Summary
ここで rootworm 胚生殖細胞変換や CRISPR/Cas9-ゲノム編集など機能ゲノム試金の実行の目的のため収集、マイクロインジェクション precellular 西部のトウモロコシのためのプロトコルは提示します。
Abstract
西部のトウモロコシ rootworm (WCR) トウモロコシの重要害虫であり害虫管理戦略に迅速に適応する能力があることが知られています。RNA 干渉 (RNAi) WCR 生物学を勉強するための強力なツールであることを証明している、それはその限界を持っています。具体的には、RNAi 自体は一時的なもの (すなわちわけで関連する表現型の長期的なメンデル遺伝)、それはターゲット遺伝子の DNA 順序を知る必要があり、。後者ために制限があります興味の表現型が悪い、節約またはも新規の遺伝子によって制御される場合便利なターゲットの識別に挑戦するが、不可能ではない場合。WCR のゲノム] ツールボックスのツールの数は、安定した突然変異系統を作成し、WCR ゲノムのシーケンスに依存しない調査を有効にするために使用できる手法の開発が拡大する必要があります。ここで、収集し、核酸 precellular WCR 胚を microinject するために使用方法を詳しく説明します。ここ記載されているプロトコルは、トランスジェニック WCR の創出を目指したが、一方 CRISPR/Cas9-ゲノム編集も実行でした唯一の違いは、胚に注入液の組成と同じプロトコルを使用しています。
Introduction
西部のトウモロコシ rootworm (WCR)、Diabrotica virgifera virgifera、トウモロコシ1の重要な害虫であります。興味深いことに、WCR のコントロールを克服するよう措置最も農業害虫よりも急速に以来、彼らだけでなく適応だけでなく、生理学的行動2,3,4,5, 6. 過去 10 年間、RNA 干渉 (RNAi) 強力な機能ゲノム ツール WCR7、8、潜在的な制御法として研究されている、遺伝子機能9を研究手段としても使用されています。しかし、RNAi は頻繁に他の種における二本鎖 rna (dsRNA) によって実行される、インジェクション ベース RNAi は WCR にまれであります。実際、dsRNA の WCR9にマイクロインジェクションによるRNAi の報告は少ないがあります。理由は母11に dsRNA を供給することにより胚性効果の研究を許しさえ WCR が dsRNA7,10の遺伝子ノックダウンを介して摂取の高レベルに得ることができます。このメソッドには、WCR 機能ゲノム解析によるRNAi 優秀な主題が、それはこの種の胚のインジェクションの方法論の開発の進捗状況を鈍化しています。
RNAi のパワーにもかかわらず、いくつかの欠点があります。たとえば、すべての遺伝子は RNAi に均等に対応します。この変動より困難なゲノム機能アッセイの結果を解釈することができます。また、RNAi は一時的なもの、遺伝的突然変異を生成しません。その一方で、生殖細胞変換、機能ゲノムの他のツールはマーク付きの転位因子のゲノム12,13にを介して挿入変異を生成できます。これは生殖細胞変換を長期的な遺伝学的研究で使用するため突然変異系統を作成するための優れたツールになります。変換は、変異ゲノム14遺伝子の機能的なコピーを提供することにより、突然変異を救出するも使用できます。さらに、生殖細胞変換はさまざまな分子遺伝学的手法の礎です。ノックアウトや遺伝子機能を救出、に加えてエンハンサー トラップ15、遺伝子トラップ16、Gal4 ベースの異所性発現17、およびゲノム変異18の生殖細胞への変換を使用できます。
最近では、高度なゲノムの編集を有効にするツールが開発されています。これらのツールでは、転写 Activator-Like エフェクター核酸 (TALEN) CRISPR/Cas9-ヌクレアーゼ システム19,20をご利用など。これらの新しいツールの利点は、彼らは研究者のほぼすべてのゲノム内のほぼすべての場所で二本鎖 DNA 切断を誘導する能力を提供することです。どちらか非相同末端結合、削除、または目標とされた遺伝子の挿入を導入することができます、通したり、相同性監督の修理エンジニア リング構造が存在することができますを触媒する誘導、一度これらの壊れ目を修理すること、全体の遺伝子や遺伝領域21,22の交換。ただし、これらのメソッドには、DNA、RNA および蛋白質の非常に若い胚へのマイクロインジェクションが必要があります。
重要なは、RNAi、生殖のために使用される蛋白質や核酸用二本とは異なり、変換およびゲノムの編集が、細胞膜を容易に越えることはできません。したがって、プラスミド Dna や Mrna、タンパク質のマイクロインジェクションは胞胚期 (すなわち昆虫胚 cellularizes 前に) 行われなければなりません。これは注射のタイミングを重要な要因になります。たとえば、キイロショウジョウバエ胚は卵を産む12後 2 時間以内に注入する必要があります。したがって、WCR の正常胚マイクロインジェクションのプロトコルの開発は、precellular 胚の十分な量を収集するための最良の方法だけでなく、女性の卵が産卵に最適な条件に考慮に入れなければなりません。
WCR 生物学を分子遺伝学的ツールの広い範囲をもたらすべく収集と precellular WCR 胚マイクロインジェクション法の開発が必要です。ここで我々 は WCR 研究に変換ベースの技術を使用して他人を助けるためのヒントとトリックの詳細な手順を提供します。これらのテクニックには WCR 機能ゲノム研究用トランスジェニック技術を拡張すると、に加えて、遺伝子ドライブ23,24経済的に重要なこれでテストするなど強力な新しい害虫対策も有効にします。害虫。
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Protocol
1. コロニー レベル WCR 大人の飼育
- WCR 大人の十分な量を取得 (500-1,000) 信頼性の高い会社や研究所から (例のための参照材料表) し、30 cm3ケージに配置。
注: 非休眠株の使用は強くお勧めします。 - WCR 人工飼料メーカーのプロトコル、次を準備し、38 オンスの容器に 1 cm 厚層を注ぐ (材料の表を参照してください)。混合した後、2 ヶ月未使用ダイエット 4 ° C で保存します。
- 大人の食事 (10-15 g) とペトリ皿 (100 × 15 mm) を 30 cm3ケージに入れます。低または乾燥食品より多くの食事を追加します。
- 水の源として水、コットン ロール (6"x 3/8")、提供する場所に保持するために使用する綿球で覆われているとフラスコ (300 mL) を置きます。低実行するときは、水を変更します。
- 26 ° C 湿度 60% で WCR を維持し、14:10 光インキュベーターを飼育昆虫のサイクルします。
2. 胚のコレクションおよび配置
- シャーレの滅菌 100 × 15 mm2水 1% 寒天を用いた卵コレクション区域を作る。寒天が固化した後、4 ° C で保存します。
- 最近置かれた卵を収集するには、(図 1 a) 寒天培地の表面に寒冷紗 (サイズへのカットそれぞれ) の 4 層に続いて、フィルター ペーパーの単一の層を配置します。
メモ: 寒冷紗を使用できます、漂白剤で洗浄し、オートクレーブ養生した後、初めて使用するためこれを行う必要はありません。フィルター紙は再利用されないことし、滅菌する必要はありません。 - できるだけ (仕事日の終わり) の日に遅く WCR ケージに卵コレクション プレートを置き、アルミ箔のテントで覆います。一晩おきます。
ケージに夜遅くコレクション区域を配置するラボのスタッフを必要とせずマイクロインジェクションの若い卵のコレクションを進め注: しなくてもライト 10 から 12 時 (14 時間) 遅れ産卵。 - 卵コレクション区域約 8 または 9 を削除します。
- 鉗子を使用すると、時間と水のビーカー (500 mL) の場所で寒冷紗の 1 層を拾います。(図 1 b と 1 C) を優しく攪拌によってチーズの卵を洗います。
- 電球ピペットを使用して卵を水の別のビーカー (500 mL) に転送。卵をきれいにする 2 〜 3 倍を繰り返します。
- 水繰越額を最小限に抑えながら、フィルター紙 (図 1) の上に卵を転送するのに電球ピペットを使用します。
- しっかりと確認するスライドにスライド ガラスとテープと同じ幅の短冊状に黒濾紙をカット紙産むフラット (図 2 a)。
注: 黒濾紙は、反射する光の量を減らすことによって顕微鏡下で可視性を向上させるのに役立ちます。 - 非毒性接着剤の適用 (例えば材料の表を参照) 細い線 (図 2 b) でろ過紙。接着剤でコーティングされた卵を避けるために卵の直径よりも薄く、接着をしてください。
- 軽く接着剤のラインに彼らのフィルター ペーパーから WCR 卵 1 つずつを移動するのに細かいブラシを使用します。接着剤で産卵を乾く前にしようし、それぞれの卵の間に少なくとも 1 つの卵の距離を保ちます。
- 1 ろ紙スライド (図 3) に複数行の卵を置くことによって注入効率を最大化します。
- すべての卵をフィルター紙の上にレイアウト後のインジェクションの前にすべての接着剤が乾くまで待ちます。
注: 生殖変換と編集 CRISPR/Cas9 を介したゲノム、注入すべて胚正午 (12) 19 h 以上古い最古の胚があるよう。しかし、RNAi のため制限はありません時間、WCR で dsRNA セル間を移動することができます。実際には、RNAi のため高齢化胚がよりよい生存率で可能性があります。
3. 保有するプラスミド Dna と注射針の準備
- エンドトキシン フリーの商業を使用して高品質スーパー プラスミッド DNA の準備キット (例については材料の表を参照してください)。
- 注射液の準備するには、各プラスミドの濃度をチェックし、ヘルパー プラスミド (250 ng/μ L 最終濃度)、ドナー プラスミド (750 ng/μ L 最終濃度)、フェノールレッド バッファー (最終濃度 20%)、結合します。渦ソリューションを簡単に、針を詰まらせることができる粒子の沈殿物に最大速度で 3 分間遠心します。
- ホウケイ酸ガラスの針 (外径内径 0.58 mm、10 cm 長さ 1 mm) を引く炎/ブラウン タイプのマイクロ ピペットの引き手を使用して。ストレージ、シャーレなどの明確なコンテナーの両面粘着テープで引っ張ら針を固定します。
注: マイクロ ピペットの引き手システムの使用設定があった: 熱 335、フィルを = = 4、ヴェル = 40、デル = 200、PUL = 100。 - バックフィル マイクロ ローダーを使用して、注射針ヒント (材料の表を参照) をピペット 0.5 - 1.0 μ L をテーパー エンドの近くの針の内部。発生した場合は、針の先端から泡を削除します。
- 持針器に注射針を挿入します。
- 優しく、鉗子の罰金ペアを破壊または優しく触れる/ドラッグ coverslip またはガラス スライドの先端の針の先端を開きます。
注: まだ出てくる注射ミックスを可能にする最小の開口部を持っていること (小さな開口部は一般的に高い注入圧力を必要と)。ベベル針は、彼らは既に開いているのでこの手順を必要としません。
4. マイクロインジェクションと投与後のケア
- 細かいペイント ブラシを使用して、慎重に滅菌水で 1-3 個の卵の表面を湿らせる針を挿入、薬液を注入します。表面が乾く前に、それぞれの卵を注入します。成功のインジェクションを示す注入中に卵中の赤い色の少量を外観を探します。クラッシュまたは破損、空を見て、またはそれ以外の場合、注入することはできませんのすべての卵を削除します。
注: 射出圧力によって異なりますが針穴のサイズに基づいて、10-13 psi は良い出発点です。 - すべての卵が注入された後は、スライド ガラスからフィルター用紙を取り除きます。
- (上記) 1% 寒天料理の表面にフィルター紙を置きます。
- 料理を密封し、12 日間インキュベーターを飼育 26 ° C 昆虫を置くプラスチック パラフィン フィルムを使用します。
注: パラフィン フィルムの料理の間に金型のクロス汚染を防ぐ助け。しかし、カビや細菌の増殖を防ぐために他の治療法は、注入された胚の生存率を減らすことができます。
5. 培養と胚の孵化
- 孵化胚 12 日後注入をチェックを開始し、次の 2 週間毎日続けてください。
- 発芽トウモロコシと土飼育箱に細かいブラシを使用して、幼虫を転送します。
注: 金型は、寒天料理で成長可能性がありますが、ほとんどの場合幼虫が孵化まだ。それらすべてをキャッチする金型内で慎重に幼虫を探します。いくつか幼虫は皿の蓋に移動可能性があり、結露にはまり込む可能性があります。 - 26 ° C 以下の飼育方法25標準 WCR で幼虫を育てます。
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Representative Results
このプロトコルを開発するときの重要な考慮事項は、マイクロインジェクションの時に萌芽期の開発の段階をだった。具体的には、生殖細胞系列変換は萌芽期の cellularization の前に dna マイクロインジェクションを必要です。これは、Dna が細胞膜を容易に通過できないためにです。WCR 胚の dechorionation は本質的にすべての胚の完全性に責任がある保護膜を溶解するため、WCR 核染色を使用して萌芽期の開発の段階を視覚化する試みは成功しなかった。ただし、このラインの問い合わせは、タイムリーに胚の十分な量を取得 – 別の難しさに取って代わられました。フィールドに、WCR 女性は土に卵を産む、従ってそれ驚きべきである、演習では、女性のみ卵を産む暗闇の中。これは短い昼間コレクション (2-4 h) を困難になります。この問題を克服するために単一の一晩卵レイは行ったし、胚の大量をもたらすことがわかった。(図 1) を収集し、インジェクションのため (図 2) 胚のレイアウトのプロセスは迅速に行う場合、多少面倒ですがこのプロトコルにより注射の時点で古い 2-19 h との間にある胚のマイクロインジェクション24 h 後の日に注射が実行される場合よりも古い。WCR と他の種との間の開発時間の比較では、WCR 胚が 24 h 投稿卵を産む (説明参照) で precellular するまだ必要がありますを示唆しています。
WCR の生殖変換で最初の試みには、precellular の胚にヘルパー (トランスポザーゼ ソース) とドナー (トランスポゾン) プラスミドの共同注入 (図 3) が関与しています。ドナーのプラスミッドのため変換マーカーは、コクヌストモドキ(α-チューブリンプロモーター26) から恒常活性プロモーターによる緑色蛍光タンパク質 (EGFP) 遺伝子だった。胚の生存率が低い (表 1)、26 G0大人が回収されました。ドナー要素に挿入を生殖細胞、G1胚を決定するには、EGFP 発現の上映。蛍光の子孫は確かに識別されたが (図 4)、スクリーニング強烈な光源を持つ WCR 胚致死27ことが分かった。生殖変換の次のラウンド活用 1 つショウジョウバエ(熱衝撃蛋白質 70プロモーター28 から恒常活性プロモーターによって駆動される赤色けい光たんぱく質 (下流) 遺伝子を有する新しいドナー プラスミッド).生存率が大幅に改善された (表 1)、生き残った大人は単一した DsRed 正幼虫 (図 5) のみを生産しました。しかし、これらの実験は 2 つの点の中で特に有益ではありませんでした。最初に、それが発見されたそのマイクロインジェクション発展等、拡張時間-する-ハッチに遅延が生じる。すべての胚が孵化 2 週間以内ではなく注入された胚孵化 12 と 26 日ポスト マイクロインジェクション、従ってすべての孵化を採取できるように拡張監視期間を要求する間。第二に、孵化幼虫がかなりアクティブなことがわかりました。彼らはどこに立ち往生、なるだろうし、寒天料理から脱出した時の蓋にクロールされました。これらの問題は、ペトリ皿パラフィン フィルムをシールして、蓋と孵化の慎重に寒天を調べることによって克服されました。
この注入プロトコルの最終バージョンは、マイクロインジェクション WCR 胚単独で、バッファー、またはヘルパーと目プロモーター (3xP329) ドナー DNA プラスミドをマークによってテストされました。追加のコントロールとして胚の別のセットを同じように処理された microinjected がないが。胚の 4 つのセットは、注射溶液のいずれかを注射しました。合計 485 胚をバッファーと孵化、148 の投与 (孵化率 30.5%、テーブル 1を =)。289 プラスミド Dna を注入 1,450 胚の孵化 (率 26.8% を =)。興味深いことに、同じ卵処理条件を受けた 470 胚なくマイクロインジェクション、唯一 250 孵化 (率 53.2% を =)。Uninjected 胚の生存率が 20% 以上の注入された胚の生存率はマイクロインジェクションやむを得ない被害により予想されます。ただし、少しの違いはバッファー挿入および追加される DNA の量は WCR の受け入れを示唆している DNA の挿入間に見られる (ディスカッションを参照してください)。これらの結果はまた生存率が以前の努力で改善を示す.このメソッドを使用して形質転換線の成功確立がされている27は別途報告します。
図 1: 卵のコレクション。A)卵コレクション区域。B) 24 h 卵後卵室のセクションの拡大表示を置きます。矢印は、いくつかの卵の場所を示すことに注意してください。C)チーズを卵を洗浄します。D) WCR 卵の最後の転送。ノートでは、ブラケットは、密集の WCR 胚 (すなわち最低限水) と領域を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 注入スライドを準備します。A)黒濾紙は標準的な顕微鏡のスライドにしっかりとテープで。B)注射部拡大表示スライド準備プロセス中に。注、↓ 1 は、卵の行、#2 接着剤の行の一部と接着剤を広げるための pin #3 の場所を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 胚の注入します。8 行と卵の注入スライド。注射針の角度による胚の一連の行は単にステージを移動することによって注入することができます。注注射針で赤い染料は大きく注入の可視化を支援します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: トランスジェニック G1胚。 PiggyBac共同注射だった WCR 大人から胚の初期胚としてヘルパーとドナー プラスミドを用いた。明るい緑の胚は強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 式の肯定的な他の。EGFP の発現は、コクヌストモドキ群 α-チューブリンプロモーター26によって駆動されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: トランスジェニック G1幼虫。親は co piggyBacを注入した 3 齢幼虫-初期胚としてヘルパーとドナー プラスミドを用いた。左側の赤い光る幼虫は、右側の幼虫ではないした DsRed 発現陽性です。した DsRed 発現はショウジョウバエ キイロショウジョウバエ熱ショック 70プロモーター28によって駆動されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 実験 | 治療 | 卵 | 孵化 | 孵化率 |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP ドナー | 910 | 57 | 6.3% |
| Exp. #2 | hsp70DsRed ドナー | 1580 | 211 | 13.4% |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP ドナー | 1450 | 389 | 26.8% |
| バッファー | 485 | 148 | 30.5% | |
| いいえ注入 | 470 | 250 | 53.2% |
表 1: インジェクション データ。WCR 胚、卵注入の合計数、正常に孵化、幼虫の総数と孵化率を示す 3 つのマイクロインジェクション実験から料金を孵化します。
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Discussion
これはマイクロインジェクション precellular WCR 胚生殖細胞への変換を行うための重要なプロセスのためのベストプラクティスを確立する最初のプロトコルで RNAi を目的として二本の WCR のマイクロインジェクション報告9がずっと、および/またはこの種の編集 CRISPR/Cas9 ゲノム。WCR 胚の正常なマイクロインジェクションは、変換効率は、多くの要因に依存しています。後述はいくつかの主要な問題に影響を与えるこのカブトムシの生殖細胞の変形のためのプロトコルを使用しての結果。
Precellular 胚を取得
前述のように、DNA は方法 dsRNA が細胞膜を交差させない。つまりは重要な重要性の DNA、mRNA やタンパク質が前に cellularization を注入します。射出のタイミングが重要なので nondiapausing WCR ひずみ30胚形成を完了するのにかかる時間に基づく成功のインジェクションの可能性がありますウィンドウを決定することが重要だった。これはだった別のカブトムシ、コクヌストモドキシンシチウム胚盤葉期のタイミングの詳細な研究に基づいて計算されます。コクヌストモドキcellularization には、30 ° C31〜 8 h 投稿卵レイが発生します。30 ° C で完全な胚コクヌストモドキの ~3.5 日をかかりますので、cellularization は起こるプロセスに方法の 10 分の 1 です。WCR 胚は、開発に約 2 週間を取る、ので、2 番目の日のポスト卵置くまで cellularization が発生しません。したがって、成功マイクロインジェクションの] ウィンドウは、少なくとも 24 時間の長い、WCR マイクロインジェクションの卵の十分な量を提供するために一晩産卵を必要とするので有用であることとしました。このメソッドは、成功した遺伝子27の使用された、それは処理の非常に早い胚に害をもたらすしない場合、結果は若い胚を注入することにより改善される可能性が考えられる。
DNA の品質と濃度
DNA 濃度が成功した変換で極めて重要な役割を果たしていること驚くべきことではありません。最終濃度 1 mg/mL 以下プラスミド DNA を維持した注入胚32への潜在的な毒性を避ける必要があるそれが長く考えられてしまった。とはいえ、今、過去の毒性問題の原因は DNA 自体またはプラスミド精製プロセスから引き継がれる汚染物質の結果だった代わりに、親指のこのルールは断固としてに付着されて二十年かは明らかです。しかし、最近わかったこと 1 mg/mL を超える制限可能なだけでなく、高い変換率を達成できるので卵毒性の不在はプラスミド精製キットの進歩のためかもしれないとの憶測につながる少ない汚染の結果。リア WCR に必要な時間を考えると、変換率の増加は、わずかに高い死亡率が生じる場合も。
マイクロインジェクションの前に卵の表面を軟化
異なり、コクヌストモドキWCR 胚の最も外側の表面 (絨毛膜) はマイクロインジェクションの前に柔らかく必要があります。水晶針を使用した場合でも、これは重要なステップです。理想的には、水は注入の直前に 1 つの胚に適用する必要がありますが、絨毛の reharden 前に、インジェクションを行うことができる場合は、時に 2 に 3 胚のグループに適用できます。この手順を行わない針は一般に絨毛膜、インジェクションの試みが失敗し、それを引き起こし、有害な針の先端を貫通する失敗します。また、針が正常に乾燥絨毛膜を貫通する場合は、注射液通常漏れる戻って周囲圧より高い胚の内部圧力のため。しかし、それはぬれた (軟化) 胚から乾燥を区別しやすい。具体的には、乾燥後、胚がある明確な硬い円形の形で, 水の添加により、球状の外観は彼らを失う。軟化だけでなくにより、絨毛膜を簡単に貫通する針、注射液が漏れない十分な胚の内部圧力を減らします。
湿気とカビ
注入された胚は、胚全体に暖かい、湿った環境で開催されます。これらの条件は、WCR 開発に最適な環境を提供するだけでなく、またカビの成長を促進します。この 2 週間の期間中に住宅 WCR 胚寒天料理によくカビします。残念ながら、胚は、高湿度を必要とする、ハッチのはるかに低い率で起因したそれを減らすための試み。興味深いことに、金型の存在は問題なく孵化ほとんど胚と一般的にハッチ率にほとんど影響を しました。また、抗真菌治療が WCR 胚に害を及ぼすので、汚染を避けるためにカビの生育を抑える最善の方法が表示されます。クリーニング ツール、コンテナー、およびインジェクション システム使用する前に、型の胞子は多くの実験室の環境で流行しているので最小限にマイクロインジェクション費やされた時間を維持ましょう。
結論
このプロトコルは、WCR 研究トランスジェニック技術を採用する多くの研究者を有効にしてうまくいけば、この昆虫で使用するため追加遺伝子組み換え技術の開発に役立ちます。コクヌストモドキで行われる高度な遺伝子組み換えベースの実験は突然変異誘発33と34を編集 CRISPR ベースのゲノムを含む WCR に適応できる可能性が。これらの技術は、precellular 胚の顕微注入を必要とするためこのプロトコルはトランスポゾンを用いた機能ゲノム研究や CRISPR/Cas9 を介したゲノム編集も遺伝学ベースの害虫管理戦略だけでなく役に立つでしょう35,36。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、モンサント社のトウモロコシ Rootworm 知識研究プログラムからの助成金によって支えられた、NCSU から MDL に番号 AG/1005 (MDL と YC) してスタートアップ資金を与えます。(MDL) に番号 MCB 1244772 を付与する FC は、モンサント社のトウモロコシ Rootworm 知識研究プログラム (AG/1005)、全米科学財団からの助成金によって支えられました。著者は競争の興味を宣言しません。FC と MDL の考案設計実験;FC、PW、SP で行う実験。FC と MDL の分析結果FC、NG、MDL は原稿を書いていた。WCR のスクリーニングでの専門的な支援、テレサ o ' leary、ウィリアム Klobasa とステファニーと感謝します。我々 はまた飼育プロトコルを提供するラボのコロニーを確立する卵の出荷のため博士のウェイドのフランス語 (農務省、北中央農業研究所、ブルッキングズ, サウスダコタ) を感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
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