本文中，我们利用一种定制的微流控装置，对单个线虫进行活体成像。在该装置中，多条线虫被分别限制在独立的腔室中，从而实现对多种生物学过程的多重化、长期监测。
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本文内容
摘要
摘要
近十年来，微流控技术已被应用于研究小型动物，包括线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），并被证明是一种便捷的活体成像平台，可在实时条件下精确控制实验环境。本文中，我们利用此前发表的定制微流控装置 WormSpa，对单个线虫进行活体成像。该装置将多条线虫分别限制在独立的腔室中，从而实现对多种生物学过程的多重长期监测。为展示其功能，我们进行了原理验证实验：在装置内使线虫感染致病菌，并持续监测单个个体中免疫应答基因的表达动态及产卵行为。该装置结构简单、操作便捷，适用于此前无微流控实验经验的研究人员。我们建议，该方法将有助于众多希望在明确定义的条件下对生物学过程进行长期观察的研究者。
引言
环境条件的变化可能导致遗传程序的激活，伴随特定基因表达的诱导与抑制1,2。这些动力学变化在同一动物的不同组织之间以及不同动物之间可能存在差异。因此，对这类遗传程序的研究需要能够对单个动物进行长期成像，并精确动态控制环境条件的方法。
近年来，微加工流体装置已被用于研究多种小型动物的反应和行为，包括线虫、果蝇、水熊等3,4,5,6,7。其应用包括例如深度表型分析、在化学刺激下对神经元活动进行光遗传学记录，以及对运动行为（如运动和泵动）的追踪8,9,10,11。
基于微流控的方法具有多种特性，可为长期纵向成像研究生物对环境刺激的响应带来....
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方案
以下方案使用 WormSpa5，这是一种先前已描述的用于线虫长期成像的微流控装置。WormSpa 的制备（起始步骤为获取作者提供的 CAD 文件）较为直接，但需要一定的专业知识。在大多数情况下，可由核心设施或提供此类服务的商业公司完成装置的制备。在制备装置时，务必明确要求特征结构的高度为 50 µm。
1. 实验设置
- 将微流控装置安装在带有电动载物台的倒置荧光显微镜上。
- 将轨道摇床放置在显微镜附近，但需确保摇床产生的振动不会直接影响显微镜。例如，可将摇床置于固定在墙上的搁板上，使其不与光学实验台接触。
- 将注射泵放置在轨道摇床上。用胶带将泵固定在摇床上，以防止摇动时发生晃动。
2. 微流控环境的制备
注意：实验过程中，四个注射器通过注射器管路连接至微流控装置，如图1所示。本步骤描述了这些注射器的准备过程。除非另有说明，注射器管路应尽可能短，但不得拉紧。
- 准备一个出口注射器和一根注射器管。该注射器（图1中的S1）之后将通过注射器管连接至装置的出口，用于临时储存从装置中流出的液体。
- ....
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结果
在25 °C条件下，从L1幼虫滞育期后46小时的年龄同步化年轻成虫线虫12被加载至装置中，具体操作如实验方案所述。每条线虫被单独安置在不同的通道内，从而实现对个体动物对病原体反应的长期纵向测量。当实验成功时，大多数线虫在整个实验过程中会保留在其所在的通道内。在此情况下，只需将目标通道置于成像光路中，即可获取单条线虫的图像，无需主动寻找动物位置。图2A展示了单条代表性线虫在装置中持续10小时的明场图像。尽管线虫被限制在各自的通道内，它们仍可沿通道上下游移动，并能自由转动头部。这一点至关重要，可确保装置本身不会对动物造成应激或伤害。
通过监测线虫对细菌感染的反应 P. aeruginosa，一种被研究得最为透彻的细菌病原体之一 秀丽隐杆线虫它也是一种机会性人类病原体，可导致囊性纤维.......
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讨论
微流控工具在研究线虫方面具有多种优势。与标准的NGM琼脂平板相比，在PDMS装置中成像可提供更高的成像质量。可对同一条线虫进行多次成像，而传统方法则需将线虫从平板上挑取并置于显微镜载玻片上进行成像。此外，可保持或按需调节线虫所处的微环境，从而精确绘制环境组成与动物反应之间的关系。
本文展示了如何利用定制的微流控装置（WormSpa）对多个个体线虫在机会性病原菌P. aeruginosa PA14感染下的宿主反应进行成像，从而实现宿主对细菌感染反应的纵向测量。在整个实验过程中，无需干扰样本即可在多个时间点获取明场和荧光图像。特别是，每10分钟检测一次产卵动力学和irg-1基因的表达情况，相较于传统方法，时间分辨率显著提高14,15。
在此装置中，可通过在任意时间点重新访问每条线虫的保存位置，对多条线虫进行纵向测量。这一点在图2
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国国家科学基金会资助项目 PHY-1205494 和 MCB-1413134（EL）以及韩国国家研究基金会资助项目 2017R1D1A1B03035671（KSL）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| WormSpa | N/A | N/A | WormSpa 的 CAD 文件可从 Levine 实验室获取。 |
| 复式显微镜 | Zeiss | AxioObserver Z1 | 配备电动载物台的倒置荧光显微镜 |
| 注射泵 | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| 管路 | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 内径 0.034” (0.86 mm)，外径 0.052” (1.32 mm) |
| 注射器针头 | CMLsupply | 901-20-050 | 20 号 × 1/2” 钝头不锈钢套管 |
| 注射器滤器 | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm 注射器滤器，带 5 µm Supor 膜 |
| 注射器 | Qosina | C3307 | 10 mL 雄性鲁尔锁式注射器 |
| 三通阀 | ColeParmer | FF-30600-23 | 大孔径三通止流阀，雄性锁扣，10 个/包，非无菌 |
| 圆柱销 | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 不锈钢圆柱销（直径 1/32" × 长度 1/2"） |
| 低吸附微量离心管 | Corning | CL S3206 | 0.65 mL 低吸附 snap cap 微量离心管 |
参考文献
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress.
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