Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר נוגדן bispecific GPC3-S-Fab ב Escherichia coli. GPC3-S-Fab מטוהרים יש cytotoxicity חזק נגד תאי סרטן הכבד חיובי GPC3.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את הבנייה ואת מחקרים פונקציונלי של נוגדן bispecific (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs יכול לזהות שתי epitopes שונות דרך שלהם שתי זרועות שונות. bsAbs נחקרו באופן פעיל בשל יכולתן לגייס תאים חיסוניים כדי להרוג תאים סרטניים ישירות. כיום, הרוב המכריע של bsAbs מיוצרים בצורה של חומרים, או כמו bsAbs המכילים Fc או נגזרות bsAb קטן יותר ללא אזור Fc. במחקר זה, GPC3-S-Fab, נוגדן bispecific מבוסס נוגדן פרגמנט (חיובי), תוכנן על-ידי קישור של Fab של נוגדן anti-GPC3 GC33 עם נוגדן anti-CD16 מחשבים בודדת. יכול להיות לידי ביטוי Escherichia coli , מטוהרת על-ידי שני זיקה chromatographies GPC3-S-Fab. GPC3-S-Fab מטוהרים ניתן לאגד, במיוחד להרוג תאים סרטניים בכבד חיובי GPC3 על-ידי גיוס תאים רוצח טבעי, רומז על פוטנציאל היישום של GPC3-S-Fab בטיפול בסרטן הכבד.
Introduction
נוגדנים חד-שבטיים המשמשים כיום בהרחבה עבור סרטן טיפול1. בשל הגמישות של נוגדנים, בפורמטים שונים נוגדן מבוססי נחקרו באופן פעיל. לעומת נוגדנים חד-שבטיים, bsAbs יש שני מודולים איגוד אנטיגן שונים, המאפשרים להם לזהות שתי מטרות שונות בו זמנית וביעילות לעורר הגיוס של תאים חיסוניים אפקטור למטרה ולהרוג תאים סרטניים2.
תבניות bsAb רקומביננטי הנוכחי ניתן להקצות באופן כללי שתי מחלקות: bsAbs המכילים Fc ו- bsAbs ללא אזור Fc. בהשוואה לתבניות Fc המכילים בעיקר המיוצרים בתאי יונקים, bsAbs ללא אזור Fc יש היתרונות בגדלים קטנים יותר, בקלות רבה יותר מיוצרים במערכות ביטוי מיקרואורגניזם, והוא יכול לחדור רקמות הגידול ביעילות רבה יותר 3.
bsAbs ללא אזור Fc נוצרות בדרך כלל על-ידי קישור moieties איגוד בודדים, כגון שברים משתנה יחיד-שרשרת (scFvs) או פאבס3. ללא ייצוב התחומים, bsAbs מבוסס על שברי scFv לעיתים קרובות חשף יציבות תרמית, המסיסות נמוכה או הפוטנציאל מוגברת של צבירת4,5. לעומת זאת, מבוססת-חיובי bsAbs יציבים יותר בשל heterodimerization של CH1 ו- CL ב4,moiety Fab יליד6.
תחום משתנה של נוגדנים כבד שרשרת-בלבד (VHHs, המכונה גם נוגדנים מחשבים בודדת) הם הרסיס אנטיגן מחייב פעיל של נוגדנים טבעיים שרשרת כבדה7. VHHs יש את המאפיינים של זיקה גבוהה, ירידה לפרטים של IgGs המקובלת8, immunogenicity נמוך, תפוקה גבוהה חיידקי הביטוי9. לעומת Fv שברי, VHHs יש יציבות תרמית גבוהה10 לעומת Fab moieties, VHHs יש בגדלים קטנים יותר בשל היעדר CH1 ו- CL. לפיכך, S-Fab, התבנית bsAb שהושגו על-ידי קישור של Fab עם נוגדן מחשבים בודדת, VHH, היה מתוכנן ולמד אפקטים אנטי הגידול שלה,11,12.
במחקר זה, תוארה הקמת GPC3-S-Fab על-ידי קישור של Fab של hGC3313 עם VHH anti-CD16a14 . GPC3-S-Fab יכול להיות מיוצר באופן יעיל על-ידי periplasmic ביטוי Escherichia coli (e. coli). מחקרים פונקציונלי של GPC3-S-Fab הציע כי GPC3-S-Fab היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול בסרטן הכבד. לפיכך, היתרונות של GPC3-S-Fab על טכניקות חלופיות בנתונים החלים על מחקרים קודמים כוללים ייצור קל טיהור, ואת bsAbs יציב יותר.
הביטוי יונקים ומערכות ביטוי prokaryotic שימשו כדי לבטא בפורמטים שונים של BsAbs. בניגוד ביטוי בתרבית של מערכות, e. coli-מערכות ביטוי חלבון מבוסס יש יתרונות רבים, כולל תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה, חוסך עבודה, להקל על מניפולציות גנטיות ו- יעילות המרה גבוהה15. להבעה bsAbs e. coli, ישנן שתי אסטרטגיות בסיסיות: ביטוי ציטופלזמה, ביטוי periplasm בין ציטופלזמה החיצוני של קרום התא15. לעומת הסביבה תוך צמצום של הציטופלסמה, periplasm הוא סביבה, המקדם את הקיפול הנכון יותר חמצון, שותף ביטוי של חלבונים16. קיפול הנכון ממלא תפקיד מפתח בדור מסיסות, יציבות ותפקוד של bsAbs. לכן, נוספה pelB רצף האות N-הסופית של S-Fab לכוון הפרשת כדי periplasm e. coli17. כדי להבטיח הנכון קיפול, המסיסות, יציבות תרמית, יציבות הסתגלותי, להפחית את המורכבות ואת הגודל של נוגדן הוא לעתים קרובות מועסקים16. התבנית S-Fab מורכב Fab אחד אחד VHH, הבאה לידי ביטוי היטב ככל הנראה בגלל מבנה פשוט של גודל קטן חיידקי מערכות.
GPC3 נבחרה תבנית נוגדן bispecific זו GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) הוא חבר של המשפחה פרוטאוגליקן סולפט (HS) הפארין מעוגנת השטח תא דרך glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 הוא overexpressed ב-70% מהמקרים (HCC) קרצינומה hepatocellular, באיזה חשבון עבור הרוב המכריע של סרטן הכבד19,20,21,22. כי GPC3 מתבטאת לעיתים רחוקות רקמות רגילה, GPC3 הוצע כמטרה פוטנציאלית עבור HCC. MAbs בעכבר מרובים הופקו נגד GPC3. עם זאת, רק GC33 הציג פעילות אנטי הגידול מוגבל 22, והוא נכשל להפגין יעילות קלינית בחולים. במחקר זה, GPC3-S-Fab הוצגה היכולת לגייס תאי NK כדי להרוג תאים סרטניים GPC314.
לגייס תאי NK, שימש VHH אנטי-CD16. CD16a הוא קולטן IgG זיקה נמוכה, באה לידי ביטוי בעיקר על תאים הרוצח הטבעיים (NK), מקרופאגים, ומונוציטים ו תתי כמה סוגים של תאי T. זה מעורב נוגדנים תלויי תא cytotoxicity (ADCC) על ידי תאי NK23. תאי NK אדם יכולים להיות מסווגים לשני סוגים, CD56 - CD16 + ו CD56 + CD16-. בניגוד תאי NK CD56 + CD16−, CD56-תאי NK CD16 + יכול לשחרר רמות גבוהות יותר של perforin granzyme B, ובכך להציג cytotoxicity חזקה של24. תאים Kupffer (kcs ב), לבטא CD16a, הם המקרופאגים תושב בכבד. תאים Kupffer תפקיד חשוב בדיכוי סרטן הכבד25. לפיכך, ייתכן bsAbs מיקוד CD16a אסטרטגיה מבטיח יותר מאשר עיסוק ותאי T כנגד סרטן הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים לרבות איסוף דם אנושי אושרו על ידי ועדת האתיקה סון יאט-סן אוניברסיטת.
1. GPC3-S-Fab דיזיין
- עיצוב GPC3-S-Fab על-ידי קישור של Fab של אנטי-GPC3 (humanized GC3313) עם אנטי-CD16 VHH14 (איור 1).
- לסנתז, לשכפל את VH-CH1-CD16-VHH ו- VL-CL לתוך הווקטורים pET26b ו- pET21a כמו שדווחה בעבר12.
2. שינוי, תרבות
- להוסיף 100 ננוגרם של pET26b המכילה VH-CH1-CD16 (איור 1 א') ל- 100 ננוגרם של pET21a המכילה VL-קלרנית (איור 1 א') לתוך µL 100 של BL21 המוסמכת תאים (DE3). מערבבים היטב ו דגירה על קרח במשך 30 דקות Incubate באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45-90 s, העברה, דגירה על קרח למשך 3-5 דקות.
- להוסיף 500 µL בינוני מרק (ליברות) lysogeny לתוך צינור המכילים BL21 (DE3) תאים, ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 150 סל ד במשך 45-60 דק 100 להפיץ את µL של BL21 (DE3) תאים על LB-אגר צלחות המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 של אמפיצילין , ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
- להכין lysogeny מרק (LB) בינוני: טריפטון wt/vol 1%, תמצית שמרים wt/כרך 0.5%, 1% wt/כרך NaCl.
- לחסן תאים שמושבה בודדת לתוך מ ל מרק סופר (SB) בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין, והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד, בין לילה. לאחר מכן, לחסן 1 מ"ל של תרבות לתוך 100 מ של SB בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד במשך 4 שעות. לאחר מכן, להעביר 10 מ"ל של התרבות 1 ליטר של SB בינוני המכיל 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 אמפיצילין והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד.
- להכין מרק סופר בינוני: 3.2% wt/כרך טריפטון, תמצית שמרים 2% wt/vol, 0.5% wt/כרך NaCl.
- כאשר ה OD600 מגיע 0.6 - 0.8, להוסיף איזופרופיל-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ריכוז סופי של 0.2 מ מ. תרבות-16 ° C, סל ד 180 במשך 36-48 שעות עבור ביטוי periplasmic.
3. GPC3-S-Fab טיהור Periplasmic
- שבר periplasmic הכנה
- איסוף תאים על ידי צריך שתוציאו ב g 4,000 x, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, למחוק את המדיום, שוקל את התאים.
- Resuspend התאים ביסודיות 4 מ"ל של פתרון סוכרוז כקרח (20 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 25% (wt/כרך) סוכרוז ו- 1 מ מ EDTA) לגרם של תאים, דגירה על קרח למשך 15 דקות.
- צנטריפוגה ב g 8,500 x (צנטריפוגה מלמעלה בטבלה, זווית קבועה רוטור), 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות להסיר את תגובת שיקוע (השבר סוכרוז), שמור את זה על קרח.
- Resuspend כדורי תערובת של קרח 5 מ"מ של MgCl2 ו- 1 מ מ PMSF (4 מ"ל לכל התאים גרם). הוסף µL 40 של המניה ליזוזים (15 מ"ג/מ"ל) לגרם, דגירה על קרח למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ב g 8,500 x (מלמעלה בטבלה צנטריפוגה, קבוע זווית רוטור), 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות להעביר תגובת שיקוע (השבר periplasmic) ולשמור אותו בקרח.
- לשלב סוכרוז שבר על שבר periplasmic, צנטריפוגה ב g 30,000 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להסיר את תגובת שיקוע, שמור את זה 50 מ ל צינור חרוט על קרח.
- טיהור זיקה Ni-נ
- Resuspend 1 מ"ל של ני-נ agarose על ידי ערבוב ביסודיות כדי להשיג השעיה הומוגנית, להסיר 1 מ"ל של ני-נ agarose על צינור חרוטי טריים 15 מ"ל ולהוסיף 10 טור אמצעי אחסון (CV) equilibration מאגר (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 1 מ' של NaCl) כדי equilibrate.
- צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות והסר את תגובת שיקוע בקפידה. לאחר מכן, להוסיף את agarose Ni-נ לתוך הצינור 50 מ ל המכיל סוכרוז שבר על שבר periplasmic. רוק ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- Centrifuge את התערובת ב 400 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק הסר בזהירות את תגובת שיקוע אחר צניעותו כקרח טריים כמו השבר לא מאוגד. להעביר את agarose Ni-נ לעמודה הכבידה.
- להוסיף 10 שטיפה מאגר קורות חיים (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 1 מ' של NaCl; 20 מ מ, מ מ 30 או 40 מ מ של imidazole) טור ו לאסוף elute כמו השבר כביסה.
הערה: יש להוסיף הפתרונות הבאים לפי סדר של ריכוז imidazole. - להוסיף 3 קורות חיים • תנאי מאגר (25 מ מ של טריס-HCl, pH 7.5; 300 מ מ NaCl; 100 מ מ, 200 מ מ, מ מ 300 או 400 מ מ imidazole) אל העמודה ולאסוף את elute כמו שבר • תנאי 1, 2, 3 ו- 4.
הערה: יש להוסיף הפתרונות הבאים לפי סדר של ריכוז imidazole. - דיאליזה שברים eluted ב 2 ל' ל- PBS (137 מ מ של NaCl, 2.7 מ"מ של אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, 2 מ מ של2פו ח'4, pH 7.4) באמצעות דיאליזה אבובים (12.4 kDa) ב 4 ° C עבור ה 2 לבדוק הנוכחות של GPC3-S-Fab ב-12 אחוז מרחביות-דף ולאחר מכן לפי Coomassie כחול מכתים.
- CH1 אג זיקה טיהור
- העברת 1 מ"ל של IgG-CH1 זיקה שרף לתוך צינור חרוטי 50 מ ל, לשטוף את החרוזים עם PBS קודם. לאחר מכן, הוסף את הפתרון dialyzed המכיל GPC3-S-Fab לאחר שלב 3.2.6. רוק ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע עוד טרי צניעותו קר כקרח, ולהעביר השרף עמודה הכבידה.
- להוסיף 10 קורות חיים של כביסה מאגר (PBS) לעמודה, ולאסוף • על תנאי כמו השבר לשטוף.
- הכינו את צינורות איסוף על-ידי הוספת 1 מ' של טריס pH 9.0 (0.1 מ"ל לכל מיליליטר כל שבר eluted). Elute עם קורות חיים 3 • תנאי מאגר (0.1 M של גליצין-HCl, pH 2.7), ולאסוף את השבר eluted; חזור על 3 פעמים.
- דיאליזה שברים eluted ב 2 ל' ל- PBS באמצעות דיאליזה אבובים (12.4 kDa) ב 4 ° C עבור ה 2 חוזר פעמיים.
- לקבוע ריכוז החלבון על ידי ultramicrospectrophotometer (הכחדה טוחנת מקדם: 91105. א 1280 = 0.69 mg/L).
4. מרחביות-דף וניתוח סופג-ווסטרן
- לקחת את µL 10 המדגם 5 x מרחביות טעינת מאגר ומערבבים היטב. מרתיחים את התערובת חלבון ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- להכין 5 x מרחביות טעינת מאגר: 250 מ מ של טריס-HCl, pH 6.8, 10% wt/כרך מרחביות, 0.5% wt/כרך bromophenol כחול, גליצרול vol/כרך 50%, 5% vol/כרך בטא-mercaptoethanol.
- הכן של ג'ל מרחביות-דף עם טעינת ג'ל (5%), ההפרדה ג'ל (12%) כפי שתואר לעיל26,27,28.
- טען µL 10 של תערובת חלבונים מבושלים, סמן חלבון, והשתמש מרחביות-הדף.
- כתם הג'ל ע י ניעור כעשרים דקות עם פתרון כחול מבריק Coomassie, ולאחר מכן לבצע destaining.
- עבור סופג המערבי, לאחר העברת קרום PVDF, לחסום את הקרום עם TBST (20 מ מ של טריס-HCl, 150 מ מ של NaCl, 0.1% vol/כרך Tween 20) + 5% wt/vol. וקפה לשעה בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול.
- דגירה הקרום עם נוגדנים הראשי (אנטי-שלו או אנטי-דגל) מדולל 1:2,000 TBST + 5% חלב רזה לשעה.
- לשטוף עם TBST למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, וחזור על 3 פעמים.
- דגירה הקרום של נוגדנים משניים (מקושר HRP העכבר אנטי Fc נוגדנים) מדולל 1:2,000 TBST + 5% חלב רזה לשעה.
- לשטוף עם TBST למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, וחזור על 3 פעמים.
- להוסיף 1 מ"ל של מצע HPR לכל הסרט, ולפתח תמונות.
5. ג'ל סינון ניתוח
- להשתמש בעמודה הבאה: עמודה נפח של 24 mL; Equilibration מאגר של PBS pH 7.4; קצב הזרימה של 0.5 mL/min בחדר ממוזג; נפח דגימה של 200 µL.
- השתמש ריכוז ונפח חלבון הבאים: 500 µL של 1.2 מ"ג/מ"ל GPC3-S-Fab. צנטריפוגה ב g 20,000 x למשך 30 דקות, ולקחת µL 200 כדי לטעון.
- החלבון הסמן ריכוז ונפח, סעו µL 100 של ציטוכרום C (2 מ"ג/מ"ל, 12.4 kDa), 140 µL של אנהידראז (3 מ"ג/מ"ל, 29 kDa), 140 µL של אלבומין (10 מ"ג/מ"ל, 66 kDa) µL 200 של אלכוהול דהידרוגנאז (5 מ"ג/מ"ל, 150 kDa) לתוך שפופרת אחת. צנטריפוגה ב g 20,000 x למשך 30 דקות, ולקחת µL 200 כדי לטעון.
- לפני כל הפעלה, לשטוף עם פחות 2 קורות חיים של מים מזוקקים בספיקה של 0.5 mL/min.
- Equilibrate את העמודה עם פחות 2 קורות חיים equilibration מאגר (PBS, pH 7.4) בספיקה של 0.5 mL/min.
- באופן אוטומטי להזריק את הדגימה ב- 0.5 מ ל/דקה כדי לטעון את הדגימה.
- Elute עם equilibration מאגר ב 0.5 mL/min ולגלות -280, 215 ננומטר.
6. לזרום Cytometry ניתוח
- תרבות של HepG2 (GPC3 חיובי), Hep3B (GPC3 חיובי), Huh7 (GPC3 חיובי), ותאים MHCC - 97H (GPC3 שלילי) במנות פלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ המכיל DMEM בינוני עם 10% סרום שור עוברית (FBS), פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 ° C, 5% CO2.
- תרבות צ'ו (GPC3 שלילי) תאים ותאים צ'ו/GPC3 מסתירים את באורך מלא האנושי GPC3 cDNA (GPC3 חיובי) במנות פלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ המכיל RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- תרבות NK92/CD16 מחסה באורך מלא של האדם CD16 cDNA (CD16 חיובי) ב 25 ס מ2 בקבוק המכיל RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS פניצילין (100 µg/mL), סטרפטומיצין (50 µg/mL)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- כאשר התאים confluent 70-90%, ביטול המדיום ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל ל- PBS. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות (או עד התאים נתחיל לנתק מעל פני השטח). להוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול מלאה כדי לנטרל את טריפסין והשהה מחדש את התאים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
- לספור את מספרי הטלפון הנייד באמצעות hemocytometer נויבאואר ולגלות את הכדאיות תא על-ידי Trypan Blue.
- לאסוף 3 x 106 תאים עבור כל קו תא. להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA להשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר פעמיים.
- הוסף mL 0.3 של PBS + 0.2% BSA להשעות מחדש את התאים, להעביר כל שפופרת סיבוב המדרגה פוליסטירן מ ל 100 µL (כ 1 מיליון).
הערה: נא ודא כי בכל הצעדים מכאן הצינורות צריכים להישמר קר על קרח. כאשר הנוגדן הוא איגוד אנטיגן פני שטח התא, המתחם יתחילו להפנים. על ידי שמירה זה קר, התהליך הוא האט באופן משמעותי. - להוסיף 10 µL של נוגדנים הראשי (GPC3-S-Fab או IgG1 אנושי, ריכוז סופי 5 µg/mL) כל שפופרת, דגירה על קרח לשעה.
- להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA כדי לשטוף, צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר שלוש פעמים.
- להשעות מחדש ב- 100 µL של PBS + 0.2% BSA, ואז להוסיף 0.5 µL של נוגדנים משניים (אנטי-האדם ריכוז IgG(H+L)-488, גמר 10 µg/mL), דגירה על קרח על ה 1 הערה: מהשלב הזה, בבקשה להשאיר את התאים מן האור.
- להוסיף 1 מ"ל של PBS + 0.2% BSA כדי לשטוף, צנטריפוגה ב g 200 x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק חוזר שלוש פעמים.
- לנתח את התאים על ידי זרימת cytometer על פי הנוהל המקובל29. רוכשים תאים עם 488 ננומטר לייזר עבור עירור.
7. מבחני ציטוטוקסיות
- להכין תאים סרטניים.
- תרבות HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H וצ'ו תא קווים כמתואר בצעדים 6.1-6.5.
- לדלל לתאים 0.5 × 105/mL, לוחית רישוי תאים µL 100 (5,000 תאים לכל טוב) על צלחות 96-ובכן. תרבות 6-8 h כדי לאפשר את התאים לצרף.
- להכין את תאי תאי דם היקפיים אנושי (PBMCs).
- לדלל דם טרי מוכן עם אמצעי אחסון שווה ל- PBS צינור חרוטי 50 מ. לדוגמה, לדלל 10 מ"ל של דם עם 10 מ"ל ל- PBS.
- לקחת 15 מ"ל של לימפוציטים הפרדה בינוני לתוך צינור חרוטי מ"ל. להעביר את הדם מדולל על המדיום ההפרדה לימפוציט לאורך הצד צינור לאט.
הערה: לשמור את הצינור אנכי. אינם מפרים את פני השטח של המדיום ההפרדה לימפוציטים. - צנטריפוגה ב 400 x g למשך 35 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם חופש.
- אט-אט להסיר את השכבה העליונה פלזמה, ולקחת את שכבת דם לבן המכיל PBMCs-הממשק בינונית של ההפרדה פלזמה-לימפוציטים.
- לדלל את PBMCs עם נפח כפול של PBS + 2% FBS. צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות.
- לשטוף את התאים פעמיים עם PBS + 2% FBS. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דק ספירת המספרים תא כפי שמתואר בשלב 6.5.
- להכין את תאי NK.
- המתלה PBMCs-ריכוז של 5 x 107 תאים למ"ל PBS + 2% FBS, ובמקום להכין אותם פנימה צינור עגול-התחתון פוליסטירן מ ל.
- להוסיף לתא NK האנושי העשרה קוקטייל µL 50/mL של תאים. מערבבים היטב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- Resuspend החלקיקים המגנטיים מן התא NK העשרה קיט, לערבב היטב כדי להבטיח שהם מושעים בצורה אחידה על-ידי pipetting למעלה ולמטה נמרצות יותר מ 5 פעמים. להעביר את החלקיקים מגנטי resuspended-100 µL/mL התליה תא. מערבבים היטב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- להביא התליה תא עד הנפח הכולל של 2.5 מ על-ידי הוספת PBS + 2% FBS. לערבב את התאים בצינור על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים. מקם את הצינור (ללא כובע) לתוך המגנט. תן beads מגנטי את תירגע 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את המגנט. בתנועה רציפה אחת, היפוך ברכבת התחתית, לשפוך את התליה תא מועשר לתוך צינור חדש.
- ספירת המספרים תא כפי שמתואר בשלב 6.5.
- להגדיר את התגובה ציטוטוקסיות.
- לדלל תאי NK כדי 5 × 105 תאים למ"ל תוך שימוש באמצעי תרבות המתאים. להוסיף 100 µL של השעיה התא NK לתאי הגידול מצופה על צלחת 96-ובכן.
- להוסיף 10 µL של GPC3-S-Fab בריכוזים שונים, עם המינון הגבוה ביותר-ריכוז סופי של 30 µg/mL, דילול 3-fold, נקודה 9 (שלושה משכפל).
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ב 72 h.
- לאחר 72 h של דגירה, להסיר את המדיום, להוסיף 100 µL בינוני DMEM המכיל 10 µL של ריאגנט CCK8 כדי מכל קידוח ב 96-ובכן צלחות ואני ואז דגירה ב 37 º C.
- לקרוא את הצלחת ב 450 nm ב 1, 2, 3 ו- 4 שעות לאחר הוספת הכימית CCK8.
- לנתח את הנתונים. לחשב את שיעור ההישרדות (OD450 GPC3-S-Fab + אפקטור + גידול - OD450 בינוני) / (OD450 הגידול - OD450 בינוני) × 100% ו (OD450 GPC3-S-Fab + גידול - OD450 בינוני) / (OD450 הגידול - OD450 בינוני) × 100%. התאים אפקטור הם תאי NK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GPC3-S-Fab טיהור
GPC3-S-Fab היה טהור של e. coli על ידי טיהור זיקה שני שלבים, הראשון עם Ni-נ-agarose, ואחריו IgG-CH1 זיקה טיהור. לאחר הטיהור זיקה בשני שלבים, GPC3-S-Fab היה טהור עד הומוגניות עם שתי השרשראות קרוב 1:1 (איור 2 א). הנוכחות של polypeptides VHH VH-CH1-CD16 ו- VL-CL ניתן לזהות באמצעות תגיות C-מסופים נפרדים שלהם, אנטי שלו עבור VL-CL כ 25 kDa וכן נגד דגל עבור kDa VH-CH1-VHH כ 38 (איור 2B). לאחר הטיהור זיקה בשני שלבים, ניתן להשיג ~1.2 מ"ג חלבון 1 ליטר של SB תרבות. לאפיון נוסף מטוהרים GPC3-S-Fab, בוצע סינון ג'ל. בהתבסס על הסימנים סטנדרטי (איור 2C), GPC3-S-Fab זוהה של מונומר הומוגנית בדמות heterodimer עם גודל מולקולרי של 63 kDa (איור 2C).
פעילות האיגוד GPC3-S-Fab
כדי להעריך אם GPC3-S-Fab מזהה את GPC3-חיוביות תאים ותאים CD16-חיובית, נערך ניתוח cytometry זרימה באמצעות הקווים התא סרטן הכבד GPC3-חיובית HepG2, Hep3B, Huh7, צ'ו/GPC3 וקו התא סרטן הכבד GPC3-שלילי, MHCC - 97H ותאים צ'ו. GPC3-S-Fab יכול לאגד כל התאים GPC3-חיובית, אך עם קשירה חלש יותר Hep3B (איור 3B) ותאים Huh7 (איור 3C) מאשר ל HepG2 (איור 3 א), צ'ו/GPC3 (2F איור). לא או מינימלי מחייב תאים GPC3-שלילי MHCC - 97H וצ'ו נצפתה (דמות תלת-ממד, 3E). GPC3-S-Fab גם יכול לאגד התאים CD16-חיובית, תאים NK92/CD16 (איור 3G). תוצאות אלו הם עקביים עם תוצאות קודמות באמצעות אחרים אנטי-GPC3 נוגדנים30, רומז כי GPC3-S-Fab במיוחד ניתן לאגד שורות תאים GPC3-חיוביות ותאים CD16-חיוביות.
כדי להעריך את cytotoxicity של GPC3-S-Fab, תאים סרטניים היו מודגרות עם תאי NK מבודד טריים עם ריכוזים שונים של GPC3-S-Fab. ללא תאי NK, GPC3-S-Fab היו לא cytotoxicity נגד תאים סרטניים ללא קשר למעמדו ביטוי GPC3 (איור 4). בנוכחות תאי NK, GPC3-S-Fab עורר cytotoxicity חזקה נגד תאים HepG2, Hep3B ו- Huh7 באופן תלוי מינון אבל הראו אין השפעה על תאים GPC3-שלילי MHCC - 97 H (איור 4), רומז על cytotoxicity של GPC3-S-Fab תלוי GPC3 הביטוי על פני תאי הגידול.
איור 1. בונה GPC3-S-Fab
(א) הביטוי חיידקי בונה GPC3-S-Fab. המבנה מכיל רצף אות של pelB , VHH VH-CH1-נגד-CD16 (שרשרת כבדה) humanized אנטי-GPC3 (GC33), או מודיע VL (שרשרת אור). כדי להקל על זיהוי חלבונים, טיהור, תג דגל או תג His8 הוסיפו את קצה קרבוקסילי. (B) תרשים של GPC3-S-Fab לאחר ביטוי משותף.
באיור 2. GPC3-S-Fab טיהור של e. coli.
החלונית השמאלית (א), לאחר כרומטוגרפיית Ni-נ; לוח נכון, אחרי anti-אג-CH1 כרומטוגרפיית זיקה; מ', משקל מולקולרי סולם; Coomassie כחול מכתים. החלונית השמאלית (B), לאחר כרומטוגרפיית Ni-נ; לוח נכון, אחרי anti-אג-CH1 כרומטוגרפיית זיקה; מ', משקל מולקולרי סולם; מערבי-סופג. (ג) ג'ל סינון לפי ניתוח של GPC3-S-Fab. החלונית העליונה, סמני רגיל; פאנל התחתונה, GPC3-S-Fab. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. GPC3-S-Fab מזהה תאים חיוביים GPC3 ותאים CD16-חיוביות.
Flow cytometry ניתוח של HepG2 (א), Hep3B (B), Huh7 (ג), MHCC - 97 H (D), צ'ו (E), צ'ו/GPC3 (F) ותאים NK92/CD16 (G) בוצעה כמפורט בפרוטוקול. הקו האדום: גידול בתאי בלבד; קו ירוק: isotype שליטה, גידול התא + האדם IgG1 + אנטי-האדם IgG(H+L)-488; קו כחול: הגידול תא + GPC3-S-Fab אדם אנטי איג (H + L)-488. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. GPC3-S-Fab מקדמת את מות תאים של תאי סרטן GPC3-חיוביות.
מבחני למינון cytotoxicity בוצעו כפי שמתואר הפרוטוקול עבור HepG2 (א), Hep3B (B), Huh7 (ג), ו- MHCC - 97 H (D). הריכוזים של GPC3-S-Fab היו מן µg 0.0045/mL µg 30/mL. הנתונים הם הממוצע של triplicates עם קווי שגיאה המייצג את סטיית התקן. מעגל מוצק, רק GPC3-S-Fab; ריבועי מושלם, GPC3-S-NK Fab+, תאי NK (50,000 לכל טוב) ותאים היעד (5,000 לכל טוב). תערובות היו הדגירה במשך 72 שעות לפני המדידה cytotoxicity. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, אנו מציגים אסטרטגיה לבנות פורמט חדש של bsAbs, GPC3-S-Fab, אשר יכול לגייס תאי NK מיקוד תאי גידול חיובי GPC3. S-Fab מבוסס על Fab טבעי תבנית על-ידי הוספת11,VHH anti-CD1612. לעומת אזור Fc המכיל bsAbs, GPC3-S-Fab יכול בקלות להיות מיוצר את periplasm של חיידקים בקנה מידה גדול.
באמצעות האסטרטגיה ביטוי וטיהור תיאר בפרוטוקול, השגנו מסיסים ופונקציונלי GPC3-S-Fab בכמויות גדולות. כדי להקל על הביטוי periplasmic, pelB רצף האות הוסיפו את קצה אמיני לכוון הפרשת כדי periplasm e. coli17. בניגוד הציטופלסמה, הסביבה יותר חמצון בשטח periplasmic בין הממברנות cytoplasmic והחיצוניים מצויד עם מספר חלבונים חשובים עבור קיפול חלבונים והרכבה, ובכך מקדם את הקיפולים לתיקון, מסיסות של חומרים16. עם זאת, מכונות קיפול חלבונים לייצא periplasm ב e. coli מוגבל קיבולת. ביטוי גבוהה של חומרים לעיתים קרובות תוצאות ההצטברות של מוצר לא מסיסים periplasm ה-16. כדי למנוע ביטוי גבוה של חלבונים על פני תקופה קצרה של זמן, נמוך IPTG (0.2 מ מ), טמפרטורה נמוכה (16 ° C) בינוני מזינה הוחלו בפרוטוקול הזה כדי למנוע ההצטברות של חלבונים לא מסיסים. במחקר זה, ~1.2 מ"ג חלבון היה המתקבלים 1 ליטר של מדיום, לשפר את התשואות לפחות קיפול כפול לעומת עבודות קודמות12.
כדי למנוע השפלה חלבון, יש לשמור כל שברים המכיל GPC3-S-Fab בשלבים שונים על קרח. . עם התגית בטרמינל-C של VL-קלרנית, Ni-נ-agarose שימש לטיהור. עם זאת, טיהור Ni-נ-agarose אחת אינה מספיקה כדי להסיר חלבונים לא רצויות, כגון אינטראקצית חלבון VL-CL. כדי לטהר את הומוגנית heterodimeric GPC3-S-Fab, השלב השני, אנטי-אג-CH1 זיקה טיהור, הוחל. חלבון מטוהרים היה טוהר גבוהה, שתי polypeptides קרוב ל- 1:1 (איור 2 א-2B).
כרומטוגרפיה סינון ג'ל יכול לקבוע את המשקולות מולקולרית של חלבונים המבוססת על שלהם מולקולרית הגדלים והצורות; לנתח את דרגת טוהר; לקבוע האם חלבון מטוהרים מונומר, דימר, או מורכב אגרגטים15. על ידי ג'ל סינון כרומטוגרפיה, GPC3-S-Fab מזוהה עם גודל מולקולרי הצפוי kDa כ 63, אשר הוא בצורת מונומר עם heterodimerization של GPC3-S-Fab (איור 2C).
Cytometry זרימה ניתן לקבוע אם נוגדן יכול להיקשר אנטיגן שלה על קרום התא, לעומת המסורתי המערבי-סופג ואליסה, אשר רק לזהות אנטיגן-נוגדן איגוד תגובות. על ידי ניתוח cytometry זרימה, GPC3-S-Fab הכירה את GPC3 על קרום התא, רומז ש-moiety GPC3-Fab היה פונקציונלי. בעת ביצוע ניתוח cytometry זרימה, חיוני כדי לשמור את כל השלבים על קרח או ב 4 ° C לאחר הנוגדן נוסף. כאשר הנוגדן נקשר אנטיגן פני שטח התא, המתחם נוגדן אנטיגן תיזום הפנמה. על ידי שמירה זה קר, תהליך הפנמה הואט משמעותית.
PBMCs ותאי NK הם ביעילות בודדו אותנו מהמתרחש דם היקפיים אנושי על ידי צנטריפוגה באמצעות לימפוציטים הפרדה בינוני, ואחריו מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות. GPC3-S-Fab הראה cytotoxicity חזק נגד התאים GPC3 חיובית כאשר היחס בין תאי NK לתאי המטרה (תאים סרטניים) היה 10:1, היחס של תאי NK לתאי המטרה יכול להשתנות 50:1 5:1.
לסיכום, GPC3-S-Fab, אשר יכול להיווצר במערכת הביטוי מיקרואורגניזם, מספק שדרה החדשה כדי ליצור תבניות פונקציונלי של bsAbs נגד גידולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי R & D תוכנית של בפרובינצית גואנג-דונג (סין) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
References
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
