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Bioengineering

Caenorhabditis एलिगेंस में अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक Microfluidic प्लेटफार्म

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57348
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Physics Education, Kongju National University, 2Department of Physics, Harvard University, 3FAS Center for Systems Biology, Harvard University

Summary

इस अनुच्छेद में, हम व्यक्तिगत कीड़े के लाइव इमेजिंग एक कस्टम microfluidic डिवाइस को रोजगार का प्रदर्शन । उपकरण में, एकाधिक कीड़े अलग अलग कक्षों तक ही सीमित हैं, विभिंन जैविक प्रक्रियाओं के मल्टीप्लेक्स अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति ।

Abstract

पिछले दशक में, microfluidic तकनीक निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंससहित छोटे जानवरों का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है, और एक सुविधाजनक लाइव इमेजिंग मंच के सटीक नियंत्रण के लिए क्षमताओं को उपलब्ध कराने के रूप में उपयोगी साबित कर दिया है वास्तविक समय में प्रयोगात्मक शर्तों । इस अनुच्छेद में, हम व्यक्तिगत कीड़े के लाइव इमेजिंग WormSpa, एक पहले से प्रकाशित कस्टम microfluidic डिवाइस को रोजगार का प्रदर्शन । उपकरण में, एकाधिक कीड़े अलग अलग कक्षों तक ही सीमित हैं, विभिंन जैविक प्रक्रियाओं के मल्टीप्लेक्स अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति । क्षमता को समझाने के लिए, हम सबूत के सिद्धांत का प्रयोग किया है जिसमें कीड़े रोगजनक बैक्टीरिया के साथ डिवाइस में संक्रमित थे, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जीन और अंडा बिछाने की अभिव्यक्ति की गतिशीलता व्यक्ति में लगातार निगरानी की गई जानवरों. इस डिवाइस के सरल डिजाइन और आपरेशन microfluidic आधारित प्रयोगों के साथ कोई पिछले अनुभव के साथ उपयोगकर्ताओं के लिए यह उपयुक्त बनाते हैं । हम प्रस्ताव है कि इस दृष्टिकोण कई अच्छी तरह से परिभाषित शर्तों के तहत जैविक प्रक्रियाओं के अनुदैर्ध्य टिप्पणियों में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

Introduction

पर्यावरण की स्थिति में परिवर्तन आनुवंशिक कार्यक्रम के सक्रियकरण के लिए प्रेरण और विशिष्ट जीन1,2की अभिव्यक्ति के दमन के साथ नेतृत्व कर सकते हैं । ये काइनेटिक परिवर्तन एक ही जानवरों में और विभिन्न जानवरों के बीच ऊतकों के बीच चर सकता है । इस तरह के आनुवंशिक कार्यक्रमों का अध्ययन इसलिए तरीकों कि व्यक्तिगत पशुओं के अनुदैर्ध्य इमेजिंग अनुमति देते है और पर्यावरण की स्थिति के सटीक गतिशील नियंत्रण प्रदान करने के लिए कहते हैं ।

हाल के वर्षों में, microfabricated द्रव उपकरणों के कीड़े, मक्खियों, पानी भालू और अधिक3,4,5,6, सहित छोटे जानवरों में प्रतिक्रिया और व्यवहार के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, 7. अनुप्रयोगों में शामिल हैं, उदाहरण के लिए, गहरी phenotyping, रासायनिक उत्तेजनाओं के जवाब में ंयूरॉन गतिविधि के optogenetic रिकॉर्डिंग, और गतिवान और पम्पिंग के रूप में मोटर व्यवहार की ट्रैकिंग8,9,10 , 11.

Microfluidic-आधारित कई गुण है कि लंबे समय तक लाभ सकता है अवधि अनुदैर्ध्य पर्यावरण cues के लिए प्रतिक्रिया के इमेजिंग, स्थानीय microenvironment, लचीला डिजाइन है कि रखरखाव की अनुमति देता है की सटीक गतिशील नियंत्रण सहित व्यक्तिगत पशुओं अलग तिमाहियों में, और इमेजिंग के लिए अनुकूल विशेषताओं । हालांकि, एक लंबे समय के लिए एक microfluidic चैंबर में पशुओं को बनाए रखने के उनके अच्छे प्राणियों पर ंयूनतम प्रतिकूल प्रभाव के साथ एक चुनौती है, जो microfluidic डिवाइस के डिजाइन में विशेष रूप से देखभाल के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रयोग के निष्पादन की आवश्यकता है ।

यहाँ हम WormSpa के उपयोग का प्रदर्शन, Caenorhabditis एलिगेंसके अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक microfluidic डिवाइस. 5 व्यक्तिगत कीड़े कक्षों में सिमटे हुए हैं । तरल और बैक्टीरियल सस्पेंशन की एक निरंतर कम प्रवाह की गारंटी देता है कि कीड़े अच्छी तरह से खिलाया और पर्याप्त रूप से अच्छे स्वास्थ्य को बनाए रखने और तनाव को कम करने के लिए सक्रिय हैं, और कक्षों की संरचना कीड़े अंडे देना करने के लिए अनुमति देता है । डिजाइन और WormSpa के आपरेशन की सादगी microfluidics में कोई पिछले अनुभव के साथ शोधकर्ताओं को अपने स्वयं के अनुसंधान की योजना में इस उपकरण को शामिल करने की अनुमति चाहिए ।

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Protocol

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करता है WormSpa5, वर्म के अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए पहले से वर्णित microfluidic डिवाइस । WormSpa के निर्माण (सीएडी फ़ाइलों है कि अनुरोध पर लेखकों से प्राप्त किया जा सकता है के साथ शुरू) सीधा है, लेकिन कुछ विशेषज्ञता की आवश्यकता है । ज्यादातर मामलों में, निर्माण आसानी से एक कोर सुविधा द्वारा या एक वाणिज्यिक कंपनी है कि ऐसी सेवाएं प्रदान द्वारा किया जा सकता है । जब उपकरण गढ़े, निर्दिष्ट करने के लिए सुनिश्चित करें कि सुविधाओं की ऊंचाई ५० µm है ।

1. प्रायोगिक सेटअप

  1. एक मोटर चालित चरण के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर microfluidic डिवाइस माउंट.
  2. खुर्दबीन के करीब एक कक्षीय शेखर प्लेस, लेकिन सुनिश्चित करें कि शेखर से कंपन सीधे माइक्रोस्कोप को प्रभावित नहीं करता है । उदाहरण के लिए, एक दीवार है कि ऑप्टिकल तालिका के साथ कोई संपर्क नहीं करता है पर तय शेल्फ पर शेखर रखो ।
  3. कक्षीय शेखर पर एक सिरिंज पंप रखें. पंप को शेखर को टेप करें ताकि वह हिलती हुई बजना न हो ।

2. Microfluidic वातावरण तैयार करना

नोट: प्रयोग के दौरान चार सिरिंज सिरिंज ट्यूबों के माध्यम से microfluidic डिवाइस से जुड़े होते हैं, जैसा कि चित्रा 1में उल्लिखित है. यह चरण इन सिरिंजों की तैयारी का वर्णन करता है. अंयथा उल्लेख किया है, उंहें तना हुआ बिना संभव के रूप में सिरिंज ट्यूबों रखें ।

  1. एक आउटलेट सिरिंज और एक सिरिंज ट्यूब तैयार करें. इस सिरिंज ( चित्रा 1में एस) बाद में सिरिंज ट्यूब के माध्यम से डिवाइस के आउटलेट से जुड़ा हो जाएगा, और डिवाइस से बाहर आने के द्रव के अस्थायी भंडारण के लिए इस्तेमाल किया.
    1. एक 20 जी x 1/2 इंच सिरिंज टिप के प्लास्टिक भागों को हटाने के द्वारा एक अनुकूलक सुई बनाओ, केवल सुई (धातु भाग) रखते हुए । चिमटा के साथ प्लास्टिक और धातु भागों पकड़ और उन्हें अलग खींच कर ऐसा करते हैं । सुई पर शेष प्लास्टिक के अवशेषों को एक Bunsen बर्नर के साथ जला दिया जा सकता है ।
    2. चिमटा के साथ अपने दो सिरों पकड़े हुए प्रयोगात्मक सेटअप की ज्यामिति के अनुसार सुई मोड़ । डिजाइन में यहां वर्णित है, अपने बीच में सुई झुकने के एक कोण ~ ११० ° सबसे सुविधाजनक है ।
    3. ट्यूब में अनुकूलक सुई आधा रास्ता प्लग. दूसरे आधे बाद में डिवाइस में खामियों को दूर किया जाएगा । सिरिंज ट्यूब एक रिसाव के बिना एक 20 ग्राम सिरिंज टिप के साथ संगत होना चाहिए (उदाहरण के लिए, ०.८६ मिमी और १.३२ मिमी के बाहरी व्यास के भीतरी व्यास के साथ टयूबिंग). अनुशंसित ट्यूब लंबाई ~ ५० सेमी है ।
    4. एक 10 मिलीलीटर luer-लॉक सिरिंज एक 20 जी एक्स 1/2 इंच सिरिंज टिप के माध्यम से अन्य (खुला) सिरिंज ट्यूब के अंत करने के लिए कनेक्ट.
  2. बफर प्रवेश सीरिंज और सिरिंज ट्यूबों तैयार करते हैं । इन सीरिंज में से एक ( चित्रा 1में S2) तरल पदार्थ है कि डिवाइस में चला जाता है और इंजेक्शन प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए एक जलाशय के रूप में प्रयोग किया जाता है । अंय सिरिंज ( चित्र 1में S3) बफ़र exchange के लिए आवश्यक है, के रूप में ३.२ चरण में बताया गया है ।
    1. एक 3-way वाल्व के लिए एक 10 मिलीलीटर luer-लॉक सिरिंज (S2) सीधे कनेक्ट और एक सिरिंज ट्यूब के माध्यम से एक ही वाल्व करने के लिए एक और सिरिंज (S3) कनेक्ट (चित्रा 1): एक सिरिंज टिप के माध्यम से ट्यूब करने के लिए S3 कनेक्ट, और एक और सिरिंज टिप के माध्यम से वाल्व को ट्यूब कनेक्ट.
      नोट: जिस क्रम में ये सामग्रियां कनेक्टेड हैं, उससे कोई फर्क नहीं पड़ता ।
    2. 3 तरह वाल्व के शेष बंदरगाह के लिए एक सिरिंज ट्यूब कनेक्ट । चरण 2.1.2 में के रूप में एक और अनुकूलक सुई तैयार, और सिरिंज ट्यूब के अन्य (खुला) अंत में सुई आधा रास्ता प्लग.
    3. इस तरह सेट है कि चरण -8 और S2 में सिरिंज ट्यूब S3 (चित्रा 1) बंद कर दिया है, जबकि जुड़े रहे हैं वाल्व निर्धारित करें ।
  3. एक कीड़ा-प्रवेश सिरिंज और एक सिरिंज ट्यूब तैयार करें. इस सिरिंज ( चित्रा 1में S4) डिवाइस में कीड़े लोड करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    1. एक 10 मिलीलीटर luer-लॉक सिरिंज (S4) के लिए एक लंबी सिरिंज ट्यूब कनेक्ट. तरल पदार्थ है कि लदान के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की मात्रा से इस ट्यूब की लंबाई निर्धारित; उदाहरण के लिए, १०० सेमी टयूबिंग का समर्थन करता है पर 2 मिलीलीटर तरल (भी, चरण ४.२ देखें) ।
    2. चरण 2.1.2 में के रूप में एक और अनुकूलक सुई तैयार, और सिरिंज ट्यूब के अन्य (खुला) अंत करने के लिए सुई का एक आधा प्लग.
  4. सभी सीरिंज और एस के साथ टयूबिंग-मध्यम12 दो बार कुल्ला । सीरिंज और एस के साथ ट्यूबों-मध्यम भरें, देखभाल करने के लिए सभी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए ले ।
  5. उपकरण आउटलेट के आउटलेट सिरिंज ट्यूब कनेक्ट.
    1. आउटलेट बंदरगाह के लिए सिरिंज ट्यूब के अंत में अनुकूलक सुई में प्लग.
    2. एस-मध्यम की एक छोटी मात्रा के लिए उपकरण को भरने के आउटलेट के माध्यम से, एक छोटे से एस मध्यम जब तक दोनों बफर प्रवेश और कीड़ा प्रवेश से बाहर आता है सुई ।
  6. इस उपकरण के बफर-प्रवेश बंदरगाह के लिए बफर प्रवेश सिरिंज ट्यूब कनेक्ट, जबकि एक पिन के साथ कीड़ा प्रवेश plugging (स्टेनलेस स्टील dowel पिन के साथ एक 1/
  7. डिवाइस में बफ़र का एक निरंतर प्रवाह इंजेक्ट । एक सिरिंज पंप13पर बफर प्रवेश सिरिंज s2 लोड, और इस तरह के मध्यम s2 में लगातार 3 µ एल की एक प्रवाह दर पर डिवाइस में इंजेक्शन है कि पंप सेट/

3. Microfluidic डिवाइस में लोड हो रहा है बैक्टीरिया

  1. एस-मीडियम12में निलंबित ई कोलाई OP50 तैयार करें ।
    1. एक मानक प्रोटोकॉल के बाद, inoculate के ५० मिलीलीटर और एक एकल कॉलोनी के साथ एक २५० मिलीलीटर कुप्पी, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    2. 10 मिनट के लिए ४००० rpm पर रात भर संस्कृति केंद्रापसारक और एस के 30 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड-मध्यम ।
    3. एक 5 µm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर । ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में अपनी ऑप्टिकल घनत्व द्वारा बैक्टीरियल एकाग्रता को मापने, और 3 के एक आयुध डिपो६०० के लिए एकाग्रता को समायोजित । इस उच्च घनत्व कीड़े अच्छी तरह से खिलाया रखने के लिए आवश्यक है ।
  2. OP50 निलंबन के साथ डिवाइस में बफ़र विनिमय ।
    1. एक साफ सिरिंज (S5) OP50 निलंबन से भरा तैयार करें । खड़ी सिरिंज पकड़ और शीर्ष पर सभी हवाई बुलबुले इकट्ठा करने के लिए कई बार यह नल.
    2. डिवाइस के लिए कनेक्शन को बंद करने के लिए बफर-प्रवेश सीरिंज के 3 तरह के वाल्व बारी है, और दो सीरिंज, S2 और S3 कनेक्ट. सिरिंज पंप से S2 छुड़ाना ।
    3. वाल्व से डिस्कनेक्ट S2 और वाल्व को S5 कनेक्ट । सभी OP50 बफर का एक छोटा सा s3 में चला जाता है जब तक कि वाल्व के माध्यम से S5 के शीर्ष पर एकत्र हवा बाहर पुश । ऐसा करने में, सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुला S5 या वाल्व में रहता है ।
    4. 3-way वाल्व को वापस मूल स्थिति S3 और s5 के बीच कनेक्शन को बंद करने और डिवाइस के लिए s5 कनेक्ट करने के लिए बारी है । सिरिंज पंप पर S5 लोड । कक्षीय शेखर है कि पंप रखती है पर बारी । लगभग २०० rpm को झटकों की गति निर्धारित करें ।
    5. प्रवाह दर सेट करने के लिए १०० µ l/ समय यह नए बफर के लिए लेता है डिवाइस में कीड़े के आने के लिए बफर-प्रवेश सिरिंज ट्यूब (ऊपर वर्णित टयूबिंग के साथ 5 मिनट के आसपास) की लंबाई पर निर्भर करता है । एक उच्च प्रवाह दर एक तेज बफ़र exchange आवश्यक है, तो नियोजित किया जा सकता है ।
    6. एक बार OP50 बफर डिवाइस भर में फैलता है, 3 µ एल के लिए वापस प्रवाह दर सेट/

4. Microfluidic डिवाइस में कीड़े लोड हो रहा है

  1. एक छोटे से कम बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब (६५० µ l) तैयार करें और इसे OP50 निलंबन के १०० µ l के साथ भरें । स्थानांतरण के आसपास 20-30 आयु-सिंक्रनाइज़ युवा वयस्क कीड़े (४६ घंटे L1 25 डिग्री सेल्सियस पर लार्वा गिरफ्तारी) एक NGM से (निमेटोड विकास मध्यम) एक कीड़ा लेने के साथ एक के बाद उंहें एक से उठा द्वारा ट्यूब के लिए थाली । आयु-सिंक्रनाइज़ेशन एक मानक प्रोटोकॉल12के बाद किया जा सकता है ।
  2. OP50 निलंबन के साथ कीड़ा-प्रवेश सिरिंज और सिरिंज ट्यूब ( चित्रा 1में S4) भरें. कीड़े के साथ microcentrifuge ट्यूब में तरल पदार्थ के ~ ५०० µ एल इंजेक्षन । कृमि-प्रवेश सिरिंज ट्यूब में कीड़े के साथ निलंबन ड्रा. सुनिश्चित करें कि सिरिंज ट्यूब काफी लंबी है (> 1 मीटर) और है कि तैयार कीड़े सिरिंज ट्यूब में रहने के लिए और सिरिंज S4 करने के लिए सभी तरह से नहीं बनाते हैं.
  3. कीड़ा-प्रवेश करने के लिए S4 कनेक्ट. microfluidic डिवाइस में कीड़ा-प्रवेश सिरिंज ट्यूब में सभी कीड़े सुई. डिस्कनेक्ट S4 और सिरिंज ट्यूब. एक पिन के साथ कीड़ा प्रवेश प्लग ।
  4. यांत्रिक पंप ( चित्रा 1) से बफर प्रवेश सिरिंज S2 छुड़ाना और मैन्युअल रूप से एस 3 और S2 नियंत्रण अलग चैनलों में सभी कीड़े धक्का करने के लिए । S2 दबाव चैनलों में कीड़े कदम होगा, जबकि $ s दबाने रिवर्स दिशा में उन्हें स्थानांतरित कर देगा । एक चैनल लोड हो जाने के बाद, प्रत्येक चैनल में कीड़ा अन्य कीड़ों की प्रविष्टि को ब्लॉक कर देगा ।
  5. कीड़े 2-3 घंटे के लिए नए वातावरण को समायोजित करते हैं ।

5. एक इमेजिंग प्रोटोकॉल की स्थापना

  1. सुरक्षित रूप से डिवाइस में स्थित हैं कि सभी कीड़े का पता लगाएं, और अपने माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करता है कि छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में उनमें से प्रत्येक के लिए एक इमेजिंग स्थिति सेट. ध्यान दें कि कुछ मामलों में (उदा. जब उच्च आवर्धन वांछित है, या जब एक छोटे सीसीडी संवेदक के साथ कैमरों का उपयोग कर) एकाधिक इमेजिंग पदों प्रत्येक चैनल के लिए आवश्यक हैं ।
    नोट: हालांकि यह मैंयुअल रूप से किया जा सकता है, कुछ अधिग्रहण सॉफ्टवेयर संकुल एक पाठ फ़ाइल है कि जहां छवियां लिया जाना चाहिए पदों की सूची लोड कर सकते हैं । के बाद से इन पदों WormSpa में नियमित रूप से आदेश दिए हैं, एक उपयोगकर्ता एक छोटी सी कहानी लिख सकते है (उदा, पायथन या वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर में) है कि स्वचालित रूप से ऐसी सूची बनाता है । इस स्क्रिप्ट का सटीक स्वरूप फ़ाइल प्राप्ति सॉफ़्टवेयर द्वारा अपेक्षित स्वरूप पर निर्भर करेगा ( अनुपूरक सामग्री 1में एक उदाहरण देखें) ।
  2. समय-चूक इमेजिंग की आवश्यक आवृत्ति सेट करें । उदाहरण के लिए, संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा जीन की प्रतिक्रिया की इमेजिंग फ्रेम प्रति 10 मिनट की एक आवृत्ति पर किया जाता है । सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक चैनल (उदा ब्राइट-फील्ड और GFP प्रतिदीप्ति) हर समय पॉइंट पर अधिग्रहीत किए जाते हैं ।

6. मेजबान Pseudomonas संक्रमण के लिए प्रतिक्रिया

नोट: यह चरण होस्ट रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट है । वैकल्पिक रूप से, एक एक बफर है कि ब्याज की अंय पर्यावरणीय cues शामिल तैयार कर सकते है (बायोटिक और अजैव तनाव, ड्रग्स, संकेत अणुओं, आदि.) ।

  1. SK-मीडियम14में निलंबित Pseudomonas aeruginosa PA14 को तैयार करें ।
    1. Inoculate पौंड और एक एकल कॉलोनी के ५० मिलीलीटर के साथ एक २५० मिलीलीटर कुप्पी, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    2. Inoculate पौंड की ५० मिलीलीटर और संस्कृति के एक aliquot के साथ एक और २५० मिलीलीटर कुप्पी, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    3. 10 मिनट के लिए ४००० rpm पर रात भर संस्कृति केंद्रापसारक और एसके के 10 मिलीलीटर मध्यम में गोली reसस्पेंड । बैक्टीरियल एकाग्रता को मापने और६०० = 4 आयुध डिपो के लिए एकाग्रता को समायोजित ।
    4. एक साफ कुप्पी को निलंबन स्थानांतरण, और 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर और एक और 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी जबकि मिलाते हुए । इस चरण में प्लेट-मशीन मानक हत्या परख14में कदम नकल ।
    5. एक 5 µm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर । यह उपकरण कॉलेस्ट्रॉल से बैक्टीरियल समुच्चय को रोकने के लिए है ।
  2. PA14 निलंबन के साथ डिवाइस में OP50 निलंबन, चरण ३.२ में के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन बदलें । 10 घंटे के लिए इमेजिंग रखें ।

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Representative Results

उम्र सिंक्रनाइज़ युवा वयस्क कीड़े (४६ घंटे 25 डिग्री सेल्सियस पर पोस्ट L1 लार्वा गिरफ्तारी)12 डिवाइस में लोड किए गए थे, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है । कीड़े व्यक्तिगत रूप से अलग चैनल में स्थित थे, रोगज़नक़ के लिए ' जानवरों की प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य माप को सक्षम करने से । जब प्रयोग सफल होता है, ज्यादातर कीड़े प्रयोग की अवधि के लिए अपने चैनल में रहते हैं । इस मामले में, व्यक्तिगत कीड़े की छवियों बस इमेजिंग पथ में अपने चैनल रखकर लिया जाता है, को सक्रिय रूप से पशु का पता लगाने की जरूरत से परहेज । चित्र 2 एक डिवाइस में 10 घंटे के पाठ्यक्रम पर एक प्रतिनिधि कीड़ा के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों से पता चलता है । जबकि कीड़े अपने चैनल के भीतर सीमित कर रहे हैं, वे ऊपर ले जा सकते है और बहाव, और स्वतंत्र रूप से उनके सिर बारी कर सकते हैं । यह गारंटी है कि डिवाइस ही तनाव का कारण नहीं है या जानवरों को नुकसान पहुंचाने के लिए महत्वपूर्ण है ।

हम पी aeruginosa, सी. एलिगेंसका सबसे अच्छा अध्ययन बैक्टीरियल रोगजनकों में से एक द्वारा जीवाणु संक्रमण के लिए कीड़े की प्रतिक्रिया पर नजर रखी । यह भी एक अवसरवादी मानव रोगज़नक़ जो सिस्टिक फाइब्रोसिस और प्रतिरक्षा रोगियों में संक्रमण का कारण बनता है । ऐसे नैदानिक अलग PA14 के रूप में पी aeruginosaके विशेष उपभेदों के साथ कीड़े खिला, घातक आंत्र संक्रमण की ओर जाता है, और इस प्रक्रिया में शामिल डाह कारक भी स्तनधारी मेजबान के संक्रमण में फंसा रहे हैं । 14 , 15

जीवाणु संक्रमण के दौरान जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के पैटर्न की जांच करने के लिए, फ्लोरोसेंट पत्रकारों को नियोजित किया जा सकता है । कई जीन है कि संक्रमण के लिए गतिशील प्रतिक्रिया प्रदर्शित करने के अलावा, हम irg-1 (संक्रमण प्रतिक्रिया जीन 1) के transcriptional प्रतिक्रिया, इमेजिंग GFP प्रतिदीप्ति से ट्रांसजेनिक कीड़े व्यक्त irg-1:: GFP (AU0133 [agIs17 ( pirg-1:: GFP; pmyo-2:: mCherry)], Ausubel प्रयोगशाला से प्राप्त) । irg-1 पी aeruginosa PA14 द्वारा संक्रमण के प्रारंभिक चरण में संक्रमित पशुओं की आंत में दृढ़ता से प्रेरित किया जा करने के लिए जाना जाता है । 16 , 17 चित्र 2 बी एक प्रतिनिधि कृमि के समय चूक छवियों को दिखाता है ( चित्रा 2ए) में के रूप में एक ही जानवर । प्रत्येक प्रतिदीप्ति छवि इसी उज्ज्वल क्षेत्र छवि के तुरंत बाद लिया गया था । पहले 5 घंटे के बाद संक्रमण में, GFP प्रतिदीप्ति मध्य शरीर और पूंछ में केवल हल्के बढ़ जाती है । फिर, प्रतिदीप्ति में एक पर्याप्त वृद्धि मनाया जाता है, मध्य शरीर से शुरू । प्रत्येक वर्म में कुल प्रतिदीप्ति समय पोस्ट संक्रमण के एक समारोह के रूप में चित्रा 2सी में रची गई है । इन आंकड़ों न केवल पहले से वर्णित प्रेरण irg-1 PA14 संक्रमण पर, लेकिन यह भी समय और प्रेरण की सीमा में कीड़ा करने वाली कीड़ा परिवर्तनशीलता को समझाने ।

WormSpa microfluidic डिवाइस के डिजाइन फिल्टर जो प्रत्येक व्यक्ति कृमि5द्वारा निर्धारित अंडे एकत्र शामिल हैं । एक बार अंडे हैच, L1 लार्वा फिल्टर के माध्यम से धोया और आउटलेट ट्यूब में हैं । यह हमें मैंयुअल रूप से अंडे की निगरानी के जीवाणु संक्रमण के दौरान व्यक्तिगत कीड़े के कैनेटीक्स बिछाने की अनुमति दी । चित्रा 2 में के रूप में एक ही कीड़ा द्वारा रखी अंडे की समय चूक छवियों चित्रा 3एमें दिखाया गया है । ये छवियां सही चित्रा 2में इसी उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के बाद लिया गया । प्रत्येक कृमि द्वारा रखी अंडे की संचयी संख्या चित्रा 3बीमें समय के बाद संक्रमण के एक समारोह के रूप में दिखाया गया है, और पूरी आबादी पर औसत और मानक विचलन चित्रा 3सीमें दिखाया गया है. इन आंकड़ों पर कब्जा पशु के लिए पशु परिवर्तनशीलता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंडे में पहले वर्णित गिरावट के रूप में संक्रमण की प्रगति । इसके विपरीत, संक्रमित पशुओं में अंडा बिछाने की दर में गिरावट नहीं करता है जब तक यह चोटियों पर ~ ५४ घंटे 25 डिग्री सेल्सियस5पर L1 पोस्ट,18.

Figure 1
चित्रा 1: एक microfluidic डिवाइस में कीड़े के लाइव इमेजिंग की प्रयोगात्मक योजना. कीड़े कीड़ा प्रवेशके माध्यम से डिवाइस में भरी हुई हैं, और बाद में अलग चैनलों में धकेल दिया जाता है । बैक्टीरियल सस्पेंशन एक यांत्रिक एक कक्षीय शेखर पर घुड़सवार पंप द्वारा बफर प्रवेश से डिवाइस में इंजेक्शन है । बफ़र डिवाइस के आउटलेट पोर्ट के माध्यम से बाहर निकालता है । चार सीरिंज (एस 4, S2/S5, S3, और S4) डिवाइस संचालित करने के लिए उपयोग किया जाता है । लाल डैश्ड लाइनों सिरिंज और डिवाइस को जोड़ने के सीरिंज ट्यूबों हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि जीन अभिव्यक्ति कैनेटीक्स । (क) उज्ज्वल क्षेत्र और (ख) GFP प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा लिया गया एक प्रतिनिधि कीड़ा के समय चूक छवियों । सबसे बाएं चित्र रोगज़नक़ शुरू किया गया था, जबकि rightmost छवियों PA14 द्वारा 10 घंटे के बाद संक्रमण लिया गया था बस से पहले लिया गया था । छवियों के बीच समय अंतराल 1 घंटा है । (ग) वैयक्तिक कृमियों में कुल irg-१:: GFP प्रतिदीप्ति का टाइम कोर्स. प्रत्येक पंक्ति एक ही जानवर से मेल खाती है । पंक्तियों का अर्थ प्रतिदीप्ति अवरोही क्रम में सॉर्ट किया गया था । प्रतिदीप्ति तीव्रता रंग कोडित है और सही पर रंग पैमाने पर दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि अंडा-बिछाने कैनेटीक्स । (एक) चित्रा 2ए और बीमें दिखाया गया एक ही कीड़ा द्वारा रखी अंडे की संख्या का समय चूक छवियों. सबसे बाएं चित्र रोगज़नक़ शुरू किया गया था, जबकि rightmost छवियों PA14 द्वारा 10 घंटे के बाद संक्रमण लिया गया था बस से पहले लिया गया था । छवियों के बीच समय अंतराल 1 घंटा है । (ख) व्यक्तिगत कीड़े में अंडे की संचयी संख्या का समय पाठ्यक्रम. प्रत्येक पंक्ति एक ही जानवर से मेल खाती है । पंक्तियां वर्म प्रति रखी अंडों की कुल संख्या के अवरोही क्रम में सॉर्ट की गई थीं । अंडे की संख्या रंग कोडित है और सही पर रंग पैमाने पर दिखाया गया है । (ग) समय के एक समारोह के रूप में कीड़ा प्रति रखी अंडे की औसत संख्या । धूसर क्षेत्र ± एक मानक विचलन इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Material 1
अनुपूरक सामग्री 1: एक नमूना स्क्रिप्ट जो WormSpa डिवाइस में सभी चैनलों के लिए इमेजिंग स्थिति वाले एक पाठ फ़ाइल बनाता है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

Microfluidic उपकरण कीड़े का अध्ययन करने में कई लाभ प्रदान करते हैं । एक PDMS डिवाइस में इमेजिंग एक मानक NGM आगार प्लेट के साथ तुलना में उच्च इमेजिंग गुणवत्ता प्रदान करता है । एकाधिक छवियों को एक एकल कीड़ा से लिया जा सकता है, इसके विपरीत में पारंपरिक तरीकों में जानवरों की थाली से उठाया और इमेजिंग के लिए एक खुर्दबीन स्लाइड पर घुड़सवार हैं । इसके अलावा, microenvironment जिसमें कीड़े रहते लगातार या वांछित के रूप में संग्राहक रखा जा सकता है, पर्यावरण की संरचना और जानवरों की प्रतिक्रिया के बीच सटीक मानचित्रण की अनुमति ।

यहां हम प्रदर्शन कैसे इमेजिंग द्वारा जीवाणु संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के एक अनुदैर्ध्य माप प्रदर्शन करने के लिए अवसरवादी रोगज़नक़ के लिए कई व्यक्तिगत कीड़े की प्रतिक्रिया पी aeruginosa PA14 एक कस्टम microfluidic डिवाइस (WormSpa) का उपयोग कर । दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियों को कई बार पर चल रहे प्रयोग perturbing बिना लिया गया । विशेष रूप से, अंडे की कैनेटीक्स बिछाने और irg-1 जीन अभिव्यक्ति हर 10 मिनट, पारंपरिक तरीकों पर लौकिक संकल्प में एक महत्वपूर्ण वृद्धि14,15की जांच की गई ।

इस डिवाइस में, कई कीड़ों के अनुदैर्ध्य माप किसी भी समय में प्रत्येक कृमि के बचाया स्थान पर दोबारा गौर करके किया जा सकता है । यह आंकड़े 2सी और 3 बी, जहां हम irg-1मात्रा में प्रदर्शित किया गया:: GFP प्रतिदीप्ति और अंडे व्यक्तिगत कीड़े द्वारा रखी । इन आंकड़ों से पता चलता है कि कीड़े काइनेटिक प्रोफाइल की व्यापक रेंज प्रदर्शित करते हैं । के रूप में पहले एकल सेल अध्ययन में दिखाया गया19,20,21, इस व्यक्तित्व आनुवंशिक सर्किट के डिजाइन को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही अलग रास्ते19के बीच सहसंबंध, 22.

सफल प्रयोगों के लिए, यह microfluidic डिवाइस में कीड़े जल्दी से लोड करने के लिए महत्वपूर्ण है । जबकि कीड़े आगर सतह पर क्रॉल, वे तरल वातावरण में पिटाई करते हैं, और इस व्यवहार एक आनुवंशिक कार्यक्रम में जो AMP सक्रिय प्रोटीन kinases23,24शामिल हैं लाती है । इस अवांछनीय गड़बड़ी को कम करने के लिए, यह उनके अलग कक्षों में कीड़े जल्दी से जगह महत्वपूर्ण है, के रूप में चैंबर में microstructures और PDMS की हवा पारगम्यता ठोस सतह नकल करता है कि एक वातावरण के साथ कीड़े प्रदान करते हैं । 5 हालांकि उच्च दबाव आवेदन तेजी से कीड़े लदान में मदद करता है, ज़ोर डिवाइस बहुत ज्यादा कीड़े पर यांत्रिक तनाव पैदा कर सकता है । कीड़े कि बुरी तरह से बल दिया है फ़ीड या अंडे देना नहीं है, एक स्पष्ट रूप से चौकस phenotype सामान में जिसके परिणामस्वरूप25। लदान के बाद, कीड़े 2-3 घंटे के लिए ई. कोलाई OP50 खिलाया, कीड़े microfluidic वातावरण को समायोजित करने के लिए और शोधकर्ता एक को जानवरों का पालन करें और उन है कि क्षतिग्रस्त हो गए थे त्यागने का अवसर प्रदान करने की अनुमति दे रहे हैं ।

आकार और प्रत्येक कक्ष में microstructures की रिक्ति 25 डिग्री सेल्सियस पर L1 गिरफ्तारी से ४६ घंटे के लिए हो गए कीड़े के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । संरचनाओं को बड़े कीड़े का अध्ययन करने के लिए या आकार में छोटे होते हैं जो L4 लार्वा की जांच करने के लिए कम किया जा सकता है । हालांकि, कीड़े सफलतापूर्वक इस उपकरण में पोस्ट भ्रूण के विकास के चैंबर, precluding अध्ययन में गलते करने में सक्षम नहीं हैं । ऐसे आवेदनों के लिए WorMotel26 जैसी विधियों पर विचार किया जा सकता है । के बाद से कीड़े सीमित हैं, लेकिन WormSpa में नहीं मैटीरियल, एक सफल टिकाऊ प्रयोग पर निर्भर करता है कि पशुओं के चैंबर में रहते हैं । हम पाते है कि यह प्रारंभिक चरण लार्वा के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, पुरुष वयस्कों के लिए, और कुछ द्विलिंग म्यूटेंट के लिए ।

इसके बजाय एक एकल बफर प्रवेश का उपयोग कर के (शीर्ष के केंद्र में, चित्रा 1), दो गुब्बारा नीचे उल्टा के आकार की सुविधा एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । अलग बफर के साथ दो सीरिंज भरने, एक अलग समय पर विभिन्न सिरिंजों पर दबाकर अस्थायी संरचित वातावरण उत्पन्न कर सकते हैं. यह, उदाहरण के लिए, बदलते परिवेश के लिए अनुकूलन के अध्ययन की अनुमति देता है । 27 , 28

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, microfluidic डिवाइस यहां वर्णित अंय अनुप्रयोगों की एक व्यापक रेंज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन अंय पर्यावरणीय cues के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन शामिल है । इस तरह के प्रतिक्रियाओं जीन अभिव्यक्ति और अंडा बिछाने व्यवहार में परिवर्तन शामिल हो सकते हैं, के रूप में यहां उदाहरण, लेकिन यह भी चयापचय और वसा संचय में परिवर्तन (जैसे नील लाल द्वारा वसा धुंधलाना के माध्यम सेउदा ), न्यूरॉनिक फिजियोलॉजी और संकेत (उदा. कैल्शियम इमेजिंग और optogenetic perturbations), इस तरह के पंप, शौच और सिर आंदोलन के रूप में मोटर व्यवहार में परिवर्तन (समय की स्वचालित मात्रात्मक इमेजिंग के द्वारा-चूक दृश्यों), और अधिक ।

अंत में, यह दृष्टिकोण काफी हद तक स्वचालित है और कई घंटे से अधिक लंबे प्रयोगों के लिए आवश्यक श्रम कम कर देता है, यहां तक कि दिन । एक बार व्यक्तिगत कीड़े के स्थानों डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में बच रहे हैं, प्रयोग छवियों की स्वचालित रिकॉर्डिंग के होते हैं, जबकि यांत्रिक पंप नियंत्रक डिवाइस में बफर के निरंतर प्रवाह जारी रखता है । महत्वपूर्ण बात, एक WormSpa डिवाइस के निर्माण किसी भी मानक नरम लिथोग्राफी प्रोटोकॉल से अधिक की आवश्यकता नहीं है, और इसके डिजाइन और आपरेशन काफी सरल भी microfluidics में कोई पिछले अनुभव के साथ शोधकर्ताओं के लिए कर रहे हैं । इसके बाद के संस्करण और अपेक्षाकृत सरल तैयारी कदम पर चर्चा की विभिंन लाभों के साथ, इस दृष्टिकोण जो ठीक नियंत्रित शर्तों के तहत जीना कीड़े के अनुदैर्ध्य माप पर विचार कर रहे है के लिए उपयोगी हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा अनुदान PHY-१२०५४९४ और म्क्ब-१४१३१३४ (एल) के माध्यम से और नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया ग्रांट 2017R1D1A1B03035671 (KSL) द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
WormSpa N/A N/A The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound Microscope Zeiss AxioObserver Z1 An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe Pump New Era Pump Systems NE-501
Tubing SCI Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/5 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe Tip CMLsupply 901-20-050 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe Filter PALL 4650 Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
Syringe Qosina C3307 10 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way Valve ColeParmer FF-30600-23 Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel Pin McMaster-Carr 90145A317 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge Tube Corning CL S3206 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube

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References

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अभियांत्रिकी अंक १३५ C. एलिगेंस microfluidics अनुदैर्ध्य माप पर्यावरण नियंत्रण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अंडा बिछाने
<em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> में अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक Microfluidic प्लेटफार्म
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Lee, K. S., Levine, E. A… More

Lee, K. S., Levine, E. A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (135), e57348, doi:10.3791/57348 (2018).

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