Summary
このプロトコルでは、重要なステップとパッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行に必要な注意事項をについて説明します。この手法は、あらかじめ決められた一連のホールセルパッチク ランプ記録によって特徴付けられる単一細胞からの遺伝子発現プロファイルを解析するシンプルで効果的な方法です。
Abstract
大脳皮質は多数の細胞の種類様々 な形態学的、生理学、分子機能を展示で構成されます。この多様性は、これらの細胞の種類、固有の機能を研究するための前提条件の簡単な同定と解析を妨げます。この記事では、パッチ ・ クランプのスライスに記録後、単一のセルに同時に遺伝子の発現を検出するにより多重単一セル逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) プロトコルについて説明します。この単純な方法は形態的特性と実装でき、血管近傍などさまざまなセルタイプおよび彼らの特定の細胞の環境の形質を決定することも多い。この議定書の原則は記録するセルを収穫し、逆に、パッチ ・ クランプの技術ではその細胞質の内容を書き写す、マルチプレックス pcr 法の定性的検出する遺伝子の定義済みセットの式。PCR のプライマーおよび RT-PCR 法と互換性がある細胞内のパッチ ・ クランプ ソリューションの注意深いデザインを必要があります。選択的かつ信頼性の高い成績を確保するため検出、この手法には細胞質が増幅ステップに収穫から適切なコントロールも必要です。注意ここで説明は厳密に従う必要があります、実質的に任意の電気生理学的検査は、RT - pcr マルチプレックスの単一のセルを使用できます。
Introduction
大脳皮質には、様々 な生理学的なプロセスに関与する様々 な細胞タイプが装備されています。同定と解析、固有の機能を理解する前提条件することができます非常に挑戦的な大脳皮質細胞の種類1 を特徴付ける大きな形態学的、生理学、分子多様を与え、2,3,4。
単一セル多重 RT-PCR は、パッチ ・ クランプと RT-PCR 技術の組み合わせに基づいています。それは同時に生理識別されたセル5以上 30 事前定義された遺伝子の発現を調べることができます。さらに録音ピペットで神経トレーサーのインクルー ジョンにより、組織化学的啓示6,7,8,9,後記録された細胞の形態的特性10ですその形質5,9,10、11,12 の多変量解析に基づく神経型の分類に非常に便利な技だ。 ,,1314。単一のセル マルチプレックス RT-PCR によるアストロ サイト15,16,17など非神経細胞の特性に適しています、すべての脳構造18、事実上適用ことができます。 19,20,21,22,23とセル型、全細胞構成で記録できると仮定すると。
この手法は、非常に便利な細胞源の同定や伝送システム7,8,15,16,20,21、ターゲット 24,25,26,27,28, 特定の抗体が不足している場合は特に。それは視覚的に識別されたセルの29日からのホールセルパッチク ランプ記録に依存し、したがって特定の細胞環境8,15,16セルのターゲットができます。さらに脳スライスにおける脳組織の細胞構築が保持されるのでこの方法もできます神経および非神経要素7,8の特徴の細胞の解剖学的関係の検討,18。
この手法は、細胞質の収穫の量によって、RT の効率によって限られているので、低コピー数で表される mRNA の検出は難しくなります。高-高価なシーケンサーが必ずしも必要があります彼ら30,31,,単一のセル3,4の全トランスクリプトームを解析する RNaseq 技術に基づいて他のアプローチを可能にしますすべての研究室が使用できます。単一セル多重 RT-PCR 法は、エンドポイント PCR を使用しているためにだけ広く利用可能な thermocyclers が必要です。電気生理学的セットアップ装備研究所で簡単に開発することができ、高価な機器を必要としません。1 日の内で、定義済みの一連の遺伝子の表現の質的分析を提供できます。したがって、このアプローチは、迅速な方法で単一細胞の分子特性解析へ簡単にアクセスを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物を用いる実験のすべての手順をフランスの規制 (コード農村 R214/87 R214/130) に従い、行ったし、欧州経済共同体 (86/609/EEC) およびフランス語の国民チャーターの倫理的なガイドラインに準拠して動物実験の倫理。すべてのプロトコルは、チャールズ ・ ダーウィン倫理委員会で承認され、フランス教育・研究 (承認 2015年 061011367540) 省に提出します。IBPS 動物施設は (A75-05-24) のフランスの当局によって認定されています。
1. 予備的考察
メモ: 汚染を避けるためには、パッチ ・ クランプ後事業単一セル RT-PCR 前に次の推奨事項に従います。
- 彼らは汚染の潜在的なソース、研究室で興味のある遺伝子を含むプラスミドは使用しないでください。
- Pcr を準備するゲルの電気泳動室から研究室のベンチをぜひご予約ください。
- ピペットとエアロゾル耐性のフィルター ヒント、1 ng/μ L よりも低濃度の DNA と RNA の操作のセットを捧げます。PCR の製品を分析するためにこれらを使用しないでください。
- 常に RNase と DNase フリー製品を使用し、手袋を着用します。
- 内部パッチ ・ クランプのソリューションを準備するためには、専用の薬品を使用します。ヘラを使用しないが、むしろ粉末の重量を量るために、紙の重量を量るします。
- (例えばRNase) 汚染の源をすることができます専用の pH 電極・ pH 標準液を使用します。
- ストアのホウケイ酸ガラス管を;20 μ L の長い、細い、柔軟なヒント。20 μ L ピペット。自家製圧搾 (パッチ ・ クランプ ピペット ホルダー 10 mL の注射器に接続されている);500 μ L の PCR チューブ;10 μ L のエアロゾル耐性フィルター ヒント;専用ボックス (図 1) 永久的なマーカーを薄いです。
2. プライマー デザイン
注: マルチプレックス RT-PCR による増幅二段に依存します。最初の PCR の間に興味のあるすべての遺伝子はすべての PCR プライマーを一緒に混合することによって共増幅しました。単一セルからの成績証明書を確実に検出するため、効率的かつ選択的な PCR プライマーを設計に不可欠です。入れ子になった (内部) プライマーの PCR の第 2 円形のための使用は、特異性と増幅の効率の両方を向上させます。
- 関連家族 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) のそれらと同様、NCBI 参照シーケンス データベース32に興味の遺伝子の精選された mRNA シーケンスを取得します。
- クエリとして発現と関心の種の名前を入力し、取得した関連するシーケンスをクリックします。
- 分析を遺伝子のコード配列に制限するを送る(右上隅) をクリックし、形式として塩基配列と塩基配列 FASTAを選択します。ファイルの作成をクリックし、".nt"ファイル拡張子を使用して FASTA シーケンスを保存します。
- 相同性の領域を特定するのにコンゴウインコ ソフトウェア33 (複数のアライメントの建設及び解析ワークベンチ) または他の複数の配置ソフトウェアを使用します。
- ファイルをクリックして |新しいプロジェクト...シーケンス型としてDNAを選択します。遺伝子の塩基配列をインポートするシーケンスを選択 |シーケンスをインポート...「.nt」ファイルをロードします。すべて関連するシーケンスの手順を繰り返します。
- クリックし、全体のシーケンスを選択する回路の] ウィンドウですべてのシーケンスをドラッグします。
- 配置を選択しての相同領域を検索 |ブロックの検索...(CTRL + S)。検索方法で重複セグメント ペアを選択します。Pairwise スコア カットオフ(例えば1,000) 比較的高い値に調整と整列し、開始をクリックしてシーケンスの合計数に1 ブロック分 seqs. 。
- 検索結果ウィンドウが表示されて MP スコアが最も高い検索結果を選択し、リンクをクリックします。結果が見つからない場合は、 Pairwise スコア カットオフおよび/またはブロックごと分 seqs.を減らします。
- 相同領域の可視化を容易にするの配置を選択 |網かけの設定 |スコアを意味する。
- シーケンスのリンク部分を選択し、潜在的 MP スコアが低いと相同性の他の領域を判断する手順 2.2.3–2.2.4 を繰り返します。
- 最も特異的プライマーを得るためには、少なくともの配列相同性を持つ領域を選択します。
- すべてスプライスバリアントのシーケンスを取得し、2.2.1–2.2.6 の手順を繰り返します。全体的な検出のための共通の領域を選択します。専用のスプライスの変形解析20,34,35,36代替カセットを検討してください。
- 爆発37ゲノム (基本的なローカル配列検索ツール) を使用して (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 遺伝子のイントロン ・ エクソン構造を決定するモデル動物ゲノムの mRNA シーケンスを合わせます。
- マウスをクリックしてブラスト マウスのゲノムを選択し、クエリ シーケンスを入力してください] セクションで取得した FASTA シーケンスをアップロードします。プログラムの選択は、最適化のための類似性の高いシーケンス (メガブラスト)を選択し、爆発ボタンをクリックします。
- [概要] セクションで、最も高い Id で配置を選択 (最大 100%)。線形部機能で示されているように、興味の遺伝子に対応することを確認します。
- コーディング シーケンスのエクソンの連続を取得するクエリの開始位置を同じセクション内に配置を並べ替えます。クエリ シーケンス (図 2 a) にイントロンの位置に大体対応するすべてのヒットの開始と終了の位置に注意してください。
- サイズ基準 (図 2) に基づくゲノムの DNA (gDNA) 増幅から cDNA を簡単に区別するセンスとアンチセンスのプライマーの 2 つの異なるエクソンを選択します。
注: gDNA の増幅は、細胞質と核が収穫されたとき低い周波数で発生します。したがって、プライマー (図 2 a) を overspanning イントロンをデザインに不可欠です。イントロンのない遺伝子の場合核のコレクションは、可能性のある結果を混同することになるため問題です。この問題に対処するためのプライマー gDNA25の存在を検出するイントロン シーケンスを増幅を目的としたセットがあります。ゲノム コントロールが正の場合は、イントロン レスのすべての遺伝子の結果を捨てなければなりません。 - 効率的な増幅を成し遂げるためには、理想的には 200 と 400 塩基対 (図 2) の間で構成される長さの産物を生成するプライマーを選択します。
- マルチプレックス PCR のステップ中に同時に様々 な Cdna を増幅するには、55 ~ 60 ° C の 18 と 24 のヌクレオチドと融解温度 (Tm) との間の長さでプライマーを設計します。
- 増幅収量を減らすためには、二次構造の形成を最小限に抑える意味と最小限のヘアピンと双方向の長さ (図 2 b) プライマーを選択します。
- 同じ条件 (2.5 から 2.8 の手順) を使用して内部のプライマーを設計します。
- ヌクレオチド ブラストを使用して興味の生物の RNA シーケンス レファレンスデータベースのプライマーを合わせ、PCR のプライマーの特異性を確認します。
- ブラスト (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、ヌクレオチド ブラストをクリックします。入力クエリ シーケンスにプライマーのシーケンスを貼り付けます。
- 検索設定の選択] セクションで、その他 (nr など)をクリックして、データベースオプションの参照 rna (refseq_rna)を選択および有機体 (例えば、ハツカネズミ(taxid:10090) を指定) 目的の種に分析を制限します。
- プログラムの選択のために最適化する幾分類似しているシーケンス (blastn)を選択します。[アルゴリズム パラメーター ] セクション 7 安打を取得するチャンスを高めるために単語のサイズを減らします。
- 選択的なプライマーを設計、シーケンスでは、可能であれば不要な Cdna の少なくとも 3 の不一致のみを保持します。
- 最終濃度 1 μ M でのすべて外部プライマーを一緒に混合することができることを確保するために、(例えば、200 μ M) の比較的高い濃度で脱塩プライマーを注文します。
3. RT 試薬の調製
- 5 RT ミックス x: RNase フリー水で作業 RT ミックス ソリューション (5 x) を含む 25 μ M でランダム プライマーと 2.5 mM の dNTPs の 400 μ L を準備します。500 μ L のチューブに 20 μ L 因数としてこの作業ミックスを格納します。
- 20 x ジチオトレイトール (DTT): 0.2 M RNase フリーの DTT の 1 mL の水を準備し、50 μ L の因数として格納します。
- 5 μ 因数として RNase 阻害剤 (40 U/μ L) の 2,500 U と逆転写酵素 (RTase, 200 U/μ L) の 10,000 U を格納します。
- RT 試薬の最適な品質を確保するため因数-80 ° C で保存します。最大 10 セルと 1 日のみは、それらを使用します。
4 PCR 検証
- 興味の構造からの総抽出した RNA (通常 1 μ g)38の比較的大量の逆のトランスクリプションで Cdna を準備します。
- 予備手順について細胞 RT-PCR 法ではなく、RNase フリーのピペットを使用する専用のピペットを使用しないでください。1 μ g/μ L までの総 RNA を希釈します。
- 500 μ L の PCR チューブ、希薄化後の総 RNA の 1 μ L と RNase フリー水の 8 μ L を追加します。95 ° C 1 分で変性し、氷の上管を冷やします。
- 製造元から提供された RT 5 x バッファーの 4 μ L、RT ミックス ソリューションの 4 μ L、RTase の 1 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L、200 mM DTT の 1 μ L を追加 (セクション 3 を参照してください)。
- はじく、スピン、37 ° C で一晩インキュベート
- 数年前まで-80 ° C で Cdna を格納します。総 Rna の同等の 1 ng/μ L に希釈して Cdna の因数を準備します。
- ミックスし、単一セル RT-PCR 専用ピペットで 1 μ M で各プライマー対を希釈します。100 μ L の Pcr の各プライマー ミックスの 20 μ L を使用します。
- 氷の上の準備各プライマー プレミックス含む: 水 (酸、80 μ L)、バッファー、100 x dNTPs (50 μ M ごと)、500-1000 1 ng/μ L で希釈した cDNA の pg の 1 μ L および Taq のポリメラーゼの 0.5 μ L (2.5 U、5 U/μ L) X 10 の 10 μ L。
- 最適な温度コントロール用 PCR 機の井戸に収まる PCR チューブを使用します。PCR チューブのキャップや壁に触れることがなく、鉱物油のプレミックスに (~ 100 μ L) を 2 滴を追加します。
- プライマー二量体の形成を最小限に抑える、95 ° C で加熱済みたちで PCR チューブを配置することによってホット スタートを実行します。30 後 s、すぐに油の上にプライマー ミックスの 20 μ L を追放。
- 40 サイクルを実行する 95 ° C で 3 分後 (95 ° C、30 s; 60 ° C、30 s; 72 ° C、35 s) 5 分 72 ° C で最終的な延長のステップが続きます。
- Agarose のゲルの電気泳動 (2%、重量/体積)39によって各 PCR の製品の 10 μ L を分析します。いくつかの PCR の製品は、予想されるサイズを持たない場合は、(セクション 2 を参照してください) その他のプライマーを再設計します。
注意: 臭化エチジウムは DNA の突然変異を誘発することができますデュアルインターカレーションの化学です。それを使用する前に地域の安全のオフィスを参照してください。それを操作するときは、必ず手袋を着用します。粉末ではなくエチジウム ブロマイド (10 mg/mL) ソリューションの市販ソリューションを使用して、吸入の危険性を最小限に抑えます。同様に、紫外線は、有害である、ので、UV 保護安全メガネやマスクを着用することを確認できます。汚されたゲル、ヒント、手袋とエチジウム廃棄物専用容器にバッファーを撤回します。 - すべてのプライマー対をすべて個別に検証すると、多重プロトコル (図 3) をテストします。
- ミックスし、多重プライマー ミックス数週までの-20 ° C で 1 μ m 店で一緒にすべての外部プライマーを希釈します。
- 氷の上を含むプレミックス準備: 水 (酸、80 μ L)、バッファー、100 x dNTPs (各 50 μ M) の 1 μ L、1 ng/μ L、および Taq のポリメラーゼの 0.5 μ L (2.5 U、5 U/μ L) で希釈した Cdna の 500-1,000 の pg X 10 の 10 μ L。
- PCR チューブにフリック、スピン、およびミネラル オイルを 2 滴 (~ 100 μ L) を追加します。
- 多重プライマー ミックスの 20 μ L で 4.5 の手順で説明するように、ホット スタートを実行します。95 ° C で 3 分は後、ステップ 4.6 の場合と同じ 20 の PCR のサイクルを実行します。
- PCR チューブを分析する遺伝子の数と同一の数を準備します。4.8.2、ステップがテンプレートとして 1 μ L の per 遺伝子最初の PCR の製品を使用してのようにプレミックスを準備します。ピペッティング エラーを補うために余分な量の 10% を使用を検討・分析する遺伝子の数によると、すべてのボリュームを調整します。
- 軽く振る、スピン チューブ、各 PCR チューブでプレミックスの 80 μ L を派遣し、壁や管のキャップに触れることがなく管あたりのミネラル オイルを 2 滴 (~ 100 μ L) を追加します。
- ホットを実行 (手順 4.5 参照) を開始内部プライマー ミックスの 20 μ L 追放 4.2 の手順で準備します。4.6 のステップと同じ 35 PCR のサイクルを実行します。
- Agarose のゲルの電気泳動によって 2 つ目の PCR の製品を分析します。すべての 2 番目の PCR が予想されるサイズの増幅を生成することを確認します。非効率的なまたは非特異的な増幅の場合新しいプライマー (ステップ 2.5-2.12) の再設計し、検証 (ステップ 4.2-4.8)。
5. 調製と細胞内のパッチ ・ クランプのソリューションの検証
注: 次のプロトコルは準備を記述する、K+/gluconate の検証ベースの内部ソリューションは、RT-PCR の効率性を阻害しない限り、事実上あらゆるタイプのパッチ ・ クランプのソリューションを使用できます。手袋は、RNase フリーの内部ソリューションを取得する必須です。
- 内部のパッチ ・ クランプ記録ソリューションの 60 mL の 0.1 M 島の即席 10 mL を準備します。
- グリコールエーテルジアミン四酢酸 (最終的な 0.5 mM) 0.9 mL の 0.1 m コに 11.4 mg を溶解します。
- RNase フリー 40 mL の水を追加し、K グルコン (最終的な 144 mM)、HEPES (最終 10 mM)、143 mg と 1 M MgCl2 (最終的な 3 mM) 180 μ L の 2.02 g を溶解します。
- 7.2 pH を 0.1 m 島 ~ 6 mL を追加することによって調整します。
- 295 mOsm ~ 13 ml の RNase フリー水に浸透圧を調整します。
- 内部ソリューションは逆のトランスクリプションのバッファーとしても使用するので慎重に Mg2 +濃度を制御します。その後 RT の反作用 2 mM の最終濃度に到達する MgCl2を追加することによって内部ソリューション低 Mg2 +濃度を補正します。
- パッチ ・ クランプ記録後収穫のセルにラベルを付ける、(手順 5.1-5.5) 上記内部ソリューションに RNase フリーの biocytin の 2-5 mg/mL を追加します。
- フィルター (0.22 μ m 孔サイズ) 内部のソリューション、100-250 μ 因数-80 ° C で保存できます。
- シングルセル RT-PCR 用内部ソリューションを検証するため、パッチ ・ クランプ ソリューションの 6 μ L を 1 ng/μ L で希釈した総 Rna の 0.5 μ l 添加し約 30 分間ベンチでそれを残します。
- 2 μ L ピペット 0.5 μ L、0.5 μ L RNase 阻害剤の 20 倍の DDT の 0.5 μ L RT ミックス x 5 の 2 μ L を追加 RTase、37 ° C で一晩インキュベートし、
- チューブを回転します。氷の水 (品質、80 μ L)、10 μ L の 10 X バッファー、および Taq のポリメラーゼの 0.5 μ L (2.5 U、5 U/μ L) を追加します。
- 検証済みプライマー (4.4-4.6 のステップ) のセットを使用して PCR の 40 のサイクルを実行します。
- Agarose のゲルの電気泳動で PCR の製品を分析 (ステップ 4.7 を参照) し、予想サイズがあることを確認します。
注: 省略総 RNA の 0.5 μ L、0.5 μ L RNase フリー水に置き換えることが内部ソリューションは RNA や DNA の汚染の無料を確認します。
6. 急性スライス標本
注: このプロトコルについて説明しますスライス少年 (すなわちより小さい 28 生後日) 雌雄マウス。(アプライド) 人工髄液のショ糖ベースなど、他の切削ソリューション使用可能な40があります。
- 準備 2 L (mM) で 2.5 125 NaCl を含むアプライドの KCl, 2 CaCl2、1 MgCl2、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、10 のブドウ糖および 15 スクロース。スライス標本中にグルタミン酸の作用を抑えるには、キヌレン酸の 1 ミリメートルを追加することによって切削ソリューションを準備します。
- 、スライスする前に外科はさみ、精細なアイリスはさみ、2 つのへら、鉗子、ペーパー フィルターとシアノアクリ レート系接着剤のディスクを含む解剖キットを準備します。
- O2/CO2 (95%/5%) と切削室-20 ° C に冷却飽和冷たい切削ソリューションを使用します。
- イソフルランを浸した小さな紙タオルでマウスを麻酔します。〜 2 分後にマウスがピンチを足に反応がないことを確認することによって深い麻酔下にあることを確認します。
- すぐにマウスの首をはねます。頭皮を取り外し、頭蓋骨を開きます。慎重に脳を抽出し、氷冷 (~ 4 ° C) 切削液 O2/CO2酸素でいっぱい小さなビーカーに入れます。
- -20 ° C の条件から切削チャンバーを外し、ペーパー タオルで水分を除去します。
- 慎重に関心領域を分離し、切削チャンバーに接着 O2/CO2酸素冷たい切削ソリューションを追加脳を解剖します。
- Vibratome を使用して 300 μ m 厚さのスライスをカットします。酸素切削液でいっぱい休憩室に室温でそれらを転送し、少なくとも 0.5 時間を回復することを許可します。
7 パッチ ・ クランプ記録後単一細胞 RT-PCR
- 30% H2O2ソリューションの ~ 100 mL で定期的に灌流システムをきれいし、RNase の混入の見落されたソースだ 〜 500 mL の細菌の成長を避けるために蒸留水とすすいでください。
- 収穫は毎日高濃度の漂白剤と記入パッチ ピペットでフィラメントを塩素します。パッチ ピペットがむしろ 20 μ L の長い、見事に、柔軟な先端が 1 mL の注射器に接続されているを埋めるためにマイクロ ピペットを使用しないでください。RNase フリー水洗い流しで広くし、ガスの塵払いによってそれを乾燥します。
- RT ミックスにより、20 x DTT x 5 を含有した氷の小さなボックスを準備します。ベンチトップ クーラーに-20 ° C で RTase と RNase 阻害剤因数を格納します。
- 1-2 mL/分で酸素アプライドで灌流記録室にスライスを転送します。
- 手袋を着用しながらホウケイ酸ガラスからパッチ ピペット (1-2 μ m 開く先端径、3-5 MΩ) を引いて、内部ソリューションの 8 μ L でそれらの 1 つを埋めます。ピペットの引き手のノブ、RNase のコンタミネーションの発生源であることに注意してください。
- 新しい手袋を着用し、指でフィラメントに触れていない中、ピペット ホルダーにピペットを配置します。
- 肯定的な圧力とパッチ ピペットをアプローチし、標的細胞 (図 4) を特徴付けるための全細胞記録を実行します。
- 20 分41.に全細胞構成で時間を制限、Mrna を維持するために
- 録音の最後に、満ちている 2 500 μ L の PCR チューブを準備 RT ミックス x 5 μ L と 20 の 0.5 μ L x DTT、スピンと氷の上保存します。
- 穏やかな負圧 (図 4) を適用することによって細胞の細胞を収穫します。視覚的にタイトなシールを維持しながらピペット内部セルのコンテンツが付属しているコントロール。
- いくつかのイントロン少ない遺伝子と見なされる場合、核を収集可能な限り避けてください。このようなケースで常に調査するためにゲノムの汚染 gDNA を増幅を目的としたプライマーのセットがあります。
- 核にはピペットの先端が近づいて、負の圧力を解放し、核からピペットを移動します。確実にタイトなシールを保存し、新しいピペット位置に細胞を収集するために再起動します。
- ないより多くの材料が来ているときやタイトなシールを失う前に収穫を停止します。
- 優しく細胞残骸 (図 4) によって汚染を制限して後続の組織化学的分析のため細胞膜の閉鎖を支持する外側をパッチを形成するピペットを撤回します。
- そのノブ、マイクロマニピュレーター、コンピューターのキーボードに注意してくださいまたはコンピューターのマウスは RNase の混入の潜在的なソースです。録音中に変更されている場合、は、手袋を変更します。
- ピペットを付ける、圧搾、PCR チューブに肯定的な圧力 (図 1) を適用することでそのコンテンツを追放します。
- ヘルプのコンテンツのコレクションに PCR チューブにピペットの先端を分割します。
- チューブを遠心分離機、RNase 阻害剤 0.5 μ L と RTase の 0.5 μ L を追加、穏やかに混合、再び、遠心分離機、37 ° C で一晩インキュベートを簡潔に
- スピン チューブ、PCR 解析まで数ヶ月まで-80 ° C で保存できます。
- 水 (酸、80 μ L)、10 μ L の 10 x バッファー、および Taq のポリメラーゼの 0.5 μ L (2.5 U) を追加することによって RT 製品の ~ 10 μ L を含むチューブで直接最初の拡大のステップを実行します。その後、手順 4.8.2–4.8.8 で説明されている手順に従います。
8. 染色記録セルの (省略可能)
- 電気生理学的記録次軸索や樹状突起のツリーで biocytin の拡散を許可する酸素のアプライドで 20 分のスライスを維持します。
- 24 ウェル プレートとリン酸バッファー 0.1 M で 1 ml の 4% のパラホルムアルデヒドの 4 ° C で一晩修正の井戸にスライスを配置します。
- 洗ってスライス 4 回、5 分ごとに、1 ml のリン酸バッファー生理食塩水 (PBS)。
- 同じでまあ、permeabilize、室温で 1 時間中に 1 ml の冷たい水の魚の皮 (PBS GT) から 0.25% トリトン X-100 と 0.2% ゼラチンを添加した PBS のスライスを飽和します。
- 1 で希釈した蛍光標識アビジンと一晩インキュベート 400/250-500 μ L の PBS グアテマラで
- 5 回、5 分を洗って各 1 ml の PBS のスライスをマウント。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
マルチプレックス RT-PCR 法の代表的な検証を図 3に示します。プロトコルは、同時に 12 の異なる遺伝子の発現を調べるために設計されました。小胞グルタミン酸トランスポーター vGluT1 は、グルタミン酸作動性ニューロン42の肯定的な制御として取られました。GABA 合成酵素 (GAD65 と歩き 67)、ニューロペプチド Y(NPY)、およびソマトスタチン (SOM) は、gaba 作動性介在ニューロンの3、5,11のマーカーとして使用されました。シクロオキシゲナーゼ 2 酵素 (COX-2) は、錐体細胞のサブ人口3,16のマーカーとして使用されました。
ATP1α1 3 サブユニット na+/K+ atp アーゼおよび ATP 感受性 K+チャンネル Kir6.2 と SUR1 サブユニットは、神経細胞の活動や代謝状態43との関係を評価するため選ばれました。Kir6.2 イントロン少ない遺伝子は、SOM イントロンはゲノム コントロールとして含まれていた。プロトコルは、1 にテストされている約 20 の成績証明書に対応するマウス全脳から抽出した逆転写総 RNA の ng 細胞44。マルチプレックス PCR 生成 12 amplicons 予想されるサイズ (図 3および表 1) の感度およびプロトコルの効率を示します。しなくても、RNA 陰性対照に私アンプリコン (データは示されていない) は出ません。
V 層の錐体細胞は視覚的にその大規模なソーマと著名な樹状によって識別され (図 5 a、挿入)。全細胞記録層ニューロン5,45,46を特にスパイク正規 V、入力抵抗が低く、長期的な活動電位、顕著なスパイクの典型的な電気生理学的特性を明らかにしました。周波数適応 (図 5 a)。このニューロンの分子解析は、vGluT1 の式を明らかにした (図 5 b)、そのグルタミン酸作動性表現型42,46を確認します。このニューロンはソム、ATP1α1、ナ+の 3 サブユニットにも表現される/K+ ATPase。Biocytin ラベル記録されたニューロンの錐体の形態 (図 5) を確認しました。
VGluT1 の式で、2 つ GADs. (図 5) のどちらもグルタミン酸作動性ニューロンから期待どおりに 26 V 層の錐体細胞の分子分析を明らかにしました。介在ニューロンのマーカー稀5,42,46に観察されました。コックス 2、層 II-III の錐体細胞の3,16、によって主に表現は層 V 錐体細胞で検出されませんでした。ATP1α1 と 3 サブユニットであった ATP1α2 サブユニット3よりもより頻繁に観察されました。Kir6.2 と SUR1 サブユニットほとんど上層3,43優遇表現に一貫している V 層錐体細胞に検出された.SOM イントロン (3 のうち 26 セル、すなわち12%) の稀な検出の結果、核を収穫に注意されました。
図 1: 単一セル RT-PCR の専用ボックス。パッチ ・ クランプ後 RT-PCR のため予約資料の一覧です。(1) ホウケイ酸ガラス管、(2) 20 μ L 長い、罰金、柔軟なヒント、(3) 20 μ L ピペット、(4) 自家製の圧搾、(5) 500 μ L の PCR チューブ、(6) 10 μ L エアゾール耐性フィルター ヒント、および (7) 永久的なマーカー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: PCR プライマー設計戦略。(A) コックス 2 遺伝子を含んでいるマウス染色体 2 シーケンスに配置コックス 2 cDNA のコード配列の模式図。エクソンは、ブラック ボックスおよびホワイト ボックスで gDNA をイントロンによって表されます。GDNA にイントロンのシーケンスに対応する cDNA のギャップに注意してください。それぞれ赤と緑の矢として表される、悪い面と良いオリゴヌクレオチドの代表例です。右と左の矢印を示す前方および逆のプライマー。(B) シーケンスは、(A) に示すようにオリゴヌクレオチドの二次構造。左と右のパネルは、それぞれヘアピン自己相補性と自己ダイマー形成を示します。B1オリゴヌクレオチドは、 B2のオリゴヌクレオチドはダイマー形成に対し強いヘアピン自己相補性とダイマー形成の両方を表示します。B3とB4のオリゴヌクレオチドがあるないヘアピン自己相補性とないダイマー形成;彼らはイントロン ・ overspanning (A) であり、潜在的な PCR プライマー (表 1参照) として選択されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: マルチプレックス PCR の検証します。1 ng のマウス脳全体からの総 RNA の逆転写 PCR の拡大の 2 つのラウンド後に受けた。12 の PCR の製品は、別のレーンのHaeIII によって消化 Φx174 と並行して agarose ゲル電気泳動によって解決されました。2 つ目の PCR の製品いたシーケンスによって予測 (bp) のサイズ: 153 (vGluT1)、248 (GAD65)、255 (GAD67)、181 (コックス 2)、220 (NPY)、146 (SOM)、183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2)、128 (ATP1a3)、342 (Kir6.2)、211 (SUR1)、および 182 (SOMint)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 脳スライスのパッチク ランプ-収穫します。セルが視覚的に識別される、記録ピペットは肯定的な圧力とピペットの先端の細胞の残骸汚染を避けるために近づかれます。このニューロンの膜上のえくぼに注意してください。肯定的な圧力は、Gigaohm タイトなシールで携帯接続構成を形成するために中断されます。簡単な吸引は、全細胞の構成に切り替えるに適用されます。録音の最後に、細胞質はピペットにタイトなシールを維持しながら穏やかな否定的な圧力を適用することによって収穫されます。収穫の手順の中には、細胞体の収縮を注意してください。記録ピペットを優しく後続 biocytin 啓示とパッチ ピペットで収穫物の保全のための細胞膜閉鎖を支持する外側をパッチを形成する撤回します。Cauli と Lambolez47から王立化学会から許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: V 層大脳新皮質の錐体細胞のキャラクタリゼーション。(A) 膜の V 層の錐体細胞の潜在的な応答は-100、-40、-10、+60、+120、+500 pA (下部トレース) の現在の脈拍によって誘導されます。ニューロンには、初期の過分極応答 (上部トレース) 後弱い潜在的な偏向が表示されます。閾上の脱分極に対し、ニューロンはゆっくり後過分極 (上側) の開発に長期的な活動電位を放出しました。彩度、近くニューロンが低周波で排出し、顕著な適応 (上部のグレー トレース) を展示します。Inset: V 記録層錐体細胞の赤外線写真です。軟膜表面に上向きです。スケール バー: 20 μ m (B) マルチプレックス RT-PCR による分析 vGluT1、ソム、ATP1α1、および ATP1α3 の式を明らかにします。(C) V の錐体細胞層の 26 のサンプルの遺伝子発現プロファイル。vGluT1 は、GAD65 と GAD67 COX2 が検出されたことがない、すべてのニューロンに表現されました。NPY、SOM、Kir6.2、SUR1、SOM のintが稀に観察されました。錐体細胞は、ATP1α3、ナ+の 1 サブユニットを表明した/K+ atp アーゼとより少ない程度に ATP1α2。(D) 最大強度投影 (A) に記録された biocytin ニューロンの分類を示す共焦点画像の。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 遺伝子/GenBank 数 | 外部のプライマー | サイズ (bp) | 内部のプライマー | サイズ (bp) | ||
| vGlut1 NM_182993 |
意味、-113 | 259 | 意味、-54 | 153 | ||
| GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC | ATTCGCAGCCAACAGGGTCT | |||||
| 対策をした意味、126 | 対策をした意味、79 | |||||
| CCAGCCGACTCCGTTCTAAG | TGGCAAGCAGGGTATGTGAC | |||||
| GAD65 NM_008078 |
意味、99 | 375 | 意味、219 | 248 | ||
| CCAAAAGTTCACGGGCGG | CACCTGCGACCAAAAACCCT | |||||
| 対策をした意味、454 | 対策をした意味、447 | |||||
| TCCTCCAGATTTTGCGGTTG | GATTTTGCGGTTGGTCTGCC | |||||
| GAD67 NM_008077 |
意味、529 | 598 | 意味、801 | 255 | ||
| TACGGGGTTCGCACAGGTC | CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC | |||||
| 対策をした意味、1109 | 対策をした意味、1034 | |||||
| CCCAGGCAGCATCCACAT | AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC | |||||
| コックス 2 NM_011198 |
意味、199 | 268 | 意味、265 | 181 | ||
| CTGAAGCCCACCCCAAACAC | AACAACATCCCCTTCCTGCG | |||||
| 対策をした意味、445 | 対策をした意味、426 | |||||
| CCTTATTTCCCTTCACACCCAT | TGGGAGTTGGGCAGTCATCT | |||||
| NPY NM_023456 |
意味、16 | 294 | 意味、38 | 220 | ||
| CGAATGGGGCTGTGTGGA | CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT | |||||
| 対策をした意味、286 | 対策をした意味、236 | |||||
| AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT | GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA | |||||
| ソム NM_009215 |
理 43 | 208 | 意味、75 | 146 | ||
| ATCGTCCTGGCTTTGGGC | GCCCTCGGACCCCAGACT | |||||
| 対策をした意味、231 | 対策をした意味、203 | |||||
| GCCTCATCTCGTCCTGCTCA | GCAAATCCTCGGGCTCCA | |||||
|
ATP1Α1 NM_144900 |
意味、1287 | 288 | 意味、1329 | 183 | ||
| CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA | TAAGCGGGCAGTAGCGGG | |||||
| 対策をした意味、1556 | 対策をした意味、1492 | |||||
| CCGTGGAGAAGGATGGAGC | AGGTGTTTGGGCTCAGATGC | |||||
| ATP1Α2 NM_178405 |
意味、1392 | 268 | 意味、1430 | 213 | ||
| AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG | AAATCCCCTTCAACTCCACCA | |||||
| 対策をした意味、1640 | 対策をした意味、1623 | |||||
| ACAGAAGCCCAGCACTCGTT | GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC | |||||
| ATP1Α3 NM_144921 |
意味、127 | 216 | 意味、158 | 128 | ||
| CGGAAATACAATACTGACTGCGTG | TGACACACAGTAAAGCCCAGGA | |||||
| 対策をした意味、324 | 対策をした意味、264 | |||||
| GTCATCCTCCGTCCCTGCC | CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA | |||||
| Kir6.2 NM_010602 |
意味、306 | 431 | 意味、339 | 342 | ||
| CGGAGAGGGCACCAATGT | CATCCACTCCTTTTCATCTGCC | |||||
| 対策をした意味、719 | 対策をした意味、663 | |||||
| CACCCACGCCATTCTCCA | TCGGGGCTGGTGGTCTTG | |||||
| SUR1 NM_011510 |
意味、1867 | 385 | 意味、2041 | 211 | ||
| CAGTGTGCCCCCCGAGAG | ATCATCGGAGGCTTCTTCACC | |||||
| 対策をした意味、2231 | 対策をした意味、2231 | |||||
| GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG | GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG | |||||
| SOMint X51468 |
意味、8 | 240 | 意味、16 | 182 | ||
| CTGTCCCCCTTACGAATCCC | CTTACGAATCCCCCAGCCTT | |||||
| 対策をした意味、228 | 対策をした意味、178 | |||||
| CCAGCACCAGGGATAGAGCC | TTGAAAGCCAGGGAGGAACT | |||||
テーブル 1。最初と 2 番目の PCR プライマーの配列。各 PCR プライマーとその系列の位置は、3 ' から 5' 与えられます。ソマトスタチン イントロンを除く 1 の位置は、各遺伝子の開始コドンの一塁に対応します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
単一セルのマルチプレックス RT-PCR によるパッチ ・ クランプすることができます同時にかつ確実にプローブ的識別されたセル5以上 30 遺伝子の発現後。単一細胞レベルの遺伝子発現解析と、非常に効率的な PCR のプライマーが必要です。最も制限の手順の 1 つは、セルの内容のコレクションです。その効率は、セル サイズをマッチングしながら可能な限り大きくする必要がありますパッチ ピペットの先端の径に依存します。1-2 μ m オープン先端径のピペットは、最も神経のタイプに適してする証明されました。携帯電話コンテンツのみを収集するかどうかを確認する重要ですと周囲の組織ではないです。これは生理の収穫の際にタイトなシールの保存を制御することによって実現されます。さらにピペットの離脱時に外をパッチの構成の形成は、細胞の残骸から収穫された細胞質を保護します。調査セルの種類の Mrna の豊かさによって異なりますまたマルチプレックス RT-PCR による単一細胞の成功率。例えば、アストロ サイトは、比較的低い線量3における Mrna を表現で得られる利回りはニューロンで得られたものよりも一般的に低いとサンプル サイズ15,16を増やすことが必要があります。逆に低効率は、チューブ48単一の制限の反応セルのマルチプレックス RT-PCR による転写。したがって、-80 ° c、因数としてそれらを保存して 1 日でのみそれらを使用する最高品質の試薬を使用するが重要です。最後に、RTase の DNA ポリメラーゼ活性はしばしばプライマー二量体形成に見落されたソースです。この問題を解決するには、プライマーとホット スタートを実行するは、増幅効率を向上させる重要です。さらにこれは Taq DNA ポリメラーゼ活性49の RTase の抑制効果を低くなります。
単一のセルの多重 RT-PCR 法は汎用性の高いです。齧歯動物10、11,13,19,20,34,50,51,52 で広く使用されています ,,5354事実上すべての動物モデルと組織と遺伝子配列が利用できる遺伝子に適応することができます。彼らは携帯無料試金の RT-PCR と干渉しない限り、パッチ ・ クランプのさまざまなソリューションを使用できます。例えば K+または Cs+陽イオン、Cl-またはグルコン酸に基づく内部ソリューションは正常に使用される6,36,41,55をされています。
古典的な偽陰性結果はパッチ ピペット フィラメントおよび/または内部パッチ ・ クランプ ソリューションの RNase の混入に由来します。慎重にフィラメントを塩素化し、一般に内部ソリューションを検証するこの問題を解決します。偽陰性結果は、細胞質の割合だけを収穫するので、低い単一セルのレベルで遺伝子を表す場合にも起こります。収穫の品質は全細胞記録の時間を削減しおよび/または大きいピペットを使用して増やすことができます。単一セル20の低レベルで発現すること知られている遺伝子を含めることによって収穫品質を評価できます。偽陽性の結果は、悪い組織の品質、汚染細胞の残骸の量は高と発生します。残骸の存在をテスト、任意のシール ピペット取り外す前に肯定的な圧力を解放ことがなくスライスにパッチ ピペットを挿入して行われます。マルチプレックス RT-PCR 法42無衝突材料の存在の探索します。Silanizing パッチ ピペットは、細胞外の汚染物質56のコレクションを減らすために使用されています。単一セル PCR は二重鎖 DNA57の単一コピーとして同様に少しを検出する非常に敏感な手法です。イントロンのない遺伝子の場合 gDNA を核に含まれる偽陽性を生成できます。この問題を解決するために収穫の助けの間に核からピペットを配置することによって gDNA のコレクションを回避します。GDNA の存在は、イントロン シーケンス25を増幅することによって確実に検出できます。
RT-PCR 法による mRNA 分子の検出 RTase48, 効率が低いためおそらく 10 枚44、信頼性が低くなりにつながることができます、低豊富な成績26,42の検出の下。これはイントロンのない遺伝子の場合問題となることができます。確かに、核の収穫を避けることと、収集できる細胞質の量、したがって検出感度が軽減されます。単一セル PCR 後パッチ ・ クランプ付け biocytin は、細胞の形を可能な限り維持する必要がありますの組み合わせ (図 3)。やむを得ず、これは収集、成功率を減らすことができます材料の量が減少します。コレクション細胞質と細胞形態の保存間の妥協は必須です。
彼らは Cdna がされているかどうかに関する情報を与えるよう、多重の単一セル RT-PCR データが定量的または収集資料には存在しません。ただし、上記検出の制限、ため人口レベルで検出の発生は、遺伝子の単一セルのレベルで豊かさを反映できます。代替的なアプローチを許可するより多くの量的データの生成が主の特定の拡大戦略を (すなわち、相同遺伝子または RT qPCR の相対的な定量化) によって課された技術的な制約の数を制限します。同時にできる遺伝子分析41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,,6465,66。パッチ ・ クランプ記録の単一細胞 RNaseq、パッチ seq30,31, と呼ばれる最近の組み合わせにより、的特徴と細胞の定量的なトランスクリプトーム解析です。新しい有望なアプローチはまだ高速シーケンサーへのアクセスを必要としてデータ生成時間のかかる分析が必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
博士アレクサンドル ・ Mourot は、原稿の彼のコメントを感謝いたします。この作品は、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR 2011 MALZ 003 01; からの補助金によって支えられました。ANR-15-CE16-0010 と ANR-17-CE37-0010-03)、BLG 財団注ぐラ凝ったシュル アルツハイマーから交わりに支えられて。IBPS (フランス ・ パリ) の動物施設に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
| Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
| Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
| BT10 Series - 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
| BT20 Series - 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
| BT200 Series - 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
| BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
| DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
| ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
| EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
| Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
| Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
| Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
| Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
| 5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
| Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
| Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
| PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
| BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
| XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| 10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
| E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |
References
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
- Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
- Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
- Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
- Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Karagiannis, A., et al.
- Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B.
- Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
- Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
- Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
- Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
- Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
- Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
- Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
- Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
- Gallopin, T., et al.
- Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
- Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
- Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
- Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
- Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
- Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
- Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
- Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
- Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
- Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
- Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
- Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
- Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
- Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
- Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
- Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
- McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
- Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
- Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
- Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
- Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
- Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
- Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
- Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
- Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
- Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
- Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
- Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
- Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
- Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
- Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
- Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
- Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
- Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
- Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
- Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
- Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
- Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).
