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Biochemistry

Chemoreceptor Ligand बाइंडिंग डोमेन के कुशल रिसामने और शुद्धिकरण के लिए विधि

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/57092
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

Summary

एक प्रक्रिया को शामिल निकायों से dCACHE periplasmic ligand बंधन डोमेन के कैम्पिलोबैक्टर jejuni chemoreceptor Tlp3 का खुलासा करने के लिए प्रस्तुत किया है और शुद्धि के लिए प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा उपज ।

Abstract

ligand विशिष्टता के आणविक आधार के elucidation के उद्देश्य से chemoreceptors और संरचनात्मक अध्ययन के प्राकृतिक लाइगैंडों की पहचान, शुद्ध, जोड़ मिलीग्राम बाइंडिंग डोमेन के ligand मात्रा के उत्पादन के द्वारा काफी सुविधा हो सकती है । ई कोलाई (ई. कोलाई) में बैक्टीरियल chemoreceptors की एक्सप्रेस periplasmic ligand बंधन डोमेन heterologously करने के लिए प्रयास अक्सर शामिल निकायों में अपने लक्ष्यीकरण में परिणाम । यहां, एक विधि शामिल निकायों से प्रोटीन वसूली के लिए प्रस्तुत किया जाता है, इसका खुलासा और शुद्धि, periplasmic dCACHE ligand बाइंडिंग डोमेन का उपयोग कर कैम्पिलोबैक्टर jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 एक उदाहरण के रूप में । दृष्टिकोण एक सट अपने6टैग, अलगाव और यूरिया के साथ ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल निकायों के मध्यस्थता solubilisation, यूरिया कमी के द्वारा पुनः प्रकट प्रोटीन, और समानता के माध्यम से शुद्धि क्रोमैटोग्राफी, टैग हटाने और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया । परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी शुद्ध प्रोटीन की तह राज्य की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह प्रदर्शित किया गया है कि इस प्रोटोकॉल आम तौर पर एक घुलनशील और chemoreceptors रूप में अंय जीवाणु crystallisable के dCACHE periplasmic ligand बाध्यकारी डोमेन के मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए उपयोगी है ।

Introduction

Chemotaxis और गतिशीलता को होस्ट1,2,3के बैक्टीरियल रोगजनन और आक्रमण को बढ़ावा देकर कैम्पिलोबैक्टर jejuni colonisation में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते दिखाया गया है । Chemotaxis बैक्टीरिया विकास के लिए एक इष्टतम वातावरण की ओर जाने के लिए अनुमति देता है, के रूप में रासायनिक संकेतों द्वारा निर्देशित । इस प्रक्रिया में प्रोटीन का एक सेट chemoreceptors, या transducer की तरह प्रोटीन (Tlps) के द्वारा intracellular और पर्यावरणीय रासायनिक संकेतों की मांयता शामिल है । अधिकांश chemoreceptors एक extracytoplasmic ligand बाइंडिंग डोमेन (LBD), एक transmembrane डोमेन और एक cytoplasmic संकेत डोमेन के साथ झिल्ली-एंबेडेड प्रोटीन होते हैं, जिसके बाद संकेत संचारित करने वाले cytosolic संकेत प्रोटीन के साथ इंटरैक्ट करता है को flagellar मोटर्स4,5,6,7।

ग्यारह विभिन्न chemoreceptors की पहचान सी. jejuni जीनोम4,8में की गई है । तारीख करने के लिए, इन chemoreceptors के केवल कुछ विशेषता है और Tlp1 के ligand विशिष्टता9, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, और Tlp1113 है जाना जाता है । इस प्रजाति में शेष chemoreceptors के प्राकृतिक लाइगैंडों की पहचान, और अन्य जीवाणुओं में कई chemoreceptors, तह और अत्यधिक शुद्ध रिकॉमबिनेंट chemoreceptor LBDs14के उत्पादन द्वारा बहुत सुविधा हो सकती है, 15 , 16. हालांकि, heterologously एक्सप्रेस periplasmic LBDs में बैक्टीरियल chemoreceptors के प्रयास ई कोलाई में अक्सर परिणाम को शामिल करने के निकायों में उनके लक्ष्यीकरण में17,18,19 . फिर भी, इस घटना आसान अलगाव और हाथ में प्रोटीन की वसूली की सुविधा कर सकते हैं । यहां, एक विधि शामिल निकायों से प्रोटीन वसूली के लिए प्रस्तुत किया है, इसका खुलासा और शुद्धि, एक उदाहरण के रूप में ग. jejuni chemoreceptor Tlp3 के periplasmic LBD का उपयोग कर । इस उदाहरण चुना गया था क्योंकि Tlp3-LBD संवेदन डोमेन के dCACHE परिवार20 के अंतर्गत आता है जो बहुतायत से दो घटक histidine kinases और chemoreceptors में prokaryotes20,21में पाया जाता है, 22 , 23.

इस दृष्टिकोण में, अभिव्यक्ति का निर्माण, एक pET151/D-टोपो वेक्टर के आधार पर, एक N-टर्मिनल को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है6-एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) के बाद टैग को छेड़ो दरार साइट, बाद में टैग हटाने के लिए19। प्रोटोकॉल ई. कोलाई, अलगाव और यूरिया-शामिल किए जाने वाले निकायों के मध्यस्थता solubilisation में प्रोटीन की कमी का वर्णन है, और प्रोटीन यूरिया घट द्वारा पुनः प्रकट । बाद में, नमूना अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है, वैकल्पिक टैग को हटाने और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ । शुद्ध प्रोटीन की तह राज्य परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर पुष्टि की है । इस विधि का एक संशोधित संस्करण है कि पहले से ठीक है और एक अलग chemoreceptor, Helicobacter हेलिकोबेक्टर TlpC19के LBD शुद्ध विकसित किया गया है । यह प्रक्रिया, चित्रा 1में संक्षिप्त, पैदावार 10-20 शुद्ध, untagged Tlp3-LBD प्रति 1 बैक्टीरियल संस्कृति के एल, के एक प्रोटीन शुद्धता के साथ > 90% के रूप में एसडीएस द्वारा अनुमानित-पृष्ठ ।

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Protocol

1. ई. कोलाई में अपने6-Tlp3-LBD की अभिव्यक्ति

  1. Inoculate १५० मिलीलीटर बाँझ Luria-Bertani (LB) शोरबा युक्त ५० µ g mL-1 एम्पीसिलीन with BL21-Codon-Plus (DE3)-RIPL कोशिकाओं pET151/डी-टोपो वेक्टर अपने6-Tlp3-LBD (एमिनो एसिड अवशेषों 42-291) की अभिव्यक्ति के लिए के साथ तब्दील, और यह एक शेखर में ३७ डिग्री सेल्सियस (कक्षा व्यास, 25 मिमी) २०० rpm के साथ रात भर में मशीन ।
  2. छह 2 एल Erlenmeyer कुप्पी का ८०० मिलीलीटर बाँझ पौंड शोरबा और ५० µ जी एमएल-1 एम्पीसिलीन युक्त तैयार करें । Inoculate १.१ कदम से प्राप्त रातोंरात संस्कृति के 20 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक कुप्पी । उंहें ३७ ° c पर २०० rpm पर निरंतर मिलाते के साथ मशीन जब तक ६०० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व ०.६ तक पहुंचता है ।
  3. एक benchtop (१३,००० x g, 4 ° c, 10 मिनट) का उपयोग कर गोली (प्रेरित नियंत्रण नमूना) की बोतल में से एक से 1 मिलीलीटर aliquot ले लो, और supernatant त्यागें । बाद एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल गोली की दुकान ।
  4. 1 मिमी isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) संस्कृति के साथ प्रत्येक कुप्पी को जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित । एक अतिरिक्त 4 एच के लिए २०० rpm पर एक शेखर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी की मशीन जारी रखें ।
  5. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को फसल और supernatant त्यागें ।
    नोट: इस बिंदु पर, प्रक्रिया एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में भंडारण के लिए सेल गोली रखकर रोका जा सकता है ।

2. अलगाव और समावेशी निकायों के विकार

  1. एक २५० मिलीलीटर चोंच के लिए चरण १.५ में प्राप्त सभी सेल छर्रों स्थानांतरण और एक बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ८.०, १५० mm NaCl) के १०० मिलीलीटर जोड़ें. (जमे हुए) पूरी तरह से गल करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें, और गोली reसस्पेंड. नमूना बर्फ पर रखें जब तक अंयथा संकेत दिया ।
  2. कोशिकाओं को लाइसे और जीनोमिक डीएनए की पूरी कतरन सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च दबाव homogeniser तीन बार के माध्यम से reसस्पैंड कोशिकाओं को पारित ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १०,००० x g पर lysate केंद्रापसारक । supernatant (घुलनशील अंश) के एक 1 मिलीलीटर नमूना लीजिए और बाद में एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर । supernatant के बाकी त्यागें और बर्फ पर गोली जगह है ।
    नोट: इस गोली रंग में सफेद है (आसानी से अटूट कोशिकाओं जो रंग में ब्राउन की छाया है से अलग) और शामिल शरीर शामिल हैं ।
  4. शामिल करने के शव गोली अच्छी तरह से 20 मिलीलीटर बर्फ ठंड बफर बी (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, ०.२ मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 1% ट्राइटन एक्स-१००) में reसस्पेंड । यह झिल्ली और झिल्ली प्रोटीन की solubilisation की सुविधा । 1-2 मिनट के लिए भंवर resuspension सहायता के लिए ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  6. गोली अच्छी तरह से 20 मिलीलीटर बर्फ में reसस्पेंड-शीत बफर बी के लिए ट्यूब भंवर द्वारा 1-2 मिनट सुनिश्चित करें कि गोली छोटे टुकड़ों में टूट गया है । प्लास्टिक नमूना ऊपर और नीचे सहायता गोली निलंबन के लिए ।
    नोट: यह अच्छी तरह से गोली reसस्पेंड करने के लिए शामिल शरीर अशुद्धियों से मुक्त प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  7. चरण २.५ दोहराएँ । यदि supernatant बादल या रंग है, दोहराएं कदम २.६ और २.५ (उस क्रम में) जब तक supernatant स्पष्ट और रंगहीन है ।
  8. बर्फ के 20 मिलीलीटर ठंड बफर सी (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, ०.२ mm PMSF) में गोली reसस्पेंड 1-2 मिनट के लिए ट्यूब भंवर द्वारा ।
  9. चरण २.५ दोहराएँ ।
  10. शामिल शरीर गोली भंग करने के लिए 25 मिलीलीटर बर्फ-शीत denaturing बफर डी (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, 8 मीटर यूरिया, 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), ०.२ मिमी PMSF) जोड़ें । 1-2 मिनट के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से reसस्पैंड, या जब तक गोली छोटे टुकड़ों में टूट गया है ।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30-120 मिनट के लिए 30 rpm की रोटेशन दर के साथ अक्षीय रोटेशन के द्वारा सस्पेंशन मिश्रण ।
  12. ३०,००० x जी, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक द्वारा विकृत प्रोटीन समाधान स्पष्ट, बर्फ पर supernatant जगह और गोली त्यागें ।
  13. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता उपाय । 24 एसडीएस-जेल विश्लेषण के लिए एक aliquot ले लो और यह जगह-20 ° c ।
    नोट: इस बिंदु पर, प्रक्रिया स्नैप-ठंड से तरल नाइट्रोजन में aliquoted नमूना द्वारा रोका जा सकता है और इसे रखने के लिए-८० ° c संग्रहण के लिए ।

3. प्रोटीन का फिर से खुलासा

  1. २५० एमएल बफर ई (3 एम यूरिया, १०० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, ०.४ एम एल-arginine monohydrochloride, 20 मिमी कम एल glutathione, 2 मिमी ऑक्सीकरण एल glutathione) एक ५०० मिलीलीटर चोंच में तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए नीचे बफर शांत ।
  2. जोड़ें ६० विविकृत प्रोटीन अपने6-Tlp3-LBD से युक्त मिश्रण बफर ई की २५० मिलीलीटर के लिए चरण २.१३ में प्राप्त की मिलीग्राम, जबकि ५०० rpm पर बफर सरगर्मी । 24-48 एच के लिए ५०० rpm पर लगातार सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस से कम मोड़ मिश्रण की मशीन । इस चरण में अंतिम प्रोटीन एकाग्रता ०.२ मिलीग्राम एमएल-1है ।
  3. एक 8-10 एल बाल्टी में एक बफर के 7 एल तैयार है और यह अगले कदम (चरण ३.४) है कि 24-48 घंटे में जगह ले जाएगा के लिए तैयार करने में 4 ° c के लिए नीचे शांत(चित्रा 1 में फ़्लोचार्ट देखें) ।
  4. 28 मिमी फुलाया व्यास के डायलिसिस टयूबिंग के एक ~ ५० cm टुकड़ा विसर्जित कर दिया, आणविक वजन में कटौती के साथ 12-14 केडीए में २०० मिलीलीटर में 10 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड disodium नमक (EDTA-Na2) और उबलते तक एक गैस लौ पर गर्मी. ddH2O के २०० मिलीलीटर के साथ डायलिसिस झिल्ली कुल्ला ।
  5. एक डायलिसिस टयूबिंग बंद करने के साथ डायलिसिस झिल्ली के एक छोर दबाना और डायलिसिस ट्यूब में ३.२ कदम में प्राप्त मिश्रण को २५० एमएल फिर से खोलना । अंय क्लैंप के साथ खुले छोर को बंद करें । झिल्ली की अखंडता की जांच सुनिश्चित करने के लिए कोई लीक कर रहे हैं ।
  6. पहले से ठंडा 7 एल के साथ एक डायलिसिस बाल्टी में डायलिसिस ट्यूब प्लेस ३.३ चरण में एक तैयार बफर । एक चुंबकीय हलचल बार प्लेस, यह सुनिश्चित करना है कि यह डायलिसिस टयूबिंग स्पर्श नहीं होगा, जबकि सरगर्मी ।
  7. Dialyse ५०० rpm पर सरगर्मी जारी रखने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना और बफर बदल 12 घंटे की अवधि में कम से चार बार । अंतिम बफ़र परिवर्तन करने के बाद, रात भर dialyse करने के लिए नमूना छोड़ दें ।
    नोट: डायलिसिस के दौरान यूरिया की अधिकता (~ 3 मीटर) को धीरे से विविकृत प्रोटीन सॉल्यूशन से निकाल दिया जाता है, जो प्रोटीन को दोबारा मोड़ने की अनुमति देता है । भारी प्रोटीन वर्षण डायलिसिस के अंत में मनाया जा सकता है ।
  8. बाल्टी से डायलिसिस ट्यूब निकालें और एक ५०० मिलीलीटर चोंच में अपनी सामग्री हस्तांतरण । बर्फ पर प्रोटीन समाधान रखें, जब तक अंयथा संकेत दिया ।
  9. एक ५०० मिलीलीटर कांच की बोतल में एक ०.४३ µm ताकना आकार झिल्ली के माध्यम से प्रोटीन समाधान फ़िल्टर किसी भी उपजी प्रोटीन को दूर करने के लिए ।

4. अपने6की शुद्धि-टैग की गईं प्रोटीन का उपयोग कर जुटाये धातु आयन संबध क्रोमैटोग्राफी

  1. चार्ज और equilibrate एक 5 मिलीलीटर पैक chelating कॉलम ।
    1. एक सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए कॉलम कनेक्ट, यह सुनिश्चित करना है कि वहां कोई हवा को जोड़ने टयूबिंग में फंस गया है ।
    2. ddH2O के 25-50 मिलीलीटर से गुजरते हुए कॉलम को धो लें ।
    3. ०.१ मीटर NiCl2 के 3 मिलीलीटर लोड करके कॉलम चार्ज और फिर ddH2के 25 मिलीलीटर से गुजर रहा हे ।
    4. Equilibrate बफर एफ के 25 मिलीलीटर (लोड हो रहा है बफर, 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, ५०० mm NaCl, 20 मिमी imidazole) के साथ कॉलम ।
  2. ३.९ चरण में प्राप्त किए गए प्रोटीन नमूने को समायोजित करने के लिए बफर एफ की संरचना को जोड़कर 1 मीटर Tris-एचसीएल पीएच ८.०, 25 एमएल का 5 एम NaCl और २.५ एमएल का 2 मीटर imidazole स्टॉक सॉल्यूशंस को जोड़ने से ।
  3. 5 मिलीलीटर/मिनट या उससे कम की दर पर कॉलम पर नमूना लोड और प्रवाह के माध्यम से (असीम प्रोटीन) त्यागें ।
  4. गैर विशेष रूप से बाध्य प्रोटीन को दूर करने और प्रवाह के माध्यम से त्यागने के लिए बफर एफ के ५०-१०० मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लें ।
  5. Elute ने अपने6-Tlp3-LBD के साथ 25 एमएल का बफर जी (रेफरेंस बफर, 20 एमएम Tris-एचसीएल, ५०० एमएम NaCl, ५०० एमएम imidazole) और पूल फ्लोर को प्रोटीन युक्त अंशों के साथ (जैसा कि ब्रैडफोर्ड रिएजेंट का उपयोग करके निर्धारित किया था) ।
  6. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर परित नमूने में प्रोटीन एकाग्रता को मापने । एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए एक छोटा सा aliquot ले लो और जगह-20 डिग्री सेल्सियस ।

5. अपने6-टैग हटाने टेव का उपयोग करना (वैकल्पिक)

  1. तैयार, और 4 डिग्री सेल्सियस, बफर एच के 4 एल (टेव दरार बफर, 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, १५० मिमी NaCl, 1% (वी/वी) ग्लिसरॉल, 2 मिमी डीटीटी) के लिए शांत हो जाओ ।
  2. डायलिसिस टयूबिंग (व्यास 2-3 सेमी) के लगभग 5-7 सेमी कटौती और ddH के २०० मिलीलीटर में विसर्जितकर दिया 2 ओ ।
  3. अपने6टैग जोड़ें टेव अपने6टैग को छेड़ने के लिए एक अंतिम दाढ़ अनुपात 1 टेव: 8 प्रोटीन के लिए कदम ४.५ में तैयार प्रोटीन ।
  4. एक डायलिसिस टयूबिंग बंद करने के साथ टयूबिंग के एक छोर दबाना और यह प्रोटीन के साथ भरने/टेव को छेड़ो मिश्रण । अंय अंत बंद करो और सुनिश्चित करें कि कोई लीक कर रहे हैं ।
  5. (कदम ५.१ से) बफर एच के पूर्व ठंडा 4 एल में डायलिसिस ट्यूब प्लेस और 2 एच के लिए सतत सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन । बफर बदलें और टेव-मध्यस्थता दरार प्रतिक्रिया को पूरा करने के लिए अनुमति देने के लिए रात भर डायलिसिस जारी रखें.
  6. इस बीच में, तैयार है और शांत (4 ° c) बफर I के 4 L (10 mm Tris-HCl pH ८.०, १५० mm NaCl, 1% (v/v) ग्लिसरॉल) अगले दिन के लिए तैयारी में ।
  7. रात डायलिसिस के बाद, बफर बफर के लिए मैं कदम ५.६ और dialyse में तैयार करने के लिए एक और 1-2 ज 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  8. डायलिसिस बाल्टी से ट्यूब निकालें, ट्यूब के एक छोर अनक्लिप और एक ५० मिलीलीटर बाज़ ट्यूब के लिए प्रोटीन समाधान हस्तांतरण । एक ०.४३ µm ताकना आकार सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और बर्फ पर रख, जब तक अंयथा कहा ।
  9. नमूना की मात्रा को मापने और Tris को समायोजित, NaCl और imidazole एकाग्रता बफर एफ की रचना करने के लिए (उदा. बफर जे में 25 मिलीलीटर प्रोटीन समाधान के लिए 1 मीटर Tris-एचसीएल पीएच ८.०, १.७५ मिलीलीटर के 5 मीटर NaCl, और 2 एम imidazole के ०.२५ मिलीलीटर के ०.२५ मिलीलीटर जोड़ें) ।
  10. चरण ४.१ में वर्णित के रूप में एक 5 मिलीलीटर HiTrap Chelating HP स्तंभ तैयार करें ।
  11. स्तंभ पर नमूना लोड (प्रवाह दर: 5 मिलीलीटर/) और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा, जो untagged Tlp3-LBD (अवशेषों ४२-२९१) शामिल हैं । अनसट प्रोटीन, द सट अपने6-टैग और उसके6-टेव को कॉलम बनाकर रखे हुए हैं ।
  12. 5 मिलीलीटर बफर एफ (लोड बफर) के साथ कॉलम धो सभी untagged प्रोटीन के माध्यम से प्रवाह और eluate इकट्ठा करने की अनुमति है ।
  13. eluate चरण ५.११ और ५.१२ में प्राप्त पूल और प्रोटीन एकाग्रता उपाय । एक छोटी सी aliquot ले लो और यह दुकान पर-20 ° c एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए ।

6. आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (जेल निस्पंदन) के Tlp3-LBD

  1. एक बफर के 1 एल तैयार (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.०, १५० मिमी NaCl) और यह एक ०.४३ µm झिल्ली का उपयोग कर फिल्टर.
  2. Equilibrate a 26/60 आकार-बहिष्करण स्तंभ बफ़र a के साथ एक प्रवाह दर पर 4 मिलीलीटर/
  3. एक 10 केडीए कट-ऑफ (4 डिग्री सेल्सियस, ४,००० एक्स जी) के साथ 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ध्यानी का उपयोग कर 3-4 मिलीलीटर की एक मात्रा करने के लिए चरण ५.१३ में प्राप्त प्रोटीन नमूना ध्यान केंद्रित ।
  4. १३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा प्रोटीन समाधान स्पष्ट, 30 मिनट के लिए 4 ° c किसी भी उपजी प्रोटीन को हटाने के लिए ।
  5. पूर्व equilibrated 26/60 जेल निस्पंदन कॉलम पर नमूना लोड । 4 मिलीलीटर/min. मॉनिटर यूवी ट्रेस की एक प्रवाह दर पर एक बफर में क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन करते हैं । २१०-२२० मिलीलीटर की अवधारण मात्रा पर Tlp3-LBD elutes । पीक अंशों पूल ।
  6. प्रोटीन एकाग्रता को मापने । एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए एक छोटा aliquot लें ।

7. एसडीएस-प्रोटीन शुद्धि के विभिंन चरणों में एकत्र नमूनों की पृष्ठ विश्लेषण

  1. 1 L तैयार एसडीएस-पृष्ठ चल रहे बफ़र (बफ़र J), जिसमें 25 mm Tris, २५० mm glycine pH ८.३, और ०.१% (w/v) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) ।
  2. 5x एसडीएस के 10 मिलीलीटर तैयार-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर (बफर कश्मीर), युक्त ०.२५ एम Tris-एचसीएल पीएच ६.८, 10% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस, ५०% (वी/वी) ग्लिसरॉल, 1 मिमी डीटीटी, और ०.०५% bromophenol नीला ।
  3. aliquots शुद्धि के विभिंन चरणों के दौरान एकत्र की अनुमति दें (चरण १.३, २.३, २.१३, ४.६, ५.१३, ६.६) गल के लिए ।
  4. प्रत्येक नमूने के लिए, 5x एसडीएस के 2 µ l के साथ कुल प्रोटीन के 15 µ g करने के लिए संगत मात्रा मिश्रण-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर, और ddH2के साथ 10 µ l के लिए मात्रा को समायोजित करें ।
  5. 5-10 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों गर्मी, 30 एस के लिए १०,००० x जी पर उन्हें स्पिन और एक साफ ट्यूब में नमूने हस्तांतरण.
  6. एक एसडीएस-पृष्ठ जेल तैयार, 15% polyacrylamide अलग जेल का उपयोग (के लिए 5 मिलीलीटर: २.५ एमएल 30% (डब्ल्यू/वी.) बीआईएस-acrylamide, १.२ एमएल १.५ एम Tris-एचसीएल नं० ८.८, १.२ एमएल ddH2ओ, ५० µ एल 10% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस, ५० µ एल 20% (डब्ल्यू/वी) अमोनियम persulfate (एपीएस), 3 µ एल tetramethylethylenediamine (TEMED) और 5% polyacrylamide स्टैकिंग जेल (2 मिलीलीटर के लिए: ३४० µ l 30% (w/वि.) भा-acrylamide, २५० µ l 1 M Tris pH ६.८, १.३७ मिलि ddH2O, 20 µ l 10% (w/v) एसडीएस, 20 µ l 20% (w/v) अनुप, 2 µ l TEMED).
  7. ट्रो तंत्र को इकट्ठा करने और निर्माता की सिफारिश के अनुसार के रूप में 1x एसडीएस पृष्ठ चल बफर के साथ भरें ।
  8. एक प्रोटीन आणविक वजन मार्कर और कदम ७.५ में तैयार नमूनों लोड । 25 mA के एक निरंतर वर्तमान में ट्रो प्रदर्शन करते हैं ।
  9. एक कंटेनर में जेल हस्तांतरण और यह ddH के साथ कुल्ला2हे 25% (v/v) isopropanol, 10% (वी/वी) एसिटिक एसिड और ०.०३% (डब्ल्यू/वी) Coomassie नीले दाग समाधान के १५० मिलीलीटर जोड़ें शानदार ब्लू आर २५० । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक क्षैतिज रोटेशन मंच पर कंटेनर रखें ।
  10. ddH के साथ जेल कुल्ला2हे और दाग में 5% (v/v) मेथनॉल और 7% (v/v) एसिटिक एसिड युक्त समाधान में जगह है । 1 एच के लिए एक क्षैतिज रोटेशन मंच का उपयोग कर मिश्रण जबकि दाग ।
  11. जेल और विश्लेषण छवि ।

8. परिपत्र Dichroism (सीडी) स्पेक्ट्रोस्कोपी शुद्ध प्रोटीन की द्वितीयक संरचना का विश्लेषण

  1. स्थानांतरण ०.५-1 एक डायलिसिस ट्यूब में ६.६ चरण में प्राप्त प्रोटीन की मिलीग्राम और यह एक डायलिसिस की 5 l से युक्त बाल्टी में जगह (५० mM सोडियम फास्फेट पीएच ७.४) एल, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा । Dialyse 4 डिग्री सेल्सियस पर लगातार सरगर्मी के साथ नमूना और 2-4 पर कम से 3-4 बफर परिवर्तन प्रदर्शन करने के लिए रात भर Dialyse नमूना जाने से पहले ।
  2. ०.०६ मिलीग्राम एमएल के लिए dialysed प्रोटीन समाधान ध्यान केंद्रित-1 का उपयोग कर एक 10 केडीए कट-ऑफ केंद्रापसारक ध्यानी ।
  3. १३,००० x जी, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक द्वारा समाधान स्पष्ट ।
  4. 20 एनएम मिनट की स्कैन दर के साथ एक spectropolarimeter का उपयोग कर २००-२६० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य सीमा से अधिक 25 डिग्री सेल्सियस से अधिक नमूने के दूर यूवी सीडी स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड-1। डायलिसिस बफ़र एक रिक्त नियंत्रण के रूप में उपयोग करें । तपसिल में रिकॉर्डिंग दोहराएँ और औसत स्पेक्ट्रम उत्पन्न.
  5. DichroWeb विच्छेद25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk) से CDSSTR प्रोग्राम का उपयोग करके CD स्पेक्ट्रा को deconvoluting करके द्वितीयक संरचना सामग्री की गणना करें ।

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Representative Results

ई. कोलाई में अपने6-Tlp3-LBD के रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति शामिल निकायों में प्रोटीन जमाव के परिणामस्वरूप । 1 एल से अभिव्यक्ति की उपज बैक्टीरियल संस्कृति के चरण २.१३ में गणना की लगभग १०० मिलीग्राम था उसके6-Tlp3-शामिल निकायों में जमा LBD । प्रोटीन अलगाव प्रक्रिया, यहां वर्णित है और चित्रा 1में सचित्र, शामिल निकायों के solubilisation के होते हैं, प्रोटीन का खुलासा और शुद्धि, संबध क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से, टैग हटाने और आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी , और पैदावार 10-20 मिलीग्राम शुद्ध, untagged Tlp3-बैक्टीरियल संस्कृति के 1 एल प्रति LBD ।

एक एकल, सममित चोटी २२० मिलीलीटर (चित्रा 2a) की एक प्रतिधारण मात्रा के लिए इसी के रूप में जेल-निस्पंदन स्तंभ से प्रोटीन eluted । आणविक वजन की गणना (मेगावाट) का एक अंशांकन भूखंड का उपयोग कर लॉग (मेगावाट) बनाम अवधारण वॉल्यूम (Vअवधारण (mL) = 549.3-73.9 x लॉग (मेगावाट)) EMBL प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि कोर सुविधा वेबसाइट पर उपलब्ध (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), 29 केडीए के मान से झुकेंगे । यह मान बहुत है कि एमिनो एसिड अनुक्रम (२८.७ केडीए), जो सुझाव दिया है कि Tlp3-LBD समाधान में एक मोनोमर है से गणना करने के लिए बंद किया गया था ।

शुद्धिकरण प्रक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न चरणों में एकत्र किए गए नमूनों को एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण का उपयोग करके मूल्यांकित किया गया. के रूप में चित्रा 2 बीमें दिखाया गया है, शामिल किए जाने वाले निकायों मुख्य रूप से अपने6-Tlp3-LBD निहित । इस प्रोटीन की छोटी मात्रा में भी प्रेरित संस्कृति के घुलनशील अंश में मौजूद थे (IPTG (+)), और प्रेरित संस्कृति में (IPTG (-))-जाहिरा तौर पर T7 पोलीमरेज़ की टपकाना अभिव्यक्ति का एक परिणाम के रूप में । अपने6-Tlp3-LBD 28 केडीए, जो एमिनो एसिड अनुक्रम (३१.८ केडीए) से गणना की मूल्य के करीब है की एक स्पष्ट आणविक वजन के साथ polyacrylamide जेल पर चले गए । अपने6टैग हटाने, अपनत्व क्रोमैटोग्राफी और जेल छानने का कदम अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन (> 90% electrophoretic सजातीयता) झुकेंगे ।

यह पुष्टि करने के लिए कि इस कार्यविधि द्वारा प्राप्त प्रोटीन को जोड़ दिया गया था, उसके6-Tlp3-LBD की द्वितीयक संरचना को CD स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकित किया गया था । α-कुंडलित और β-पत्रक सामग्री सीडी स्पेक्ट्रम से का आकलन (चित्रा 3) का उपयोग कर CDSSTR के मूल्यों दिया 31% α और 23% β. ये मान Jpred3 सर्वर (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (३७% α और 26% β) का उपयोग करके अनुक्रम विश्लेषण से अनुमानित उन लोगों के करीब थे, यह दर्शाता है कि यूरिया-विकृत समावेशी निकायों से बरामद प्रोटीन तह किया गया था ।

Figure 1
चित्र 1: प्रस्तुत विधि की योजनाबद्ध । रिकॉमबिनेंट अपने6-Tlp3-LBD ई. कोलाई में IPTG के साथ प्रेरण पर व्यक्त की है (खंड 1 देखें) । 4 एच अभिव्यक्ति के बाद, बैक्टीरियल कोशिकाओं काटा और लीजड ड (खंड 2 देखें) कर रहे हैं । समावेशी निकायों (आईबी) युक्त अघुलनशील अंश झिल्ली और झिल्ली प्रोटीन दोष को हटाने के लिए धोया जाता है, जिसके बाद आईबी उच्च एकाग्रता में यूरिया युक्त बफर में भंग कर रहे हैं (खंड 2 देखें) । अपने6-Tlp3-LBD बफर में कमजोर पड़ने से फिर से सामने आया है क्रमिक यूरिया हटाने (धारा 3) के लिए थकाऊ डायलिसिस के बाद ई । अपने6-Tlp3-LBD तो खंड 4 में वर्णित के रूप में मैटीरियल धातु आयन संबंध क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है । उसका6टैग टेव का उपयोग कर हटाया जाता है (खंड 5) । untagged Tlp3-LBD केंद्रित है और आगे जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी (धारा 6) द्वारा शुद्ध । एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए नमूनों के संग्रह के लिए अंक * के साथ संकेत दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: रिकॉमबिनेंट Tlp3-LBD का शुद्धिकरण । (a) आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी ट्रेस untagged Tlp3-LBD पर एक Superdex २०० HiLoad 26/60 जेल निस्पंदन कॉलम । २२० मिलीलीटर की अवधारण मात्रा के साथ प्रोटीन eluted । (ख) घटाकर 15% एसडीएस-PAGE Coomassie ब्लू-सना जेल । एम: प्रोटीन आणविक वजन मार्कर; IPTG (-): प्रेरित नियंत्रण नमूना १.३ चरण में एकत्र; IPTG (+): घुलनशील अंश IPTG प्रेरण के बाद (चरण २.३ में एकत्र); आईबी: पृथक समावेशन निकाय (चरण २.१३); अपने6-Tlp3-LBD: ४.६ कदम से प्रोटीन नमूना फिर से सामने आया; untagged Tlp3-LBD: प्रोटीन नमूना ५.१३ कदम में प्राप्त; जेल निस्पंदन 1 और 2: जेल-निस्पंदन कॉलम (चरण ६.६) से प्रोटीन पीक eluted से दो अंश । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: शुद्ध रिकॉमबिनेंट Tlp3-LBD के परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रम । स्पेक्ट्रम 25 डिग्री सेल्सियस में ५० mM सोडियम फॉस्फेट पीएच ७.४ में दर्ज किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

अभिव्यक्ति के लिए एक सरल प्रक्रिया और बैक्टीरियल chemoreceptor Tlp3 के periplasmic LBD के शामिल निकायों से गुना प्रस्तुत किया है । शुद्ध प्रोटीन की तैयारी से अधिक की अभिव्यक्ति शामिल है पीईटी-प्लाज्मिड-एनकोडेड जीन में ई. कोलाई, शुद्धीकरण और समावेशी निकायों के solubilisation, विकृत प्रोटीन का खुलासा और इसके शुद्धि द्वारा लगातार अपनत्व और आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी चरण । यूरिया-सोल्यूशन विकार और कमजोर पड़ने/डायलिसिस-मध्यस्थता का खुलासा प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं, जो के अनुकूलन अक्सर शामिल निकायों में जमा प्रोटीन का उचित renaturation सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है26.

Tlp3-LBD का खुलासा एक दो कदम तरीके में प्राप्त किया गया था, पहले एक यूरिया युक्त बफर में विकृत नमूना कमजोर द्वारा, और फिर इसे से रहित बफर के खिलाफ नमूना dialysing द्वारा । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त प्रोटीन कार्यात्मक और crystallisable18,23। हालांकि, प्रस्तुत विधि कुछ सीमाएं हैं । यह सर्वविदित है कि अमीनो समूहों की carbamylation अक्सर होता है जब प्रोटीन स्वभाव से होता है और27,28,29यूरिया की उपस्थिति में । इस तथ्य के कारण है कि भंग यूरिया समय के साथ मिटता है और cyanate30 का उत्पादन करता है कि प्रोटीन अमीनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एक स्थिर carbamylated उत्पाद बनाने के लिए और, एक छोटी सी हद तक, अन्य कार्यात्मक समूहों के साथ31, ३२. यूरिया का अपघटन क्षारीय पीएच और ऊंचा तापमान की शर्तों के तहत त्वरित है । तो, यह ultrapure से ताजा यूरिया समाधान बनाने के लिए सिफारिश की है (> 99%) ठोस रिएजेंट, और कम तापमान (4 डिग्री सेल्सियस)30,३३, cyanate गठन कम करने पर फिर से खुलासा/ इसके अलावा, इस तरह के Tris, glycine या अमोनियम बिकारबोनिट के रूप में प्राथमिक अमीन, युक्त बफर का चयन, के लिए मिश्रण का उत्पादन cyanate29,३३की सफाई की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है । दूसरे ऑप्शन में यूरिया के बजाय guanidine हाइडरोक्लॉराइड का इस्तेमाल होता है, क्योंकि guanidine हाइडरोक्लॉराइड को केमिकल्स संशोधित प्रोटीन की सूचना नहीं दी गई है ।

यूरिया के अलावा, एक कम करने वाले अभिकर्ता (डीटीटी या β-mercaptoethanol) को प्रायः solubilize समावेशी निकायों की आवश्यकता होती है तथा गैर-देशी इंट्रा और आणविक डाइसल्फ़ाइड बांडों के गठन को उनके घटे हुए राज्य 26 में cysteine अवशेषों को बनाए रखने से रोका जाता है ,३४. Tlp3-LBD एक intramolecular डाइसल्फ़ाइड बांड है, और इस प्रोटोकॉल में, 10 मिमी डीटीटी समावेशी निकायों विकार बफर में शामिल किया गया था (चरण २.१०) अघुलनशील प्रोटीन के resuspension सहायता करने के लिए । डीटीटी एकाग्रता तो द्वारा कम किया गया था ~ १०० गुना द्वारा प्रोटीन reकमजोर नमूना में नमूने, डायलिसिस कदम के बाद धीरे से सभी डीटीटी को दूर करने के लिए. यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कई डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ प्रोटीन का खुलासा करने के लिए इस प्रक्रिया का आवेदन दोनों ऑक्सीकरण और एजेंटों को कम करने की एकाग्रता के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है (जैसे ऑक्सीकरण और कम glutathione (GSSH/GSH), GSSH/डीटीटी, cystamine/cysteamineor cystine/cysteine) डाइसल्फ़ाइड पुलों के समुचित गठन को बढ़ावा देने के लिए३४,३५. इसके अलावा, यदि ब्याज का प्रोटीन cysteines है कि डाइसल्फ़ाइड बॉण्ड गठन में शामिल नहीं हैं, एक एजेंट को कम करने के सभी शोधन बफ़र्स में जोड़ा जाना चाहिए । एक प्रोटीन के एमिनो एसिड अनुक्रम से संभावित डाइसल्फ़ाइड पुलों की भविष्यवाणी silico उपकरण में कई का उपयोग किया जा सकता है (जैसे cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& उपसमूह = propt) ।

विभिंन प्रोटीन की शुद्धि के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग भी धोने कदम ४.४ के दौरान imidazole की एकाग्रता के अनुकूलन की आवश्यकता की संभावना है । के रूप में चित्रा बी (लेन लेबल आईबी) में दिखाया गया है, अलग शामिल किए जाने वाले निकायों, इस उदाहरण में निहित, मुख्य रूप से ब्याज की प्रोटीन । यदि अतिरिक्त महत्वपूर्ण बैंड आईबी नमूना के एसडीएस पृष्ठ जेल पर दिखाई दे रहे हैं, ४.४ कदम में imidazole एकाग्रता बढ़ाने के लिए दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, लेकिन प्रोटीन यील्ड३६,३७कम हो सकती है । अंय विकल्प के लिए imidazole एकाग्रता और पूल eluted अंश है कि ब्याज की प्रोटीन होते है की एक रैखिक ढाल लागू है ।

शुद्धि, आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी में अंतिम चरण के लिए एक साथ eluted कणों के आणविक द्रव्यमान का अनुमान है और प्रोटीन की oligomeric राज्य प्राप्त करने का साधन प्रदान करता है । हालांकि, आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा आणविक द्रव्यमान का आकलन केवल गोलाकार अणुओं, जो कई प्रोटीन के लिए मामला नहीं है के लिए सही है३८,३९. एक प्रोटीन का निर्धारण कर सकते है आणविक द्रव्यमान और उच्च सटीकता के साथ oligomeric राज्य आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी बहु कोण प्रकाश कैटरिंग (एसईसी-मलों)४० या विश्लेषणात्मक ultracentrifugation४१के लिए युग्मित का उपयोग करके । हमने पहले इस बात की पुष्टि की है कि Tlp3-LBD सेक-मलों के विश्लेषण२३का उपयोग करके समाधान में monomeric है और यह परिणाम अन्य dCACHE LBDs४२,४३पर रिपोर्टों के अनुरूप है.

प्रस्तुत प्रोटोकॉल, अपने मूल या थोड़ा संशोधित रूप में, reफ़ोल्ड और एक्स-रे crystallographic अध्ययन के लिए dCACHE परिवार से कई chemoreceptor LBDs को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया है17,18,19, 23 , ४२ , ४४. यह कार्यविधि एक घुलनशील और crystallisable रूप में अंय जीवाणु chemoreceptors के periplasmic LBDs के मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए आम तौर पर उपयोगी हो सकती है । प्रत्येक अलग मामले में, प्रोटोकॉल अनुकूलन की संभावना है । इसके बाद के संस्करण पर चर्चा की, इष्टतम solubilisation शामिल किए जाने वाले निकायों और प्रोटीन repointing के अलावा डिटर्जेंट (जैसे एसडीएस या एन एसिटाइल trimethyl अमोनियम क्लोराइड), additives (जैसे एल-arginine) के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है और उनकी एकाग्रता और व्यक्ति में मशीन समय का समायोजन चरण26,३४,४५,४६. इसके अलावा, इस कदम में प्रोटीन एकाग्रता काफी गुना उपज को प्रभावित करता है । 1 एनजी एमएल से सांद्रता की सीमा-1 करने के लिए 10 मिलीग्राम एमएल-1 आम तौर पर परीक्षण किया जाना चाहिए । Tlp3-LBD के लिए, पुनः प्रकट मिश्रण में प्रोटीन की इष्टतम एकाग्रता ०.२ मिलीग्राम एमएल-1था ।

अत्यंत कम खुलासा उपज आम तौर पर एक संकेत है कि परीक्षण के सामने स्थितियों इष्टतम से दूर हैं । एक उंमीद कर सकते है कि उच्च उपज एक जोड़ प्रोटीन के अनुरूप है, जो सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके मांय किया जा सकता है (के रूप में इस प्रक्रिया में उल्लिखित) । इसके अलावा, crystallisability के परिणामस्वरूप प्रोटीन प्रोटीन के जोड़ राज्य sugguest कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक कार्यात्मक परख (यदि उपलब्ध है) की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रोटीन जोड़ रहा है । उदाहरण के लिए, Tlp3-LBD के मामले में, rehas प्रोटीन अपनी ligand-बाध्यकारी क्षमता को बनाए रखने के लिए दिखाया गया था, जैसा कि इज़ोटेर्माल calorimetry द्वारा दिखाया गया है । 23

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

हम Tlp3-LBD उत्पादन पर अपने शुरुआती काम के लिए यू सी लियू धंयवाद । मायरा ए. Machuca डॉक्टरी छात्रवृत्ति के लिए Departamento Admistrativo डे Ciencia, Tecnología ई Innovación COLCIENCIAS का ऋणी है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris base AMRESCO 497
Sodium chloride (NaCl) MERK MILLIPORE 1064041000
Ampicillin G-BIOSCIENCES A051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MERCK 52332
Triton x-100 AMRESCO 694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD AST0487
Urea AMRESCO VWRC0568
Dithiothreitol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD C-1029
L-arginine monohydrochloride SIGMA-ALDRICH A5131
Reduced L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4251
Oxidized L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) SIGMA-ALDRICH 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) SIGMA-ALDRICH 10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) AMRESCO VWRC20302.260
Imidazole SIGMA-ALDRICH I2399
Glycerol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD BIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2) SIGMA-ALDRICH 339350
Glycine AMRESCO VWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA-ALDRICH L4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) NEW ENGLAND BIOLABS P7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) MERCK UFC901096
50 mL Falcon tube FALCON BDAA352070
Dialysis tubing LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY Dialysis
Snakeskin dialysis tubing THERMO SCIENTIFIC™ 68100
Prepacked HiTrap Chelating HP column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 17-0408-01
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser AVESTIN EmulsiFlex™ - C5
Peristaltic Pump P-1 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column  GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 28989336
JASCO J-815 spectropolarimeter JASCO J-815

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References

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जैव रसायन अंक १३० Chemotaxis chemoreceptor transducer-प्रोटीन की तरह ligand संवेदन डोमेन dCACHE खुलासा
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Machuca, M. A., Roujeinikova, A.… More

Machuca, M. A., Roujeinikova, A. Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain. J. Vis. Exp. (130), e57092, doi:10.3791/57092 (2017).

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