Summary
肿瘤寻求治疗间充质干细胞 (MSCs) 显示有望作为一种治疗侵袭性胶质瘤。最佳移植包括将 MSCs 送到支架上的肿瘤切除腔内。在这里, 研究理学硕士治疗的临床前技术, 包括: 图像引导肿瘤切除;植入 MSC 种子支架;和术后治疗跟踪。
Abstract
胶质瘤 (肾小球) 是最常见和最具攻击性的原发性脑癌, 其预期寿命为12-15 月。短期寿命的部分原因是目前的治疗能力不足, 包括手术切除术后放疗和化疗, 以消除侵袭性肿瘤病灶。杀伤人骨髓间充质干细胞 (MSCs) 可以改善这些病灶的治疗。MSCs 表现出强有力的肿瘤取向, 可以被设计用来表达杀死肿瘤细胞的治疗蛋白。临床前模型的进展表明, 手术切除可诱发早期 MSC 丢失, 降低疗效。在生物降解聚乳酸 (PLA) 支架上播种 MSCs 可以改善 msc 的治疗效果。在解放军脚手架上的手术切除腔的交付恢复细胞的保留, 持久性和肿瘤的杀戮。为了研究 PLA 种子植入对肾小球的影响, 需要一个准确的临床前模型。在这里, 我们提供了一个临床前手术协议的图像引导肿瘤切除免疫缺陷小鼠的肾小球, 其次是 MSC 种子支架植入。MSCs 的设计与慢病毒载体构造组成性表达和分泌治疗 TNFα相关的凋亡诱导配体 (踪迹) 以及绿色荧光蛋白 (GFP), 以允许荧光跟踪。同样, U87 肿瘤细胞的设计, 以表达 mCherry 和萤火虫荧光素酶, 提供双荧光/发光跟踪。虽然目前用于调查干细胞介导的治疗方法, 这项议定书可以修改, 以调查的影响, 手术切除的其他肾小球的干预。
Introduction
胶质瘤 (肾小球) 是成人最常见的原发性脑癌, 平均存活12-15 月1,2,3,4,5。自2005年以来, 当目前最大手术切除的临床标准, 其次为放疗和伴随和佐剂 temozolomide 化疗采用6,7, 生存没有显著改善。虽然这种治疗为患者提供暂时的症状缓解, 治疗标准总是导致复发, 因为侵袭性癌症病灶逃避切除, 并保护不受系统治疗的血脑屏障 (BBB)。针对侵袭性肿瘤灶而规避脑屏障的策略, 迫切需要对这种好斗和衰弱的疾病进行牵引。
人骨髓间充质干细胞 (MSCs) 由于其原发的肿瘤取向8、9, 显示出有望成为肾小球的药物传递载体。MSCs 拥有受体并迁移到肿瘤分泌的可溶性因子, 包括基质细胞衍生因子 1α (SDF-1α)、基质 metalloproteinase-1 (MMP-1) 和单核细胞趋化蛋白 protein-1 (MCP-1) 等10,11,12,13. 工程间充质干细胞用于表达和分泌细胞毒药物, 使其能够被用作肿瘤自导的药物运载工具。设计的 MSCs 向侵袭性肿瘤灶移动并提供治疗蛋白。这种方法已经证明了在各种临床前肾小球模型9,14的可行性。然而, 绝大多数这些模型不包括手术切除, 尽管临床相关性的这一组成部分。使用新的切除模型进行的研究显示, 手术切除肿瘤可以减少直接注射到手术腔15的干细胞的持续性。生存能力的丧失导致疗效降低, 可能是由于药物的剂量和持续时间减少到侵袭性肿瘤灶。
为了增加干细胞的生存能力和药物的传递, MSCs 在植入前可以播种到支架上。在本协议中, 生物相容性和可吸收静电纺丝纤维结构聚乳酸 (PLA) 被用作 MSCs 的支架. PLA 在植入物上弯曲并符合切除腔的形状, 最大限度地提高治疗覆盖率, 最大限度地减少距离 MSCs 必须去到达肿瘤细胞。骨髓间充质干细胞在植入过程中保持在支架上, 然后在植入16、17后移离支架向肿瘤细胞转移。MSCs 和他们携带的细胞毒药物在肿瘤灶处积聚。肿瘤细胞毒性药物的传递需要 MSC 的生存能力和持久性, 这两个都是在支架上植入的辅助。
在这一过程中, 慢病毒载体载体被用来诱导稳定的荧光 (体外跟踪) 和生物荧光 (在体内跟踪) 标记的肿瘤和干细胞系。人肾小球系 U87 感染了 mCherry 和萤火虫荧光素酶 (U87 mCh), 和非治疗性 MSCs 与 gfp 和 renilla 荧光素酶 (gfp-Rluc)。干细胞表达 TNFα相关凋亡诱导配体 (msc) 的治疗变异。踪迹是一种组成性分泌的蛋白质, 它与癌细胞附近的死亡受体结合, 并启动 caspase 介导的凋亡18。
在这里, 我们提供了一个协议, 为临床前图像引导肾小球手术切除和植入 MSC 种子支架。简而言之, 裸鼠在三天后通过立体定向原位注射 U87 妇幼保健, 建立原发性肿瘤。嫁接肿瘤的生长周期约为一周。在切除手术前, PLA 支架植入48小时的 MSCs。然后在荧光引导下切除肿瘤, 将 MSC 加载的支架植入切除腔内。肿瘤的负担和老鼠的生存, 然后跟踪手术后, 生物发光成像 (BLI)。下面提供了这些过程的时间线 (图 1)。
图 1: 过程的时间线.老鼠最初收到一个头骨窗口 (0 天)。在三天的恢复期后, 肿瘤被植入 (3 天) 并生长大约一周。支架在肿瘤切除和植入术前两天 (8 天) 播种骨髓间充质干细胞 (10 天)。肿瘤进展和治疗效果通过术后影像学评估 (10 天 +)。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这里描述的所有方法都得到了北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
注: 本程序是对小鼠进行开放式开颅手术, 作为修改版本的协议由 Mostany 和 Portera-Cailliau19 , 其中的骨组织, 手术切除被丢弃, 使大脑可供建立和肾小球肿瘤的最终切除术。开颅术后, 肿瘤是通过立体定向植入, 如小泽和詹姆斯20所述。我们植入 1 x 105 U87 妇幼保健-Fl 细胞在以下立体定向坐标 (毫米从 bregma): (2.5, 0,-0.5)。
1. 细胞培养和支架制备
注: 在小鼠植入前应准备48小时的支架。下面的卷是以每脚手架为基础提供的。根据需要增加额外的脚手架数量。
- 将 PLA 支架切割成切除腔大小 (约2毫米 x 2 毫米) 件。脚手架可以用剪刀手工切割, 或者用穿孔来进行重复。
- 通过浸泡在70% 乙醇15分钟, 然后浸泡在 PBS 消毒。在 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 中放置支架, 其中含有10% 胎牛血清 (血清) 和1% 青霉素-链霉素, 同时准备用于播种的细胞。
- 用0.05% 胰蛋白酶 (3-5 毫升的 T75 瓶) 提升培养的 MSCs。孵育在37°c 5 分钟, 确保细胞已经解除, 然后添加7-10 毫升 DMEM 到瓶中, 以灭活胰蛋白酶。
- 把烧瓶的内容转移到一个15毫升的离心管上。使用 hemocytometer 计数单元格。颗粒 5 x 105 MSCs 为每个脚手架通过离心在 100 x g 为5分钟。
- 吸出上清和并用重悬 MSCs 在5µL DMEM 每 5 x 105细胞。
- 用拍干的方法准备支架播种。
- 取下一个脚手架, 从 DMEM 浸泡与镊子, 并临时把它放在盖子上的6井板。从盖子上抬起脚手架, 留下一滴多余的 DMEM。
- 把脚手架再次放回盖子上, 在一个新的, 干燥的位置。重复3-5 次, 然后将部分干脚手架放在一个新的6井板中播种。对每个脚手架重复。
注: 部分干脚手架提供最佳的细胞播种结果。如果脚手架太湿, 细胞会从脚手架上滑下, 并坚持下面的井板。如果脚手架太干燥, 液滴不会扩散到整个脚手架上, 导致初始细胞分布不佳。
- 使用吸管, 轻轻地混合的干细胞的小瓶, 以融汇暂停, 因为一些细胞可能已落户底部。
- 慢慢地吸管2.5 µL 新鲜混合 MSC 悬浮直接地在脚手架上, 在脚手架的顶部创造一个小水滴。
- 添加300µL DMEM 到每个井的边缘。这将防止细胞液滴迅速蒸发。孵育37°c 30 分钟, 使细胞附着在支架上。
- 用镊子, 轻轻翻转在井板上的脚手架。种子2.5 µL 新鲜混合 MSC 悬浮 (这导致总共 5 x 105细胞种子每脚手架)。孵育37°c 30 分钟, 使细胞附着在支架上。
- 在 DMEM 上盖上支架, 在6井板的每个井上加2毫升。轻轻举起支架, 让介质在它们下面流动。在植入手术前48小时在这个状态下孵育37摄氏度。
- 检查支架后24小时, 并添加/改变介质, 如果过量蒸发或变色介质由于 pH 不平衡被观察。
2. 荧光引导下切除和支架植入术
注: 在初始化手术前先消毒所有工具。管理您的机构 IACUC 协议中概述的预防性镇痛。
- 将立体定向的框架放置在荧光解剖显微镜的舞台上。
- 麻醉在诱导腔内吸入异氟醚的小鼠。一旦麻醉后, 通过异氟醚鼻锥适配器连续吸入麻醉供应, 将鼠标固定在立体定向的框架内。用加热垫和/或探头保持体温。
注: 4-5% 异氟醚适用于诱导, 2-3% 适用于维护, 但必须对每只鼠标进行调整和监测。 - 将眼膏涂抹于眼部, 防止角膜干燥。用一系列三酒精和三 betadine 湿巾消毒头皮切口部位。
- 对每一个肢体进行脚趾捏反射试验, 确认阴性反应, 以确保正确的麻醉。确保呼吸速率保持在大约55-65 呼吸/分钟左右。
- 使用镊子, 捏和轻轻地抬起头皮。用手术剪刀做中线线延髓-尾鳍切口。用 PBS 冲洗切口部位, 用棉尖涂抹器去除真皮下脂肪。安排皮肤, 使以前建立的颅骨窗口完全可见。
- 用18克针轻轻地将硬脑膜穿透到颅骨窗户的边框内。重复, 直到切口完全跟踪窗口的内部。
- 用细钳剥去硬脑膜, 露出底层的软组织和肿瘤。
- 通过关闭房间灯和转动显微镜荧光模式对 U87 妇幼肿瘤进行定位。通过将1-200 µL 吸管尖端装入真空泵的油管末端准备切除。
- 打开真空泵。轻吸荧光组织切除肿瘤, 直到没有信号残留。关闭真空泵并丢弃吸管尖端。把荧光关掉, 房间灯亮着。
注: 控制出血, 用冷 PBS 冲洗, 用棉尖涂抹固定压力。在更严重的情况下, 切除腔也可以临时包装与止血剂, 只要它被删除后, 出血停止后, 另一个 PBS 灌溉。 - 在植入之前, 在 PBS 中慢慢地蘸一个 MSC 播种的 PLA 脚手架, 以去除不需要的介质和相关组件。将支架植入切除腔内。如果需要, 添加1µL 纤维蛋白原 (67-106 毫克/毫升), 其次是1µL 凝血酶 (400-625 U/毫升), 以确保支架到位。
- 随着硬脑膜的去除和颅骨瓣从头骨窗口已经丢弃, 只需关闭皮肤和使用手术胶水密封伤口。将动物从吸入麻醉剂中取出, 并允许在受热的表面恢复。
- 一旦走动, 将鼠标返回笼子。对 IACUC 批准的附表施行镇痛。对每个鼠标重复过程。
3. 术后影像学
- 使用28克胰岛素注射器, 注射 d-荧光素 (150 毫克/千克腹腔) 小鼠。
- 等待10分钟。这将使荧光素在整个身体中循环, 并与荧光素酶-表达大脑中癌细胞的反应, 以获得峰值表达。
- 在异氟醚麻醉下 (如前所述), 图像小鼠在生物发光成像 (BLI) 系统中可视化肿瘤。根据肿瘤大小的不同需要 (几秒到几分钟) 改变曝光时间。
- 根据需要重复成像过程来确定肿瘤的生长动力学。继续监测动物健康状况。
注: 治疗骨髓间充质干细胞将组成性表达, 杀死癌细胞, 抑制肿瘤的整体生长。成像每2-5 天提供足够的频率为此目的。 - 当 IACUC 协议中概述的预定端点被满足时, 通过 transcardial 灌注和收集组织来牺牲小鼠进行分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U87 肿瘤细胞被设计来表达 mCherry 和萤火虫荧光素酶 (U87 mCh) 在注射之前, 并允许图像引导切除和生物发光跟踪 (图 2A-C)。干细胞同样是用诊断 gfp-Rluc (gfp) 或治疗 gfp 试验 (msc), 并播种到 PLA 支架上以确认附着和增殖 (图 2D-F)。
图 2: 在 PLA 上播种的荧光癌细胞和 MSCs 的代表性图像.-c)相位、荧光和组合图像分别显示了用慢病毒载体构造设计的 U87 癌细胞来表达妇幼保健标志物。D F)相应的图像的干细胞设计, 以表达 gfp-Rl 或治疗 gfp-路径播种到 PLA 脚手架材料。刻度条 = 200 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
术中的图像, 以突出部分的手术程序, 肿瘤切除和支架植入 (图 3)。动物首先被麻醉并且被排列在立体定向仪器 (图 3A)。皮肤被打开, 硬脑膜被剥回。肿瘤切除 (图 3B), 并在白光下检查似乎完全删除。然而, 肿瘤的荧光图像 (图 3C) 和后 (图 3D) 切除表明, 虽然大部分肿瘤被删除, 剩余的数量仍然存在。这种现象类似于临床病例, 其中外科医生无法去除迅速从初级肿块转移到大脑中无法操作的区域的肿瘤细胞。迁移性骨髓间充质干细胞向残留的肿瘤病灶转移, 手术切除后仍保留。为了将 mscs 送入切除腔, 首先将 mscs 播种到 PLA, 然后将支架结构放置在切除腔内。荧光成像 GFP 信号 (图 3E) 证实了支架上的 MSCs 是否存在。体外全脑图像显示支架尺寸相对于切除腔 (图 3F-H)。支架在平躺时明显较大, 但在植入过程中可塑成切除腔的形状。通过对整个腔体的涂敷, 可以将距离治疗的 MSCs 转移到肿瘤病灶的范围最小。手术后, BLI 被用来跟踪肿瘤的生长时间, 并确定支架提供的 MSC 疗效。
图 3: 代表性的术中和术后图像.A) 术中系列在切口前显示鼠标。B) 用颅骨窗切开小鼠, 揭示肿瘤肿块。C) 明亮的田野和荧光叠加图像显示肿瘤的位置。D) 手术后切除腔, 残余肿瘤灶。E) 植入的 PLA 支架播种的 MSC。F) 尸检后的脑组织用脚手架覆盖。G) 荧光叠加突出荧光蛋白-小径细胞。H)放大版的 g 刻度条 = 5 毫米.请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
手术通常可以在每只老鼠30分钟内完成, 考虑到以下几点, 以最大限度地提高精确度和避免耗时的陷阱。首先, 确保鼠标在开始程序之前正确定位在立体定向仪器中。不需要的头部运动将限制开颅手术的准确性, 肿瘤植入的位置和肿瘤切除的程度。切除前, 充分去除覆盖肿瘤的硬脑膜部分。坚韧, 纤维硬脑膜硬化, 因为它脱水在渴望。如果不完全删除, 硬化硬脑膜可能限制吸头移动和防止完整的肿瘤切除。在切除过程中, 血管经常被无意中切除, 并伴随肿瘤, 导致大出血。过量的血液会减弱荧光信号的强度, 使肿瘤模糊不清。在切除过程中保持肿瘤的可见性确保切除的适当程度, 并限制健康组织和过量出血的清除。对于较小的出血, 用冷盐水灌溉受损的血管, 用棉尖涂抹器施加温和的压力。如果出血继续, 将止血剂装入腔内2-3 分钟, 然后用镊子取出。在植入细胞种子支架之前, 用 PBS 灌溉以恢复生理 pH 值。当切除完成, 出血停止, 最后的陷阱是不充分的皮肤伤口闭合。这往往是由于过量的水分 (PBS 或血液), 防止手术胶水粘合的切割皮肤。在应用胶水之前, 用棉尖涂抹剂轻轻地烘干皮肤, 避免这种情况。如果伤口间隙不是先在闭合的位置用镊子夹在胶水前, 也可以不小心将皮肤直接粘在头骨上。
有了这些考虑, 上述协议产生一致和可靠的肾小球外科切除, 模仿的标准, 准确的活体检测新的细胞和小分子疗法。不过, 可以修改几个组件以满足特定的实验需要。例如, 肿瘤的性质, 如大小, 位置和侵入程度可以通过改变初始数目和深度的注射细胞, 时间之间的肿瘤建立和切除, 或通过切换肿瘤细胞线本身。此外, 这项研究是在裸裸鼠的免疫系统耐受人类细胞的基础上进行的。免疫能力强的老鼠可能更适合研究使用小鼠细胞。
与闭合系统 (即, 骨或盖玻片重新放置) 相比, 在本协议中进行的开放性开颅手术可降低颅内压 (ICP)。由于增加的 ICP 负责症状的发作, 包括癫痫发作, 小鼠将经历人工延长生存在这个模式。由于延迟应用于控制和治疗组, 其影响最小化, 未来的模型可以重新关闭骨瓣恢复 ICP, 并确定其在细胞治疗中的作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Drs、Bagó和 Hingtgen 在猎鹰疗法方面拥有公平性, 他们从 UNC 教堂山获得了干细胞和脚手架技术方面的许可。
Acknowledgments
作者承认凯瑟琳· Pietrosimone 博士的社论贡献。PLA 脚手架是由 Loboa 博士在北卡罗来纳州立大学的实验室制造的。这项工作得到了 unc Lineberger 综合癌症中心的大学癌症研究基金和 unc 翻译和临床科学研究所 (KL2TR001109, UL1TR001111) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Just for mouse stereotaxic instrument | Stoelting | 51730 | Maintains steady head positioning during surgery |
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Leica | M165 FC | Allows real-time imaging of tumor during resection |
| Motorized integrated stereotaxic injector (ISI) system | Stoelting | 53315 | Allows precise tumor cell injection volume and rate |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469 | Sugical glue to close skin wound |
| Artificial tears | Akorn | 664268 | Prevents eyes from drying during surgery |
| Webcol alcohol preps | Covidien | 6818 | Sterilize incision site |
| Betadine surgical scrub | Purdue Fredick Company | 6761815117 | Sterilize incision site |
| Cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | Surgery tool |
| E-vac aspirating system | Argos | EV310 | Vacuum pump used to resect tumor |
| Fibrinogen and thrombin extracted from as-received TISSEEL | Baxter | To temporarily secure the scaffold in the resection cavity | |
| IVIS Kinetic in vivo optical imaging system | Caliper Life Science | Bioluminescent Imager | |
| D-Luciferin potassium salt | PerkinElmer | 122799 | In vivo imaging agent |
References
- Adamson, C., et al. Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going. Expert opinion on investigational drugs. 18 (8), 1061-1083 (2009).
- Asthagiri, A. R., Pouratian, N., Sherman, J., Ahmed, G., Shaffrey, M. E.
- Affronti, M., et al. Overall survival of newly diagnosed glioblastoma patients receiving carmustine wafers followed by radiation and concurrent temozolomide plus rotational multiagent chemotherapy. Cancer. 115 (15), 3501-3511 (2009).
- Erpolat, O., Akmansu, M., Goksel, F., Bora, H., Yaman, E., Büyükberber, S. Outcome of newly diagnosed glioblastoma patients treated by radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide: a long-term analysis. Tumori. 95 (2), 191-197 (2009).
- Minniti, G., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma in elderly patients. Journal of Neuro-Oncology. 88 (1), 97-103 (2008).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Delgado-López, P., Corrales-García, E. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18 (11), 1062-1071 (2016).
- Wu, X., et al. In vivo tracking of superparamagnetic iron oxide nanoparticle-labeled mesenchymal stem cell tropism to malignant gliomas using magnetic resonance imaging. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 108 (2), 320-329 (2008).
- Nakamizo, A., et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas. Cancer Research. 65 (8), 3307-3318 (2005).
- Xu, F., Shi, J., Yu, B., Ni, W., Wu, X., Gu, Z. Chemokines mediate mesenchymal stem cell migration toward gliomas in vitro. Oncology Reports. 23 (6), 1561-1567 (2010).
- Park, S., et al. CXCR4-transfected human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells exhibit enhanced migratory capacity toward gliomas. International Journal of Oncology. 38 (1), 97-103 (2011).
- Ho, I., et al. Matrix Metalloproteinase 1 Is Necessary for the Migration of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Toward Human Glioma. STEM CELLS. 27 (6), 1366-1375 (2009).
- Bexell, D., Svensson, A., Bengzon, J. Stem cell-based therapy for malignant glioma. Cancer Treatment Reviews. 39 (4), (2012).
- Nouri, F., Wang, X., Hatefi, A. Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems. Journal of Controlled Release. 200, 179-187 (2015).
- Kauer, T., Figueiredo, J. -L., Hingtgen, S., Shah, K. Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas. Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).
- Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Hingtgen, S. Fibrin matrices enhance the transplant and efficacy of cytotoxic stem cell therapy for post-surgical cancer. Biomaterials. 84, 42-53 (2016).
- Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Mohiti-Asli, M., Loboa, E., Hingtgen, S. Electrospun nanofibrous scaffolds increase the efficacy of stem cell-mediated therapy of surgically resected glioblastoma. Biomaterials. 90, 116-125 (2016).
- Loebinger, M., Eddaoudi, A., Davies, D., Janes, S. Mesenchymal Stem Cell Delivery of TRAIL Can Eliminate Metastatic Cancer. Cancer Research. 69 (10), 4134-4142 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
