化学感受器配体结合域的高效复用与纯化方法
December 12th, 2017
提出了一种 dCACHE 周质配体结合域的复用过程, 该方法由包涵体化学感受器 Tlp3 和纯化, 产生毫克量的蛋白质.
该程序的总体目标是从包涵体中重新折叠化学感受器配体结合域并纯化它以用于结构和功能研究。为了确定细菌化学感受器发送什么信号以及如何发送，可以使用分离的配体结合结构域来筛选小分子文库或确定有和没有配体的结构。大肠杆菌中细胞外配体结合结构域的压迫通常会导致在包涵体中沉积。
在这里，我们展示了如何从包涵体中回收毫克级的功能性蛋白。首先，用 pET151 D-TOPO 载体转化的 BL21-CodonPlus RIPL 细胞接种 150 mL 含有每 mL 氨苄青霉素 50 μg 的无菌 LB 肉汤，用于表达六组氨酸 TIp3-LBD。将培养物在 200 RPM 和 37 摄氏度下孵育过夜。
准备六个 2L 锥形瓶，其中含有 800 mL 无菌 LB 肉汤和每 mL 氨苄青霉素 50 μg。用 20 mL 的过夜培养物接种每个培养瓶。将烧瓶在 37 摄氏度下孵育，以 200 RPM 的速度连续振荡，直到 OD 600 达到 0.6。
此时，通过向每个培养瓶中加入 1 毫摩尔 IPTG 来诱导蛋白质表达。继续将培养瓶在 37 摄氏度下在摇床中以 200 RPM 的速度再孵育 4 小时。通过在 5000 xg 和 4 摄氏度下离心 15 分钟来收获细胞。
然后，丢弃上清液。将所有细胞沉淀转移到 250 mL 烧杯中，并加入 100 mL 缓冲液 A.如果冷冻，让细胞完全解冻，然后重悬沉淀。除非另有说明，否则将样品保存在冰上。
接下来，将重悬的细胞通过高压匀浆器三次，以裂解细胞并确保基因组 DNA 完全剪切。然后，将裂解液以 10， 000 xg 和 4 摄氏度离心 15 分钟。收集 1 mL 上清液样品并将其储存在零下 20 摄氏度，用于后续的 SDS-PAGE 分析。
然后，丢弃剩余的上清液，将沉淀物置于冰上。接下来，将包合体沉淀彻底重悬于 20 mL 冰冷的缓冲液 B 中，这有助于膜和膜蛋白的溶解。涡旋样品 1 到 2 分钟，以帮助重悬。
离心样品后，先将试管旋转 1 至 2 分钟，将沉淀再次重悬于 20 mL 冰冷的缓冲液 B 中。确保颗粒被打碎成小块。然后，上下移液样品以重悬。
像以前一样离心样品并弃去上清液。如果上清液混浊或有色，请再次离心样品，并使用额外的冰冷缓冲液 B 重悬。重复离心并重悬，直到上清液澄清无色，然后再次沉淀。
向沉淀中加入 20 mL 冰冷的缓冲液 C，涡旋试管 1 至 2 分钟以重悬。然后，离心样品后，加入 25 mL 冰冷的变性缓冲液 D.涡旋试管 1 至 2 分钟或直到沉淀破碎成小块，彻底重悬包涵体沉淀。以 30 RPM 和 4 摄氏度的轴向旋转混合悬浮液 30 至 120 分钟。
通过在 30， 000 xg 和 4 摄氏度下离心 30 分钟来澄清变性蛋白质溶液。然后，将上清液置于冰上并丢弃沉淀。在 500 RPM 下搅拌 250 mL 缓冲液 E 的同时，加入 60 毫克含有六组胺 TIp3-LBD 的变性蛋白质混合物。
将重新折叠的混合物在 4 摄氏度下孵育，并以 500 RPM 的速度连续搅拌 24 至 48 小时。最终蛋白质浓度为 0.2 mg/mL。根据文本方案准备 7 L 预冷缓冲液 A 和透析管后，使用透析管盖夹住透析膜的一端，并将透析混合物转移到管道中。
然后，夹紧开口端并确保没有泄漏。将透析管放入装有预冷缓冲液 A 的透析桶中，然后加入磁力搅拌棒，确保搅拌时不会接触透析管。在 4 摄氏度下透析样品，以 500 RPM 的速度连续搅拌，并在 12 小时内至少更换缓冲液 4 次。
最后一次更换缓冲液后，将样品透析过夜。第二天早上，从桶中取出透析管，将其内容物转移到 500 mL 烧杯中。除非另有说明，否则将蛋白质溶液保存在冰上。
通过 0.43 微米孔径的膜将蛋白质溶液过滤到 500 mL 玻璃瓶中，以去除任何沉淀的蛋白质。根据文本方案洗涤、充电和平衡螯合柱后，通过添加 25 mL 5 M 氯化钠、2.5 mL 1 M tris-HCl（pH 值为 8.0）和 2.5 mL 2 M 咪唑储备溶液，将获得的重新折叠的蛋白质样品调整为缓冲液 F 的组成。以每分钟 5 mL 或更低的速率将样品上样到色谱柱上，并丢弃含有未结合蛋白的流出液。
然后，用 50 至 100 mL 缓冲液 F 洗涤色谱柱，以去除非特异性结合的蛋白质并丢弃流出液。用 25 mL 缓冲液 G 洗脱六组蛋白 TIp3-LBD，然后，汇集含有蛋白质的流通级分。根据文本方案制备缓冲液 H 和透析管后，将六组胺标记的 TEV 蛋白酶添加到管中的六组胺标记蛋白中。
添加 1 TEV 与 8 蛋白质的最终摩尔比。将夹持的透析管放入预冷的 4 L 缓冲液 H 中，并在 4 摄氏度下连续搅拌孵育 2 小时。然后，更换缓冲液并继续透析过夜，以使 TEV 介导的切割反应完成。
更换缓冲液 I 后，过滤蛋白质溶液并再次调整样品，将样品上样到准备好的 5 mL HiTrap 螯合 HP 柱上。以每分钟 5 mL 的流速收集含有未标记 TIp3-LBD 的流出液。在裂解的蛋白质上，裂解的六组沙啶标签和六组沙丁 TEV 被色谱柱保留。
使用 5 mL 缓冲液 F 洗涤色谱柱，让未标记的蛋白质流过并收集洗脱液。然后，在平衡体积排阻柱并根据文本方案浓缩和澄清蛋白质样品后，将样品加载到预平衡的 26/60 凝胶过滤柱上。以每分钟 4 mL 的流速施用缓冲液 A，并监测蛋白质洗脱的 UV 痕量。
TIp3-LBD 以 210 至 220 mL 的保留体积洗脱。最后，在色谱之后，合并组分，然后测量蛋白质浓度并进行 SDS-PAGE。本视频中演示的蛋白质分离程序每 L 细菌培养物产生 10 至 20 mg 纯未标记的 TIp3-LBD。
如图所示，从凝胶过滤柱洗脱的蛋白质具有一个对称峰，对应于 220 mL 的保留体积，计算分子量为 29 kDa。如 SDS-PAGE 所示，包涵体主要包含六组氨酸 TIp3-LBD，表观分子量为 28 kDa，接近根据氨基酸序列 31.8 kDa 计算的值。去除六组他啶标签、亲和层析和凝胶过滤步骤得到高纯度蛋白质。
使用 CDSSTR 的 CD 光谱显示，六组氨酸 TIp3-LBD 的二级结构由 31% α-螺旋和 23%β-折叠含量组成。这些也接近使用 JPred 3 服务器进行序列分析的预测值分别为 37% 和 26%。该协议从开始到结束至少需要五天时间，如有必要，可以在三个不同的阶段暂停。
在尝试此过程时，重要的是要记住，通过涡旋或上下移液将包涵体彻底完全重悬于变性缓冲液中对于整个实现至关重要。看完这个视频，你应该对如何重新折叠和纯化化学感受器 TIp3 的配体结合结构域有了很好的了解。纯化的蛋白质可用于结合酸，以研究配体对该受体的特异性。
此外，我们之前已经表明，通过该程序获得的蛋白质可用于产生高度有序的晶体，这为研究其配体特异性的结构基础铺平了道路。该程序通常可用于从其他细菌以可结晶和可溶形式生产 mg 量的化学感受器。我们已经以其原始或略微修改的形式使用该方案来重新折叠和纯化其他此类化学感受器的配体结合域，用于晶体学研究。
请记住，在每种情况下，可能需要优化方案，例如，变性和复性缓冲液的组成以及孵育时间。
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概览
本文介绍了一种从包涵体中重折叠弯曲杆菌属化学感受器Tlp3的dCACHE质膜间隙配体结合域的程序。该方法允许纯化毫克数量的功能性蛋白用于进一步研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 结构生物学
- 微生物学
背景
- 细菌化学感受器在信号转导中起着关键作用。
- 在大肠杆菌中表达配体结合域通常导致包涵体形成。
- 孤立的配体结合域可用于结构和功能研究。
- 从包涵体中恢复功能性蛋白对研究至关重要。
研究目的
- 从包涵体中重折叠并纯化Tlp3配体结合域。
- 实现结构研究和配体筛选。
- 提供获得功能性蛋白的可靠方法。
使用的方法
- 将转化的BL21-CodonPlus RIPL细胞接种到LB培养基中。
- 在200 RPM和37摄氏度下过夜孵育。
- 从包涵体中重折叠蛋白。
- 纯化重折叠蛋白以进行进一步分析。
主要结果
- 成功恢复了毫克数量的功能性Tlp3-LBD。
- 展示了从包涵体的重折叠过程。
- 在配体筛选和结构研究中的潜在应用。
- 建立了一个可靠的蛋白纯化协议。
结论
- 该程序有效地从包涵体中恢复功能性蛋白。
- 该方法可以促进细菌化学感受器的进一步研究。
- 未来的研究可以利用纯化的蛋白进行各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Recovering functional ligand binding domains from inclusion bodies enables target validation and structural studies for bacterial chemoreceptors, supporting early discovery of antimicrobial targets. This refolding and purification method provides milligram quantities of pure, folded protein suitable for ligand screening and crystallization, reducing mechanistic uncertainty in target de-risking. The approach enhances portfolio triage by delivering reproducible, soluble protein for downstream biophysical and functional assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing purified ligand binding domains for structural and functional analysis.
- Operational Value: Supports biological de-risking through recovery of milligram amounts of folded protein from inclusion bodies.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by yielding soluble, crystallizable protein for ligand specificity studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for screening against small molecule libraries to identify ligand specificity.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent production of pure, folded protein.
- Scalability: Enables platform reuse for other bacterial chemoreceptor ligand binding domains with similar protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by providing protein for structural studies that inform ligand-receptor interactions.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target function through confirmed secondary structure via circular dichroism spectroscopy.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by delivering protein suitable for crystallographic and binding studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead identification, providing purified protein for structural and functional characterization essential for early-stage antimicrobial target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling structural studies of ligand binding domains.
- Screening: Delivers assay readiness through production of pure, soluble protein suitable for ligand screening applications.
- Analytics: Provides quantitative outputs via circular dichroism spectroscopy to confirm folded state and secondary structure content.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by enabling crystallization and structural determination of ligand-bound states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for producing milligram amounts of folded ligand binding domains across multiple bacterial chemoreceptor targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recovery of functional protein with confirmed secondary structure.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of refolding and purification workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reduced biological risk in early target assessment.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural and ligand-binding data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, inclusion body isolation, and refolding optimization.
- Needs instrumentation for high-pressure homogenization, centrifugation, chromatography, and circular dichroism spectroscopy.
- Demands cross-team standardization of buffer compositions and dialysis protocols for consistent results.
- Involves adaptation considerations for different ligand binding domains based on denaturing and refolding buffer optimization.
- Includes practical limitations such as the need for optimization of denaturing and refolding conditions for each new target.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Expression of His6-TIp3-LBD in E. coli
2:29
Isolation and Denaturation of Inclusion Bodies
5:34
Protein Refolding
7:39
Purification of His6-tagged Protein Using Immobilized Metal Ion Affinity Chromatogrphy
8:49
His6-tag Removal Using TEV Protease and Size-excluson Chromatography of Tlp3-LBD
11:06
Results: Expression, Refolding, and Purification of Tlp3-LBD
12:41
Conclusion
