषों से शुक्राणु मिश्रण कई जलीय वाणिज्यिक प्रजातियों के उत्पादन में एक आम अभ्यास है4. हालांकि, पुरुषों के बीच शुक्राणु परिवर्तनशीलता शुक्राणु प्रतिस्पर्धा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और, नतीजतन, नहीं सभी पुरुषों को समान रूप से जीन पूल5करने के लिए योगदान दे रहे हैं. इस अर्थ में, व्यक्तिगत बोल पड़ना/शुक्राणु सुविधाओं, जैसे गतिशीलता के सही मूल्यांकन, भेदभावपूर्ण व्यक्ति पुरुष प्रजनन क्षमता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए मौलिक है । शुक्राणु गतिशीलता का प्रत्यक्ष अवलोकन गलत और व्यक्तिपरक डेटा का उत्पादन कर सकते हैं क्योंकि यह समय और अनुभव की आवश्यकता होती है, जो परिणाम6,7की निरंतरता और असंगति की कमी की ओर जाता है । हालांकि, वहां रहे है कई अभिनव, तेजी से और मात्रात्मक तकनीक है कि एक विश्वसनीय शुक्राणु गुणवत्ता विश्लेषण प्रदान कर सकते है2,4।
कंप्यूटर की सहायता शुक्राणु विश्लेषण शुक्राणु8गुणवत्ता के बारे में सटीक डेटा की पेशकश करने के लिए विकसित किया गया था । इस प्रौद्योगिकी के एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप है कि शुक्राणु गतिशीलता के आकलन की अनुमति देता है के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर के विकास में शामिल हैं । हालांकि, गतिशीलता पैरामीटर की एक सीमित कारक वीडियो कैमरे के फ्रेम दर है । व्यक्तिगत शुक्राणु पथ वीडियो रिकॉर्डिंग, जो flagellar आंदोलन पैटर्न3,9,10के साथ संबंधित है की लगातार फ्रेम में शुक्राणु सिर केन्द्रक स्थिति पर आधारित हैं, 11. मुख्य काइनेटिक पैरामीटर मापा जाता है सीधे लाइन वेग (VSL), वक्रीय वेग (VCL) और औसत पथ वेग (VAP). VSL समय से विभाजित शुक्राणु द्वारा उठाए गए प्रारंभ और अंत बिंदु के बीच की दूरी है. VCL सटीक शुक्राणु द्वारा लिया पथ के साथ वास्तविक वेग है । VAP गति के एक व्युत्पंन चिकनी पथ के साथ वेग है । ये पैरामीटर अतिरिक्त काइनेटिक जानकारी, रैखिकता (लिन), सीधे (STR), लड़खड़ा (WOB) और पार्श्व सिर आंदोलन (एएलएच) और हरा-पार आवृत्ति (BCF)4,10के आयाम की तरह माप की पिटाई सहित अनुमति देते हैं ।
शुक्राणु विश्लेषण प्रणाली मूलतः स्तनधारी प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया गया था, और एक प्रणाली के लिए आवश्यकताओं की दाता के शरीर के तापमान पर काम करने के लिए है (के बारे में ३७ डिग्री सेल्सियस) । यह सॉफ्टवेयर भी मछली प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, यह शुक्राणु विश्लेषण परिणामों की त्रुटि को कम करने के लिए कुछ रूपांतरों बनाने के लिए आवश्यक है । कुछ मछली प्रजातियों में, जैसे salmonids और मछली8,12, निषेचन कम तापमान पर होता है (4 डिग्री सेल्सियस के आसपास) 2,4। इस प्रकार, शीतलक उपकरणों असहज काम कर रहे परिस्थितियों से बचने के लिए विकसित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, मछली शुक्राणु लाभदायक द्रव में immotile रहे है और एक आसमाटिक सदमे की आवश्यकता को सक्रिय गतिशीलता । मीठे पानी की प्रजातियों के लिए, उत्प्रेरक माध्यम hypotonic परासरणीयता होना चाहिए, जबकि समुद्री प्रजातियों के लिए माध्यम hypertonic होना चाहिए । हालांकि, कुछ प्रजातियों के लिए, के रूप में salmonids, आयन एकाग्रता भी महत्वपूर्ण हो सकता है3,4,9. सक्रियण के बाद, मछली शुक्राणु गतिशीलता की एक तेजी से कमी (कम से 2 मिनट)13,14 और उच्च वेग, के लिए इष्टतम फ्रेम दर निर्धारित करने के लिए विश्वसनीय डेटा15प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण किया जा रहा है की विशेषता है ।
इस अध्ययन के उद्देश्यों के लिए डिजाइन और मछली शुक्राणु नमूनों के लिए प्रशीतन प्रणाली लागू कर रहे हैं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल परिभाषित करता है कि प्रजातियों के आधार पर मानक प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए इष्टतम फ्रेम दर निर्धारित करने के लिए । इस प्रोटोकॉल का उपयोग मछली लाभदायक मूल्यांकन के संदर्भ में नए दरवाजे खोलता है, एक मॉडल के रूप में यूरोपीय मछली का उपयोग कर ।
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Protocol
पशु विषयों को शामिल करने वाली प्रक्रियाओं Universitat Politècnica de València में कृषि उत्पादन और पशुधन की सामान्य दिशा द्वारा (2015/VSC/मटर/00064) अनुमोदित किया गया है ।
1. कैद में परिपक्व यूरोपीय ईल से शुक्राणु ले लीजिए
नोट: का प्रयोग करें यूरोपीय मछली पुरुषों के समुद्री जल के साथ टैंक में बनाए रखा और लगातार तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) पर एक संचलन प्रणाली । साप्ताहिक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से हार्मोन के साथ व्यवहार (मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (एचसीजी); १.५ मछली शरीर के वजन के जी प्रति IU) । Acclimatize मछली धीरे-पानी के साथ प्रतिस्थापन (टैंक में कुल पानी की 1/3) के बाद मीठे जल में 3 दिन के साथ शुरू हर 2 दिन तक ३७.० ग्राम/एमएल के एक लवणता तक पहुंचने तक ।
- बेहतर शुक्राणु की गुणवत्ता के साथ नमूनों को प्राप्त करने के लिए हार्मोन इंजेक्शन के बाद मछली 24 एच Anesthetize ।
- संज्ञाहरण पहले से तैयार: जोड़ें ३०० benzocaine के मिलीग्राम ७०% इथेनॉल के १०० मिलीलीटर । अच्छी तरह मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- प्रणाली पानी की 5 एल के साथ एक लचीला बाल्टी में benzocaine पतला करने के लिए ६० mg/L का अंतिम एकाग्रता पाने के लिए और ठीक से मिश्रण.
- प्रणाली पानी और benzocaine के साथ बाल्टी के लिए मछली हस्तांतरण । कुछ मिनट रुको जब तक मछली शांत हो जाओ ।
- पानी के साथ जननांग क्षेत्र साफ़ करें और मल, मूत्र या समुद्री जल द्वारा शुक्राणु के नमूनों के संक्रमण से बचने के लिए शोषक कागज के साथ सूखे ।
- उदर क्षेत्र में कोमल दबाव लागू करते हैं और 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों वैक्यूम पंप का उपयोग कर में शुक्राणु के नमूनों को इकट्ठा । शुक्राणु की मात्रा 6-7 मिलीलीटर तक, पुरुष पर निर्भर करता है ।
- गतिशीलता विश्लेषण किया जाता है जब तक शुक्राणु के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटे के लिए रखें ।
2. प्रशीतन और शुक्राणु के नमूनों को पतला
- diluter समाधान पहले से तैयार करें ।
नोट: शुक्राणु के नमूनों भरनेवाला प्रत्येक प्रजाति के लिए विशिष्ट समाधान में पतला होना चाहिए ।- मछली शुक्राणु के नमूनों (P1 मध्यम) के लिए गैर उत्प्रेरक माध्यम तैयार करें । सोडियम बिकारबोनिट की ०.४२ ग्राम, सोडियम क्लोराइड की १.८२८ ग्राम, मैग्नीशियम क्लोराइड के ०.१२७ ग्राम, पोटेशियम क्लोराइड के ०.५६ ग्राम और कैल्शियम क्लोराइड की ०.०३७ ग्राम जोड़ें आसुत जल की २५० मिलीलीटर । मिश्रण अच्छी तरह से भंग करने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- एक स्थिर तापमान पर नमूनों को बनाए रखने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कूलर ब्लॉक सेट करें । रुको जब तक तापमान स्थिर ।
- diluter प्रत्येक प्रजाति के लिए विशिष्ट समाधान का उपयोग शुक्राणु नमूने पतला ।
नोट: कमजोर पड़ने अनुपात विशिष्ट प्रजातियों है और प्रोटोकॉल मानकीकरण करने के लिए परिभाषित किया जाना चाहिए । पहला, अनुमान शुक्राणु एकाग्रता के आधार पर पूर्व में प्राप्त गतिशीलता के विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, के रूप में चरण 3 और 4 में बताया गया है । इस विश्लेषण के साथ, यह भी गतिशीलता के प्रतिशत के आधार पर सबसे अच्छा शुक्राणु नमूनों का चयन करने के लिए संभव है. इसके बाद शोधकर्ता सही एकाग्रता के साथ बेहतरीन नमूनों का प्रयोग कर प्रयोग के लिए डाटा एकत्र करना शुरू कर सकते हैं ।- 1:50 के अनुपात के साथ P1 माध्यम में मछली शुक्राणु नमूनों पतला । को तैयार मछली के ५०० µ एल शुक्राणु पतला, जोड़ें ५० ताजा शुक्राणु के नमूने के µ एल और ४५० µ P1 के एल । अच्छी तरह मिलाएं ।
3. शुक्राणु गतिशीलता मापदंडों का मूल्यांकन करें
-
सेट अप सॉफ्टवेयर के गतिशीलता मॉड्यूल
- 4 डिग्री सेल्सियस पर कूलर चरण सेट और जब तक यह स्थिर रुको ।
- सॉफ़्टवेयर खोलें और गतिशीलता मॉड्यूलका चयन करें । यदि आवश्यक हो तो उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड बनाएं ।
- चुनें गुण और शुक्राणु विश्लेषण शुरू करने से पहले वांछित मापदंडों का चयन करें ।
- प्रजातियों पर क्लिक करें । मछली।
- प्रत्येक प्रजातियों के लिए सबसे अच्छा तकनीकी शर्तों के आधार पर फ्रेम प्रति सेकंड और छवियों की संख्याका चयन करें । प्रति सेकंड १२० छवियों पर दोनों विकल्पों को सेट करें ।
- नकारात्मक कंट्रास्ट चुनें । यह शुक्राणु पथ16के सटीक पुनर्निर्माण के लिए अनिवार्य है ।
- इसी मतगणना कक्ष और वीडियो कैमरे के पैमाने का चयन करें । प्रयोग में प्रयुक्त आवर्धन लेंस के लिए वीडियो कैमरा जांचना । गिनती चैंबर और 10x पैमाने के रूप में SpermTrack10 सेट करें ।
नोट: सामान्य तौर पर, गिनती कक्ष में 10 µm की गहराई और 10x का एक इज़ाफ़ा लेंस की सिफारिश की शर्तों के बाद से वे बेहतर सभी शुक्राणु के ध्यान केंद्रित प्रदान करते हैं और कोशिकाओं की सबसे अधिक संख्या पर कब्जा कर रहे हैं. हालांकि, यह प्रत्येक प्रजाति के गतिशीलता विश्लेषण के लिए इष्टतम शर्तों के एक पिछले अध्ययन करने के लिए सिफारिश की है । - कण क्षेत्र और प्रत्येक प्रजातियों के लिए कनेक्टिविटी समायोजित करें । सेट ंयूनतम कण क्षेत्र में 2 µm2 और 7 µm पर कनेक्टिविटी ।
नोट: मछली के लिए, 2-5 µm के बीच कणों क्षेत्र पर्वतमाला के ंयूनतम मूल्य, और कनेक्टिविटी शुक्राणु वेग और फ्रेम दर पर निर्भर करता है । - सेट-अप सहेजें ।
- कैप्चरकरें चुनें.
-
विश्लेषण यूरोपीय मछली शुक्राणु के साथ सॉफ्टवेयर
- 2% BSA के साथ आसुत जल के 25 मिलीलीटर के लिए वाणिज्यिक नमक के ०.९४६ ग्राम जोड़कर उत्प्रेरक समाधान (कृत्रिम समुद्री जल) को तैयार करें ।
- उत्प्रेरक समाधान (कृत्रिम समुद्री जल) और कूलर ब्लॉक में जगह के ५०० मिलीलीटर ले लो ।
नोट: सामान्य रूप में, मछली शुक्राणु एक आसमाटिक सदमे घटना से सक्रिय है, हालांकि कुछ प्रजातियों के लिए आयन एकाग्रता भी महत्वपूर्ण हो सकता है. मीठे पानी की प्रजातियों के लिए, उत्प्रेरक माध्यम hypotonic परासरणीयता होना चाहिए, जबकि समुद्री प्रजातियों के लिए माध्यम hypertonic होना चाहिए । - ठंडा चरण के तहत गिनती कक्ष रखो और तापमान 4 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थिर तक प्रतीक्षा करें ।
- मिश्रण उत्प्रेरक और पतला शुक्राणु शुक्राणु सक्रिय करने और सक्रियण के बाद 5-10 s के बीच गतिशीलता वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।
- उत्प्रेरक समाधान और मतगणना कक्ष में जगह के 4 µ एल ले लो ।
- धीरे शुक्राणु कोशिकाओं में नुकसान से बचने के लिए microcentrifuge 3 बार मिलाते हुए पतला शुक्राणु homogenize ।
- लो ०.५ पतला शुक्राणु के µ एल, उत्प्रेरक के साथ मिश्रण, और जल्दी से मतगणना कक्ष में कवर डाल दिया ।
नोट: यह चरण विश्लेषण शुरू करने के लिए 5 एस से अधिक नहीं लेना चाहिए जितनी जल्दी हो सके । - शुक्राणु कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने और कोशिकाओं (पूरक आंकड़ा 1a) के बीच अवरोधन से बचने के लिए शुक्राणु की एक कम संख्या (१५० से २०० कोशिकाओं) द्वारा परिभाषित किया गया है, जो सबसे अच्छा दृश्य क्षेत्र पाते हैं । शुक्राणु पटरियों, जो गति के अनुसार अलग कर रहे हैं प्राप्त करने के लिए वीडियो कैप्चर का चयन करें ।
- 3 से 7 फ़ील्ड प्राप्त करने के लिए कैप्चर चुनें, जो परिणामों में कम परिवर्तनशीलता प्राप्त करने के लिए इष्टतम अंतराल हैं, और पहले की तरह आगे बढ़ें । रिकॉर्ड वीडियो जब तक १२० s पद-सक्रियण मतगणना कक्ष के आवरण पर संघनित्र से बचने के लिए ।
- सभी फ़ील्ड्स के सामांय दृश्य के लिए बाहर निकलें का चयन करें ।
4. गतिशीलता डेटा प्राप्त करें
- फ़ील्ड का चयन करें । आंशिक | सहेजें और कोई फ़ाइल नाम चुनें । सहेजेंक्लिककरें ।
नोट: स्प्रेडशीट आंशिक डेटा, चार्ट और शुक्राणु पटरियों की छवियों का मतलब मान प्रदान करता है । - सामांय डेटा का चयन करें । फ़ाइल नाम । सहेजें।
नोट: डेटा सभी क्षेत्रों के व्यक्तिगत शुक्राणु के लिए काइनेटिक मान प्रदान करते हैं ।
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Representative Results
शुक्राणु गतिशीलता पर समय प्रभाव का विश्लेषण
यूरोपीय मछली के मामले में, स्थैतिक शुक्राणु का प्रतिशत सक्रियण के बाद 15 एस से १२० एस करने के लिए वृद्धि हुई है (२४.४% से ४०.७%), और मोबाइल प्रगतिशील शुक्राणु का प्रतिशत घटकर (३६.९% से २०.९%) (आंकड़ा 1a और 1b) । गति के आधार पर, शुक्राणु कोशिकाओं को समय के साथ वेग में कमी दिखाई (चित्रा 1C और 1 डी) की कमी हुई. तेजी से वेग के साथ शुक्राणु का प्रतिशत लगभग 23% (४९.४% से २६.६%) और मध्यम वेग के साथ शुक्राणु का प्रतिशत करीब 7% की वृद्धि हुई ।
फ्रेम रेट व मतगणना कक्ष का असर
विभिंन प्रजातियों इष्टतम परिणामों के लिए विभिंन फ्रेम दरों की आवश्यकता है । रूसी स्टर्जन प्रति सेकंड १५० फ्रेम की आवश्यकता है (एफपीएस; चित्र 2a); आम कार्प १०० fps (चित्रा बी) की आवश्यकता है; और grayling के लिए, २०० एफपीएस इष्टतम काइनेटिक परिणाम (चित्रा 2c) प्राप्त करने के लिए पर्याप्त नहीं था । ये परिणाम मतगणना कक्ष का परीक्षण (चित्रा 2a-2c) की गहराई पर निर्भर नहीं थे.
शुक्राणु उपजनसंख्या संरचना
शुक्राणु उपजनसंख्या की पहचान सांख्यिकीय विश्लेषण पर आधारित है । पहला चरण प्रमुख घटकों का निर्धारण है (प्रमुख घटक विश्लेषण; पीसीए) गतिशीलता डेटा का पूरा सेट से. फिर, clustering प्रक्रियाओं शुक्राणु व्युत्पंन सूचकांक पीसीए के बाद प्राप्त के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं ।
इस अध्ययन के लिए, हम अटलांटिक सामन शुक्राणु जो चार अलग उपआबादी दिखाई इस्तेमाल किया, नाम: रैखिक धीमी (कम लिन, STR और VCL), तेजी से रैखिक (लोअर str, उच्च VCL), तेजी से रैखिक (उच्च लिन, str और VCL) और सबसे तेजी से रैखिक (उच्चतम लिन, str, और VCL) । इन उपआबादी का वितरण जंगली जानवरों से पीढ़ियों के साथ कृषि वाले (चित्रा 3) के लिए विविध ।
चित्रा 1 : समय के बाद प्रभाव progressivity और यूरोपीय मछली शुक्राणु के गतिशीलता पर सक्रियण । A और B) progressivity का प्रतिशत क्रमश: 15 और १२० s, क्रमशः; और सी और डी) समय के साथ गति के आधार पर गतिशीलता का प्रतिशत (15 और १२० s पोस्ट-सक्रियण, क्रमशः) । progressivity तीन समूहों में विभाजित किया गया था: प्रगतिशील गतिशील कोशिकाओं (सफेद; VCL मतलब मान ± एसडी: ११४.५ ± १८.२ और १०१.४ ± ३४.५ µm/एस के लिए 15 और १२० एस, क्रमशः), कोई प्रगतिशील गतिशील कोशिकाओं (ग्रे; VCL मतलब मान ± एसडी: ८४.८ ± १७.४ µm/एस के लिए 15 एस और ८४.६ ± १६.५ µm/एस के लिए १२० s), और स्थैतिक शुक्राणु (काला) । शुक्राणु वेग 4 समूहों में विभाजित किया गया था: रैपिड (VCL मतलब मान ± एसडी: ११९.३ ± १३.७ µm/एस के लिए 15 एस और ११८.९ ± १३.३ µm/एस के लिए १२० s; सफेद), मध्यम (VCL मतलब मूल्य ± एसडी: ७९.७ ± १५.५ µm/एस के लिए 15 एस और ७९.६ ± १५.५ µm/एस के लिए १२० एस; लाइट ग्रे) , धीमी गति से (VCL मतलब मान ± एसडी: ३२.९ ± ६.५ µm/एस के लिए 15 एस और ३२.६ ± ६.६ µm/एस के लिए १२० एस; डार्क ग्रे) और स्थैतिक (काला) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : फ्रेम दर और तीन मीठे पानी में मछली प्रजातियों में गिनती चैंबर का प्रभाव: (A) रशियन स्टर्जन (B) कॉमन काप and (C) Grayling. शुक्राणु विश्लेषण ५०, १००, १५० और २०० एफपीएस पर किया गया था, अलग गहराई (10 और 20 µm) के साथ दो वाणिज्यिक गिनती कक्षों का उपयोग कर । ब्लैक सर्कल प्रत्येक प्रजाति के लिए सबसे अच्छा फ्रेम दर का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : शुक्राणु उपआबादी अटलांटिक सामन की तीन पीढ़ियों के संरचना: जंगली नर (F0), और पहले दो कैद (F1 और F2) में उत्पादित पीढ़ियों । क्लस्टर विश्लेषण के बाद, चार उपजनसंख्याों को मनाया गया: रैखिक शुक्राणु धीमी (कम लिन, str और VCL; क्लस्टर 1; काला), तेजी से रैखिक शुक्राणु (लोअर STR, उच्च VCL; क्लस्टर 2; डार्क ग्रे), फास्ट रैखिक शुक्राणु (उच्च लिन, str और VCL; क्लस्टर 3; मध्यवर्ती ग्रे) और सबसे तेजी से रैखिक शुक्राणु (उच्चतम लिन, STR, और VCL, क्लस्टर 4; लाइट ग्रे) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक चित्रा 1. यूरोपीय मछली शुक्राणु के गतिशीलता विश्लेषण से अलग दृश्य क्षेत्रों के रूप में परिभाषित (एक) सबसे अच्छा और (ख) सबसे ज्यादा सेल एकाग्रता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल शुक्राणु विश्लेषण सॉफ्टवेयर मछली सहित विभिंन प्रजातियों के लिए दुनिया भर में शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, मछली कुछ विशिष्ट विशेषताएं है कि शुक्राणु मूल्यांकन को प्रभावित कर सकते हैं । मछली शुक्राणु सक्रियण के क्षण में उच्च गति दिखाई जो जल्दी से गिरावट आती है और सक्रियण के बाद गतिशीलता के एक कम समय की ओर जाता है । इसके अलावा, प्रजनन के तापमान प्रजातियों पर निर्भर है और, कुछ मामलों में, के आसपास हो सकता है 4 ° c2,4,8,12. इस प्रकार, यह मछली शुक्राणु विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटरीकृत प्रणाली की क्षमता में सुधार करने के लिए कुछ रूपांतरों बनाने के लिए आवश्यक है । गतिशीलता पैरामीटर के मूल सिद्धांत के अधिग्रहण और गतिशील शुक्राणु के क्रमिक छवियों का विश्लेषण है । अधिकांश प्रणालियों का उपयोग मानक फ़्रेम दर (16, 25, 30, ५० या ६० एफपीएस) हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर की सीमाओं के कारण17,18,19,20,21,22। हालांकि, कुछ अध्ययनों से पता चला है कि एक उच्च फ्रेम दर ऐसे VCL, STR, BCF15,23,24के रूप में कुछ वेग मापदंडों, बढ़ जाती है । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब यह शुक्राणु के hyperactivation का मूल्यांकन और शुक्राणु11,17,18,19के अधिकतम वेग खोजने के लिए आवश्यक है, 25. विश्लेषण के तापमान के संबंध में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के लिए एक शीतलन प्लेट, और एक नई तकनीक लगातार तापमान पर नमूनों को प्रशीतित करने के लिए भी समय के साथ विश्लेषण में सुधार हो सकता है. वर्तमान काम मछली शुक्राणु गतिशीलता विश्लेषण और तापमान संवेदनशीलता के साथ जुड़े मुख्य समस्याओं में से दो को हल करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है । कुछ मीठे पानी प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित परिणाम के बावजूद, इस पद्धति समुद्री प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि सक्रियण माध्यम प्रत्येक प्रजाति के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
बाजार में, वहां उत्पादों की एक श्रेणी या भी एक ही उत्पाद के विभिंन संस्करणों रहे हैं । यहां तक कि अगर सिस्टम एक ही सिद्धांत हो सकता है, हर एक अलग परिणाम26,27,28के असंगति में जिसके परिणामस्वरूप विवरण है । इसके अलावा, मछली शुक्राणु की गुणवत्ता के मूल्यांकन अभी भी methodological और तकनीकी सीमाएं हो सकता है । शुक्राणु सक्रियकरण तकनीक और सक्रियकरण के बाद विश्लेषण के समय दो आवश्यक कारक है कि शुक्राणु की गुणवत्ता का मूल्यांकन29,30को प्रभावित कर रहे हैं । शुक्राणु के नमूनों के सक्रियकरण और वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए छवि के स्थिरीकरण के बीच का समय पहले सेकंड के बाद से 5 एस के आसपास होना चाहिए (5-20 s के समय अंतराल) सबसे उपयोगी डेटा प्रदान करता है2,4. शुक्राणु विश्लेषण के समय कांच स्लाइड पर संघनित्र समस्याओं के कारण सीमित हो सकता है । हालांकि, मछली शुक्राणु दो मिनट से कम2के लिए एक जोरदार आंदोलन के साथ सक्रिय रहते हैं । एक तकनीकी स्तर पर, यह शुक्राणु पथ15का एक सटीक पुनर्निर्माण देता है कि विस्तार से जानकारी प्राप्त करने के लिए "इष्टतम" फ्रेम दर पता करने के लिए आवश्यक है. कम फ़्रेम दर पर, पथ का विवरण, विशेष रूप से तेज़ और रेखीय शुक्राणु के लिए खो जाते हैं, जबकि उच्च फ़्रेम दरों पर, जानकारी15,31बेमानी हो जाती है । कुछ मछली प्रजातियों के लिए, फ्रेम दर (२५० एफपीएस तक) इस तरह के Grayling और सामन के रूप में कुछ मछली प्रजातियों के लिए शुक्राणु की अधिकतम वेग को खोजने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । इस भिंनता प्रजातियों विशिष्ट है और प्रत्येक प्रजातियों के लिए परिभाषित किया जाना चाहिए प्रोटोकॉल मानकीकरण और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त15,23,24। मतगणना कक्ष की गहराई तक मछली के बड़े flagellum की आवाजाही सीमित हो सकती है और शुक्राणु अधिकतम गति11,३२,३३तक नहीं पहुंच सकी । इसके अलावा, सॉफ्टवेयर असली शुक्राणु का पता लगाने में कुछ सीमाएं है जब वहां कोशिकाओं का एक प्रतिच्छेदन हो सकता है ।
शुक्राणु की गुणवत्ता का शास्त्रीय मूल्यांकन एकाग्रता और गतिशीलता का प्रतिशत है, जो परिणामों पर परिवर्तनशीलता का उत्पादन कर सकते है के आकलन के आधार पर एक व्यक्तिपरक विश्लेषण है । हालांकि, एक कंप्यूटरीकृत प्रणाली गतिशीलता मापदंडों के तेजी से, सटीक और मात्रात्मक माप प्रदान करता है । यह उद्देश्य विश्लेषण डेटा की एक बड़ी राशि देता है और परिणाम३४,३५,३६,३७की परिवर्तनशीलता को कम करता है । शुक्राणु गतिशीलता व्यवहार की प्रतिक्रिया विश्लेषण के तापमान पर निर्भर करता है और प्रजातियों में३८,३९,४०के बीच बदलता है । शुक्राणु विश्लेषण के इष्टतम तापमान शुक्राणु वेग और प्रजनन३८,४०की प्राकृतिक स्थितियों के समान गतिशीलता अवधि की अवधि प्रदान कर सकता है । इसलिए, ठंडा उपकरणों के साथ शुक्राणु विश्लेषण सॉफ्टवेयर मछली शुक्राणु की गुणवत्ता के मूल्यांकन में सुधार ।
शुक्राणु की गुणवत्ता के विश्लेषण के परिणाम मछली शुक्राणु विशेषताओं और शुक्राणु उपजनसंख्या, जो सभी पशु प्रजातियों४१,४२में शुक्राणु मूल्यांकन के भविष्य हो सकता है पर आधारित गुणवत्ता के बारे में ज्ञान में सुधार कर सकते हैं । एक व्यावहारिक स्तर पर, इस तकनीक उच्च गुणवत्ता वाले ब्रीडर्स का एक संकेतक हो सकता है और शुक्राणु चयन प्रक्रिया के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने में मदद करता है, कृत्रिम गर्भाधान के लिए लाभदायक खुराक गणना, शुक्राणु प्रतिस्पर्धा वेग और progressivity पर आधारित है और प्रजनन क्षमता । यह सब ज्ञान जलीय कृषि और संरक्षण कार्यक्रम है, जो पिछले कुछ दशकों में मछली शुक्राणु भंडारण और cryopreservation में ब्याज उत्तेजित सहित विभिंन अनुसंधान क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है2,13। विषाक्तता इफेक्ट भी पर्यावरण की समस्याओं के कारण विशेष रुचि हो रही है, साथ ही शुक्राणु गतिशीलता विशेषताओं४३,४४के आधार पर phylogenetical अध्ययन के विकास के अध्ययन के रूप में.
इस काम से पता चला है कि कैसे मछली शुक्राणु गतिशीलता विश्लेषण के लिए एक स्वत: सॉफ्टवेयर का अनुकूलन परिणामों में सुधार । प्रोटोकॉल के मानकीकरण खाते में विश्लेषण के तापमान और फ्रेम दर है, जो प्रजातियों के आधार पर अलग हो सकता है लेना चाहिए । हालांकि, मछली शुक्राणु गतिशीलता के विश्लेषण दो महत्वपूर्ण कदम है कि शोधकर्ता ध्यान देना चाहिए है । शुक्राणु संग्रह पहला महत्वपूर्ण कदम है कि मल, मूत्र और जल (समुद्री जल या मीठे पानी) द्वारा संदूषणों के कारण नमूने को नष्ट कर सकते हैं । अंय महत्वपूर्ण बिंदु शुक्राणु सक्रियण के क्षण और वीडियो रिकॉर्डिंग की शुरुआत के साथ जुड़ा हुआ है । शुक्राणु के जोरदार आंदोलन के चलते जब डाटा एकत्रित करना हो तो इस कदम को जल्द पूरा किया जाना चाहिए ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस परियोजना को लागत संघ (खाद्य और कृषि लागत लड़ाई FA1205: AQUAGAMETE, और यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और मैरी Sklodowska के तहत नवाचार कार्यक्रम-क्यूरी परियोजना प्रभावित (GA No ६४२८९३) से धन प्राप्त हुआ है । हम इस परियोजना की वीडियो रिकॉर्डिंग में अपनी सक्रिय भागीदारी के लिए, विशेष रूप से छात्र अल्बर्टो Vendrell Bernabéu के लिए, PROiSER की वैज्ञानिक टीम का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
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