Summary
이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.
Abstract
대뇌 피 질은 수많은 종류의 세포 다양 한 형태, 생리, 및 분자 기능을 전시로 구성. 이 다양성에는 쉽게 식별 하 고 이러한 세포 유형, 그들의 특정 기능을 공부 하는 전제의 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문서에서는 다중 단일 셀 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 프로토콜을, 패치 클램프 조각, 기록 후 허용 하는 단일 셀에 유전자의 수만의 표현을 동시에 감지 하는 설명 합니다. 이 간단한 방법 형태학 상 특성을 구현할 수 있다 고 널리 혈관 주변 등 다양 한 세포 유형 및 그들의 특정 세포 환경 phenotypic 특성 결정에 적용 됩니다. 이 프로토콜의 원리 기록 하 패치 클램프 기술 수확 및 역방향 셀의 세포질 내용 녹음 이며 질적으로 감지 하 여 유전자의 미리 정의 된 집합의 표현 다중 PCR. PCR 뇌관 및 RT-PCR과 호환 세포내 패치 클램프 솔루션의 설계를 필요합니다. 선택적이 고 신뢰할 수 있는 증명서를 위해 탐지,이 기술은 또한 증폭 단계에 수확 하는 세포질에서 적절 한 컨트롤을 필요 합니다. 여기서 설명 하는 조치를 엄격 하 게 따라야 합니다, 하지만 거의 모든 electrophysiological 실험실 다중 단일 셀 RT-PCR 기법을 사용할 수 있습니다.
Introduction
대뇌 피 질에는 다양 한 생리 적 프로세스에 관련 된 수많은 셀 형식을 구성 되어 있습니다. 그들의 식별 및 특성화, 그들의 특정 기능에 대 한 이해를 전제 조건 매우 도전 수 대뇌 피 질의 세포 유형1 특징 큰 형태, 생리, 및 분자 다양성 부여 2,,34.
단일 셀 다중 RT-PCR 패치 클램프와 RT-PCR 기술의 결합을 기반으로 합니다. 그것은 동시에 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 미리 정의 된 유전자의 표정을 프로브 수 있습니다. 기록 피 펫 추가에 신경 추적 프로그램의 포함 허용 조직화 학적인 계시6,7,,89, 후 기록 된 세포의 형태학 특성 10. 그것은 그들의 phenotypic 특성5,,910,11,12의 복수 변수 분석에 따라 신경 유형의 분류에 대 한 매우 유용한 기술입니다 ,,1314. 단일 셀 멀티플렉스 RT-PCR은 또한 이다15,,1617, 같은 비 신경 세포의 특성에 적합 하 고 거의 모든 뇌 구조18에 적용 될 수 있습니다. 19,20,21,22,23 및 셀 유형, 가정 그들은 전체 셀 구성에 기록 될 수 있습니다.
이 기술은 세포 소스의 식별 및 전송 시스템7,8,15,,1620,21, 목표에 대 한 매우 편리 하다 24,25,26,,2728, 특정 항 체 부족 하는 경우에 특히. 그것은 시각적으로 식별 된 셀29, 패치 클램프 기록에 의존 하며 따라서 또한 특정 세포 환경8,,1516셀을 대상으로 수 있습니다. 또한 뇌 조직의 cytoarchitecture 두뇌 분할 영역에 유지 됩니다, 이후이 방법은 또한 수 있습니다 신경 및 비 신경 요소7,8 특징이 세포의 해부학 적 관계의 연구를 , 18.
이 기술은 수확된 세포질의 크기와 RT의 효율에 의해 제한 된 있기 때문에, 낮은 복사 번호에서 표현 하는 mRNA의 검출은 어려울 수 있습니다. RNaseq 기술에 따라 다른 접근 분석 하는 단 세포3,4,,3031, 전체 transcriptome 있게 비록 그들은 반드시 높은 처리량 비싼 시퀀서 필요 모든 실험실을 사용할 수 있습니다. 단일 셀 다중 실시간 PCR 기술을 사용 하므로 끝점 PCR, 그것만 널리 thermocyclers를 요구 한다. 그것은 실험실을 갖춘 electrophysiological 설정에서 쉽게 개발 될 수 있다 하 고 비싼 장비가 필요 하지 않습니다. 그것은 제공할 수 있습니다, 어느 날, 내 유전자의 미리 정의 된 집합의 식에 대 한 질적 분석. 따라서,이 방법은 신속한 방식으로 단일 세포의 분자 특성에 대 한 쉬운 액세스를 제공합니다.
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Protocol
동물을 사용 하 여 모든 실험 절차 프랑스 규정 (코드 농촌 R214/87 R214/130)에 따라에서 수행 했다 및 유럽 경제 공동체 (86/609/EEC) 및 프랑스 국가 헌장의 윤리 지침을 준수 동물 실험의 윤리. 모든 프로토콜 찰스 다윈 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 교육 및 연구 (승인 2015 061011367540)의 프랑스 정부에 제출 했다. IBPS 동물 시설 (A75-05-24) 프랑스 당국에 의해 공인 됩니다.
1. 예비 고려 사항
참고: 오염을 방지 하려면 패치 클램프 후 사업 단일 셀 RT-PCR 하기 전에 다음 권장 사항을 따릅니다.
- 그들은 오염의 실험실의 유전자를 포함 하는 플라스 미드를 사용 하지 마십시오.
- 젤 전기 이동 법 방 PCRs 준비에서 실험실 벤치를 보유 합니다.
- 펫 및에 어로 졸 방지 필터 팁 1 ng / µ L 보다 낮은 농도에서 DNA와 RNA를 조작의 집합을 칩니다. PCR 제품 분석을이 사용 하지 마십시오.
- 항상 RNase DNase 무료 제품을 사용 하 고 장갑을 착용.
- 내부 패치 클램프 솔루션을 준비 하기 위한 전용된 화학 물질을 사용 합니다. 주걱을 사용 하지 않습니다 하지만 오히려 종이 분말 무게를 무게.
- 전용된 pH 전극 및 pH 표준 솔루션을 사용 하 여로 그들은 (예를 들어, RNase) 오염의 원천이 될 수 있습니다.
- 스토어 붕 규 산 유리 모 세관; 20 µ L, 괜 찮 아 요 길고 유연한 팁; 20 µ L micropipette; 집에서 만든 착 유기 (패치 클램프 피 펫 홀더 10 mL 주사기에 부착 된); 500 µ L PCR 튜브; 10 µ L에 어로 졸 방지 필터 팁; 그리고 전용된 상자 (그림 1)에서 영구 마커를 얇은.
2. 뇌관 디자인
참고: 다중 RT-PCR 증폭의 두 단계에 의존합니다. 첫 번째 PCR 동안 관심의 모든 유전자는 모든 PCR 뇌관을 함께 혼합 하 여 공동 증폭 된다. 안정적으로 단일 세포에서 성적 검색, 효율적이 고 선택적 PCR 뇌관 디자인 필수적 이다. PCR의 두 번째 라운드에 대 한 중첩 된 (내부) 프라이 머를 사용 하 여 특이성 및 증폭의 효율을 향상 시킵니다.
- NCBI 참고 순서 데이터베이스32 의 유전자로 그들의 관련된 가족 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)의 그의 큐레이터 mRNA 시퀀스를 검색 합니다.
- 쿼리는 gene(s)와 관심의 종의 이름을 입력 하 고 검색된 관련 시퀀스를 클릭 하십시오.
- 코딩 시퀀스는 gene(s)의 분석을 제한 하려면 (오른쪽 상단), 보내기 를 클릭 하 고 형식으로 코딩 시퀀스 및 FASTA 뉴클레오티드 를 선택 합니다. 다음 파일 만들기 를 클릭 하 고 ".nt" 파일 확장명을 사용 하 여 FASTA 시퀀스를 저장.
- 잉 꼬 소프트웨어33 (여러 맞춤 건설 및 분석 워크 벤치) 또는 다른 여러 맞춤 소프트웨어를 사용 하 여 상 동 영역을 결정 하.
- 파일을 클릭 | 새 프로젝트... 고 DNA 시퀀스 유형을 선택 합니다. 유전자 시퀀스를 가져오려면 시퀀스를 선택 하십시오 | 가져올 시퀀스... 고 ".nt" 파일을 로드 합니다. 모든 관련된 시퀀스에 대 한 절차를 반복 합니다.
- 클릭 하 고 전체 시퀀스를 선택 하 구조 창에서 모든 시퀀스를 드래그.
- 상 동 지역 맞춤을 선택 하 여 검색 | 블록에 대 한 검색... (CTRL + S)입니다. 검색 방법에 세그먼트 쌍 중복 을 선택 합니다. Pairwise 점수 구분을 상대적으로 높은 값 (예:1000) 조정 및 정렬 하 고 시작클릭 시퀀스의 총 수를 블록 당 분 seqs. .
- 나타나는 검색 결과 창에서 가장 높은 MP 점수 결과 선택 하 고 링크를 클릭 하십시오. 결과가 없으면 감소 Pairwise 점수 구분 및 블록 당 분 seqs..
- 동종 지역의 시각화를 촉진 하기 위하여 맞춤 선택 | 음영 | 점수를 의미.
- 시퀀스의 연결 되지 않은 부품을 선택 하 고 잠재적으로 낮은 MP 점수와 상 동의 다른 영역을 결정 하는 단계 2.2.3–2.2.4 반복.
- 가장 구체적인 뇌관을 얻기 위해 최소한 순서 상 동 영역을 선택 합니다.
- 모든 결합 이체의 시퀀스를 가져올 고 2.2.1–2.2.6 단계를 반복 합니다. 전반적인 탐지에 대 한 그들의 일반적인 영역을 선택 합니다. 전용된 스플라이스 변종 분석20,,3435,36대체 카세트를 고려 하십시오.
- (Https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 유전자의 intron exon 구조를 결정 하 폭발37 게놈 (기본적인 현지 줄 맞춤 검색 도구)를 사용 하 여 동물 모델 게놈에 mRNA 순서를 정렬 합니다.
- 마우스 를 클릭 하 여 폭발 마우스 게놈을 선택 하 고 쿼리 시퀀스 입력 섹션에서 검색된 FASTA 시퀀스를 업로드. 프로그램 선택에서 선택 에 대 한 최적화 매우 비슷한 시퀀스 (megablast), 클릭 폭발 버튼.
- 설명 섹션에서 가장 높은 Id와 맞춤 선택 (최대 100%까지). 정렬 섹션의 기능 에서 그것은 관심사의 유전자에 해당 한다는 것을 확인 하십시오.
- 쿼리 시작 위치 같은 섹션 코딩 시퀀스의 exons 승계를 의해 정렬을 정렬 합니다. 쿼리 순서 (그림 2A)에 introns의 위치에 해당 약 모든 안타의 시작 및 끝 위치 note
- 크기 기준 (그림 2)에 따라 게놈 DNA (gDNA) 증폭에서 cDNA를 쉽게 차별화 하는 의미와 antisense 뇌관에 대 한 두 개의 다른 exons를 선택 합니다.
참고: gDNA 증폭 발생할 수 있습니다 낮은 주파수에서 핵 세포질과 수확 이다. 따라서, intron 뇌관 쌍 (그림 2A) overspanning 디자인에 필수적 이다. Intron 없는 유전자의 경우 핵의 컬렉션은 문제가 잠재적으로 결과 혼동으로 이어질 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 증폭 intronic 시퀀스 gDNA25의 존재에 대 한 조사를 목적으로 하는 뇌관의 집합을 포함 합니다. 게놈 제어 긍정적인 경우에, 모든 intron 없는 유전자에 대 한 결과 무시 해야 합니다. - 효율적인 증폭을 달성, 뇌관 200 그리고 400의 기본적인 쌍 (그림 2) 사이의 이상적으로 구성 된 길이 amplicons 생성을 선택 합니다.
- 멀티플렉스 PCR 단계에서 동시에 다양 한 cDNAs를 증폭, 55와 60 ° C 사이 18의 그리고 24 뉴클레오티드와 녹는 온도 (Tm) 사이의 길이가 뇌관 디자인
- 증폭 수확량 감소, 2 차 구조 형성을 최소화와 최소한의 머리 핀과 이중 길이 (그림 2B)와 반대로 감각 뇌관을 선택 합니다.
- 동일한 기준 (2.5-2.8 단계)를 사용 하 여 내부 뇌관 디자인.
- 뉴클레오티드 폭발을 사용 하 여 관심사의 유기 체의 참조 RNA 시퀀스 데이터베이스에 뇌관을 정렬 하 여 PCR 뇌관의 특이성을 확인 합니다.
- 폭발 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 뉴클레오티드 폭발에클릭 합니다. 입력 쿼리 시퀀스에 뇌관의 순서를 붙여 넣습니다.
- 선택 검색 설정 섹션에서 클릭 다른 사람 (nr 등), 데이터베이스 옵션에서 참조 RNA 시퀀스 (refseq_rna)를 선택 하 고 유기 체 (예, 생쥐 (taxid:10090) 지정 )를 원하는 종에 분석을 제한.
- 프로그램 선택 에 대 한 최적화 다소 비슷한 시퀀스 (blastn)을선택 합니다. 알고리즘 매개 변수 섹션에서 7 안타를 얻을 수 있는 기회를 증가 하기 위하여 아래로 단어 크기 를 줄입니다.
- 선택적 뇌관 디자인, 그 시퀀스는 가능 하면 원치 않는 cDNAs 적어도 3 불일치 들만 계속 합니다.
- 모든 외부 뇌관 수 1 µ M의 최종 농도에 함께 혼합 될 수 있도록 상대적으로 높은 농도 (예를 들어, 200 µ M)에서 desalted 뇌관을 주문.
3입니다. RT 시 약의 준비
- 5 실시간 믹스 x: RT 믹스 솔루션 (5 배) 25 µ M에서 임의의 뇌관 및 dNTPs 2.5 m m에서 포함 된 일의 400 µ L RNase 무료 물에 준비. 이 작업 혼합 500 µ L 튜브에서 20 µ L aliquots로 저장 합니다.
- 20 x Dithiothreitol (DTT): 물 0.2 M RNase 무료 DTT의 1 mL를 준비 하 고 50 µ L aliquots로 저장.
- RNase 억제제 (40 U / µ L)의 2500 U 및 역전사 (RTase, 200 U / µ L)의 10000 U 5 µ L aliquots로 저장 합니다.
- RT 시 약의 최적의 품질을 보장 하려면 저장-80 ° c.에 aliquots 최대 10 셀과 1 일에만 사용 합니다.
4. PCR 유효성 검사
- 관심의 구조에서 상대적으로 많은 양의 총 RNA (일반적으로 1 µ g) 추출38 에 반전 녹음 방송 함으로써 cDNAs를 준비 합니다.
- 이러한 예비 단계에 대 한 셀 RT-PCR을 단일 하지만 RNase 무료 펫을 사용 하 여 전용된 펫을 사용 하지 마십시오. 1 µ g / µ L까지 총 RNA를 희석.
- 500 µ L PCR 튜브에 희석된 총 RNA의 1 µ L과 RNase 무료 물 8 µ L를 추가 합니다. 1 분 동안 95 ° C에서 변성 하 고 얼음에 튜브 아래로 냉각.
- 제조업체에서 제공 하는 실시간 5 x 버퍼의 4 µ L, RT 믹스 솔루션의 4 µ L, RTase의 1 µ L, 1 µ L의 RNase 억제제, 200mm DTT의 1 µ L 추가 (섹션 3 참조).
- 튜브 영화, 스핀, 그리고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 몇 년까지-80 ° C에서 cDNAs를 저장 합니다. 총 RNAs 등가물의 µ 1 ng/L 희석 cDNAs의 약 수를 준비 합니다.
- 혼합 및 단일 셀 RT-PCR 전용 펫으로 1 µ M에서 각 뇌관 쌍을 희석. 각 뇌관 믹스의 20 µ L를 사용 하 여 100 µ L PCRs에.
- 얼음, 준비 뇌관 쌍 각 포함 하는 프리 믹스: 물 (q.s., 80 µ L), 버퍼, 100 x dNTPs (50 µ M 각), 500-1, 000의 cDNA의 pg 1 ng / µ L에서 희석 1 µ L 및 Taq 중 합 효소의 0.5 µ L (2.5 U, 5 U / µ L) X 10의 10 µ L.
- PCR 기계는 최적의 온도 제어에 대 한의 우물을 밀접 하 게 맞는 PCR 튜브를 사용 합니다. 벽 또는 PCR 튜브의 뚜껑을 건드리지 않고 미네랄 오일은 섞은 2 방울 (~ 100 µ L)을 추가 합니다.
- 뇌관 이합체의 형성을 최소화 하기 위해 미리 95 ° c.에가 열 thermocycler에 PCR 튜브를 배치 하 여 뜨거운 시작 수행 30 후 s, 신속 하 게 기름 위에 뇌관 믹스의 20 µ L를 추방.
- 95 ° C에서 3 분, 후 40 주기 실행 (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) 5 분 동안 72 ° C에서 최종 신장 단계 뒤.
- Agarose 젤 전기 이동 법 (2%, 무게/볼륨)3910 µ L 각 PCR 제품의 분석. 일부 PCR 제품에는 예상 되는 크기가 없다면 다시 다른 뇌관 (섹션 2 참조) 디자인.
주의: Ethidium 평범한 사람은 DNA 변이 일으킬 수 있는 intercalating 화학. 그것을 사용 하기 전에 현지 안전 사무실을 참조 하십시오. 그것을 조작 하는 경우 항상 장갑을 착용 하십시오. 파우더 대신 ethidium 평범한 사람 (10mg/mL) 솔루션의 상용 솔루션을 사용 하 여 흡입의 위험을 최소화 하기 위해. 마찬가지로, UV 빛 해로울 수 있다, 그래서 UV 보호 안전 안경이 나 마스크를 확인. 더럽혀진된 젤, 팁, 장갑, 그리고 버퍼 브로민 폐기물 전용 용기에 철회. - 일단 모든 뇌관 쌍 개별적으로 검증 된, 다중 프로토콜 (그림 3)를 테스트 합니다.
- 혼합 하 고 1 µ M.가 게에서 몇 주까지-20 ° C에서 멀티플렉스 뇌관 혼합 함께 모든 외부 뇌관을 희석.
- 얼음, 포함 하는 프리 믹스 준비: 물 (q.s., 80 µ L), 버퍼, 100 x dNTPs (각 50 µ M)의 1 µ L, 500-1000 1 ng / µ L, 및 0.5 µ L (2.5 U, 5 U / µ L) Taq 중 합 효소의 희석 cDNAs의 X 10의 10 µ L.
- PCR 튜브 영화, 스핀, 고 미네랄 오일 두 방울 (~ 100 µ L)를 추가 합니다.
- 멀티플렉스 뇌관 혼합의 20 µ L와 4.5 단계에서 설명한 대로 뜨거운 시작을 수행 합니다. 95 ° C에서 3 분, 후 20 PCR 주기 단계 4.6의 동일을 실행 합니다.
- PCR 튜브를 분석 하는 유전자의 번호와 동일한 번호를 준비 합니다. 준비 단계 4.8.2, 하지만 첫 번째 PCR 제품 유전자 당 1 µ L를 사용 하 여 서식 파일로 같이 섞은. 유전자를 분석 하 고 여분의 볼륨의 10%를 사용 하 여 pipetting 오류에 대 한 보상의 수에 따라 모든 볼륨을 조정 합니다.
- 부드럽게 흔들어 하, 튜브를 회전, 각 PCR 튜브에 프리 믹스의 80 µ L를 파견 하 고 벽 또는 튜브의 뚜껑을 건드리지 않고 튜브 당 미네랄 오일 두 방울 (~ 100 µ L)를 추가 합니다.
- 뜨거운 수행 (단계 4.5 참조) 시작 내부 뇌관 믹스의 추방 20 µ L에 의해 단계 4.2에서에서 준비. 35 PCR 주기 단계 4.6 동일을 실행 합니다.
- Agarose 젤 전기 이동 법에 의해 두 번째 PCR 제품을 분석. 모든 두 번째 PCR의 예상된 크기는 amplicon 생성 되었는지 확인 합니다. 비효율적 이거나 일반적인 확대의 경우 다시 새로운 뇌관 (단계 2.5-2.12) 디자인과 (4.2-4.8 단계) 확인.
5. 준비 및 세포내 패치 클램프 솔루션의 유효성 검사
참고: 다음 프로토콜 설명 준비 K+/gluconate의 유효성 검사를 기반으로 내부 솔루션, 하지만 거의 모든 유형의 패치 클램프 솔루션으로 RT-PCR의 효율을 방해 하지 않습니다 사용할 수 있습니다. 장갑을 끼고 RNase 무료 내부 솔루션을 얻기 위해 필수입니다.
- 내부 패치 클램프 기록 솔루션의 60 ml, 0.1 M 코의 임기 10 mL를 준비 합니다.
- 0.9 ml의 0.1 M 코 EGTA (최종 0.5 m m)의 11.4 mg을 디졸브.
- RNase 무료 40 mL 물 더하고 2.02 g K-글 루 콘 산 (144 m m 최종), HEPES (최종 10 mM)의 143 mg와 1 M MgCl2 (최종 3 m m)의 180 µ L의 분해.
- 0.1 M 코의 ~ 6 mL을 추가 하 여 7.2에 pH를 조정 합니다.
- RNase 무료 물 ~ 13 mL와 295 mOsm osmolarity를 조정 합니다.
- 내부 솔루션은 또한 반전 녹음 방송에 대 한 버퍼 사용 됩니다, 신중 하 게 Mg2 + 농도 제어 합니다. MgCl2 RT 반응에서 2 mM의 최종 농도 도달 하는 나중에 추가 하 여 내부 솔루션에서 낮은 Mg2 + 농도 대 한 보상.
- 패치 클램프 기록 후 수확된 셀을, 2-5 mg/mL의 RNase 무료 biocytin (단계 5.1-5.5) 위에서 설명한 내부 솔루션을 추가 합니다.
- 및 필터링 (0.22 μ m 기 공 크기) 내부 솔루션으로 100-250 µ L aliquots-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
- 단일 셀 RT-PCR를 위한 내부 솔루션을 사용 하 여 유효성을 검사 하려면 패치 클램프 솔루션의 6 µ L 1 ng / µ L에 희석 총 RNAs의 0.5 µ L을 추가 하 고 약 30 분 동안 벤치에 두고.
- 2 µ L micropipette 추가 실시간 믹스, 20 x DDT의 0.5 µ L, 0.5 µ L RNase 억제제, 및 0.5 µ L x 5의 2 µ L RTase, 37 ° c.에서 밤새 품 어 고
- 튜브를 회전 합니다. 얼음에서 물 (q.s., 80 µ L), 버퍼, X 10의 10 µ L 및 Taq 중 합 효소의 0.5 µ L (2.5 U, 5 U / µ L)를 추가 합니다.
- 유효성이 검사 된 뇌관 (단계 4.4-4.6)의 집합을 사용 하 여 PCR의 40 주기 수행 합니다.
- Agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR 제품 분석 (단계 4.7 참조) 들은 예상된 크기를 확인 합니다.
참고: 총 RNA의 0.5 µ L를 생략 하 고 0.5 µ L RNase 무료 물으로 교체 내부 솔루션은 무료로 RNA 또는 DNA 오염 하는 것을 보증할 것 이다.
6. 급성 슬라이스 준비
참고:이 프로토콜 (즉, 보다 적은 28 산 후 일) 청소년에 대 한 조각화 절차 설명 남성 및 여성 쥐. 자당 기반 인공 뇌 척추 액체 (실제) 같은 다른 절단 솔루션을 사용할 수40있습니다.
- 2 L 125 NaCl, 2.5 (mM)에 포함 된 실제의 준비 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1.25 NaH2포4, 26 NaHCO3, 10 포도 당 및 자당 15. 조각 준비 하는 동안 glutamatergic 활동을 줄이기 위해, kynurenic 산의 1 mM를 추가 하 여 절단 솔루션을 준비 합니다.
- 슬 라이 싱, 전에 수술가 위, 괜 찮 아 요 아이리스가 위, 2 개의 주걱, 집게, 종이 필터, cyanoacrylate 접착제의 디스크를 포함 하는 해 부 키트를 준비 합니다.
- O2/CO2 (95% / 5%),-20 ° c.에 절단 챔버 다운 멋진 포화 얼음 절단 솔루션을 사용 하 여
- 작은 종이 타월 isoflurane 젖 었 마우스를 anesthetize. ~ 2 분 후 마우스는 깊은 마 취 발 핀치에 응답의 부재를 확인 하 여 있는지 확인 합니다.
- 신속 하 게 마우스를 목을 벨. 두 피를 제거 하 고 두개골을 엽니다. 신중 하 게 두뇌를 추출 하 고 얼음 추위 (~ 4 ° C) 절단 솔루션 O2/CO2산소 가득한 작은 비 커에 그것을 배치.
- -20 ° C 조건에서 절단 챔버를 제거 하 고 종이 타월로 수 분을 제거.
- 조심 스럽게 관심 영역 분리, 절단 챔버에 접착제 얼음 절단 솔루션 O2/CO2산소를 추가 하는 두뇌를 해 부.
- 300 µ m 두께 슬라이스는 vibratome를 사용 하 여 잘라. 산소 절단 솔루션으로 가득 휴식 실에서 실내 온도에 그들을 전송 하 고 0.5 h 이상에 대 한 복구 하도록 허용.
7. 단일 셀 RT-PCR 패치 클램프 기록 후
- 30% H2O2 솔루션의 관류 시스템 ~ 100 mL을 정기적으로 청소 하 고 그것이 RNase 오염 간과 소스 ~ 500 mL 증류수 박테리아 성장을 피하기 위해 광범위 하 게 린스.
- 수확 매일 집중된 표 백제로 가득 패치 피 펫으로는 필 라 멘 트 인터네셔널. 작성 패치 피펫으로 하지만 오히려 20 µ L 긴, 괜 찮 아 요, 유연한 팁 1 mL 주사기에 부착 하는 micropipette를 사용 하지 마십시오. 그리고, 광범위 하 게 RNase 무료 물으로 그것을 씻어 가스 살포 건조 합니다.
- RT-20 x DTT aliquots과 x 5를 포함 하는 얼음의 작은 상자를 준비 합니다. 벤치탑 쿨러에-20 ° C에서 RTase 및 RNase 억제 물 aliquots를 저장 합니다.
- 1-2 mL/min와 산소 실제에 끼얹는다 녹음 실에는 슬라이스를 전송 합니다.
- 장갑을 착용 하는 동안 붕 규 산 유리에서 패치 펫 (1-2 µ m 오픈 팁 직경, 3-5 m ω)을 당겨 하 고 내부 솔루션의 8 μ 채워 그들 중 하나. 피 펫 끌어당기는 사람 손잡이 RNase 오염 소스는 명심에서 하십시오.
- 새로운 장갑 착용 하 고 손가락으로 필 라 멘 트를 안 만질 동안 피펫으로 피 펫 홀더에 놓습니다.
- 긍정적인 압력 패치 피 펫을 접근 하 고 타겟된 셀 (그림 4) 특성에 기록 하는 전체 셀을 수행.
- mRNAs를 보존 하기 위해 20 분41. 로 전체 셀 구성에 시간을 제한
- 녹음의 끝에, 2 가득 500 µ L PCR 튜브 준비 RT 믹스 x 5의 µ L 20의 0.5 µ L x DTT, 스핀, 그리고 얼음에 저장.
- 부드러운 부정적인 압력 (그림 4)을 적용 하 여 셀 세포질을 수확. 시각적으로 컨트롤 셀의 콘텐츠는 단단한 물개를 유지 하면서 피펫으로 안에 온다.
- 가능한 경우 일부 intron 없는 유전자로 간주 됩니다 핵을 수집 하지 마십시오. 이런 경우에서 항상 게놈 오염 조사 하 gDNA를 증폭 하기 위한 뇌관의 집합을 포함 합니다.
- 핵은 피 펫의 끝 가까이 오고 있다, 부정적인 압력을 놓고 이동 핵에서 피 펫. 단단한 물개 유지 되는 것을 확인 하 고 새로운 피 펫 위치에 세포질 수집 하.
- 수확 때 아니 더 많은 자료 및 단단한 물개를 잃기 전에 중지 합니다.
- Extracellular 파편 (그림 4)에 의해 오염 제한 하 고 후속 조직화 학적인 분석에 대 한 세포 막의 폐쇄를 선호 하는 외부 아웃 패치를 부드럽게 피 펫을 철회 한다.
- 마음에 계속 그 손잡이, micromanipulators, 컴퓨터 키보드, 또는 컴퓨터 마우스 RNase 오염의 잠재적인 소스입니다. 만약 그들이 온전히 기록 하는 동안, 장갑 변경 합니다.
- 착 유기를 피펫으로 부착 하 고 긍정적인 압력 (그림 1)을 적용 하 여 PCR 튜브에 자사의 콘텐츠를 추방.
- 콘텐츠 컬렉션에 있도록 PCR 튜브에는 피 펫의 끝을 휴식.
- 짧게 원심 튜브, RNase 억제제의 0.5 µ L와 0.5 µ L RTase의 추가, 부드럽게 혼합, 다시, 원심 및 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 튜브를 회전 하 고 PCR 분석까지 몇 개월-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
- 물 (q.s., 80 µ L), 10 µ L 10 x 버퍼의 Taq 중 합 효소의 0.5 µ L (2.5 U)를 추가 하 여 실시간 제품의 ~ 10 µ L를 포함 하는 관에서 직접 첫 번째 증폭 단계를 수행 합니다. 그런 다음 단계 4.8.2–4.8.8에 설명 된 지침을 따르십시오.
8. 조직화 학적인 얼룩 기록 된 셀의 (옵션)
- Electrophysiological 녹음 따라 axonal 수지상 나무에서 biocytin의 보급 수 있도록 산소 실제에 20 분에 대 한 슬라이스를 유지 합니다.
- 24-잘 접시와 수정 그것은 하룻밤 사이 4 %paraformaldehyde 1 mL와 4 ° C에서 0.1 m에서 인산 염 버퍼의 우물에는 슬라이스를 놓습니다.
- 씻어 슬라이스 4 번, 각, 5 분 1 mL 인산 Buffered 식 염 수 (PBS)와 함께.
- 같은 음, permeabilize 하 고 실 온에서 1 h 동안 냉 수 물고기 피부 (PBS-GT)에서 0.25% 트라이 톤 X-100 및 0.2% 젤라틴으로 보충 하는 PBS의 1 mL는 슬라이스 포화.
- 1 희석 붙일 레이블된 avidin와 밤새 품 어/400에 250-500 µ L의 PBS-gt는.
- 씻어 5 시간, 5 분 각각 1 mL PBS의 슬라이스를 탑재.
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Representative Results
멀티플렉스 RT-PCR의 대표 유효성 검사는 그림 3에 표시 됩니다. 프로토콜은 12 다른 유전자의 표현을 동시에 조사 하도록 설계 되었습니다. 기공을 글루타민 산 염 운송업 자 vGluT1 glutamatergic 신경42에 대 한 긍정적인 제어로 찍은. GABA 합성 효소 (GAD65와 갓 67), Neuropeptide Y (NPY), 및 Somatostatin (SOM) GABAergic 수3,,511의 표식으로 사용 되었다. Cyclooxygenase 2 효소 (COX-2) 피라미드 셀 하위 인구3,16의 표식으로 사용 되었다.
ATP1α1-3 소 단위 나+의 /K+ ATPase 그리고 Kir6.2 및 SUR1 하는 소 단위 ATP에 민감한 K+ 채널의 신경 활동과 신진 대사 국가43의 관계를 평가 하기 위해 선정 됐다. Kir6.2 intron 덜 유전자 이기 때문에, 솜 intron 게놈 제어로 포함 되었다. 프로토콜 1에서 테스트 되었습니다 약 20의 증명서에 해당 하는 마우스 전체 뇌에서 추출 반전 베낀된 총 RNA의 ng 세포44. 멀티플렉스 PCR 생산 예상된 크기 (그림 3 및 표 1)의 12 amplicons 감도 프로토콜의 효율성을 보여주는. RNA 없이 부정적인 제어 생산 없음 amplicon (데이터 표시 되지 않음).
레이어 V 피라미드 뉴런의 큰 소마와 저명한 꼭대기 모 수석으로 시각적으로 확인 되었다 (그림 5A, 삽입). 전체 세포 기록 공개 레이어 V 일반 신경5,,4546 , 특히 급상승, 낮은 입력된 저항, 긴-지속적인 활동 전위, 그리고 발음된 스파이크의 전형적인 electrophysiological 속성 주파수 적응 (그림 5A)입니다. 이 신경의 분자 분석 공개 vGluT1의 표현 (그림 5B), 그것의 glutamatergic 표현 형42,46확인. 이 신경은 또한 솜, ATP1α1, 및 Na+의 3 소 단위 표현 /K+ ATPase. Biocytin 라벨 기록 된 뉴런의 피라미드 형태 (그림 5D) 확인.
VGluT1의 표현 하지만 두 GADs (그림 5C). 의 26 층 V 피라미드 세포의 분자 분석 공개 glutamatergic 뉴런에서 예상 대로 수의 마커 거의5,,4246을 관찰 했다. 콕스-2, 레이어 II-III 피라미드 세포3,16에 의해 주로 표현 하지 레이어 V 피라미드 세포에서 발견 되었다. ATP1α1와 3 소 단위 ATP1α2 소 단위3보다 더 자주 관찰 했다. Kir6.2 및 SUR1 소 단위 했다는 상층3,43식 그들의 특혜와 일치 하는 레이어 V 피라미드 뉴런에서 거의 감지 됩니다. 주의 했다 핵, 솜 introns (26의 3 셀, 즉, 12%)의 드문 탐지 결과 수확을 하지.
그림 1: 단일 셀 RT-PCR 전용된 상자. 패치 클램프 후 RT-PCR를 위해 예약 된 자료의 목록입니다. (1) 붕 규 산 유리 모 세관, 긴 (2) 20 µ L, 괜 찮 아 요, 유연한 팁, (3) 20 µ L micropipette, 착 유기 (4) 집에서 만든, (5) 500 µ L PCR 튜브, (6) 10 µ L에 어로 졸 방지 필터 팁, 그리고 (7) 영구 마커 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: PCR 뇌관 디자인 전략. (A) 콕스 2 유전자를 포함 하는 마우스 염색체 2 시퀀스에 콕스 2 cDNA의 코딩 시퀀스의 도식 적인 표현입니다. Exons 블랙 박스와 introns gDNA 흰색 상자에 표시 됩니다. GDNA에 intronic 시퀀스에 해당 하는 cDNA에서 간격 note 빨간색과 녹색 화살표로 각각 표현 하는 나쁜 및 좋은 oligonucleotides의 대표적인 예. 오른쪽 및 왼쪽 화살표는 앞으로 역 뇌관을 나타냅니다. 시퀀스 (B) 및 (A) 에서처럼 oligonucleotides의 보조 구조 왼쪽 및 오른쪽 패널 헤어핀 complementarity 자기와 자기-이합체 형성을, 각각 나타냅니다. B1 oligonucleotide 반면 B2 oligonucleotide 이합체 형성만 두는 강한 머리 핀 자체 complementarity 고 이합체 형성을 표시 합니다. B 3 과 b 4 oligonucleotides 없는 머리 핀 자체 complementarity 있고 전혀 이합체 형성; 그들은 intron overspanning (A) 하 고 잠재적인 PCR 뇌관 ( 표 1참조)으로 선정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 다중 PCR의 유효성 검사. 1 마우스 뇌에서 총 RNA의 ng PCR 확대의 2 라운드 뒤 반전 녹음 방송에 복종 되었다. 12 PCR 제품 병행 해III에 의해 소화 Φx174 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 별도 차선에서 해결 했다. 두 번째 PCR 제품 크기 (bp)는 시퀀스에 의해 예측 했다: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (콕스 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir6.2), 211 (SUR1), 및 182 (솜int). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 두뇌 조각에서 수확 하는 패치 클램프. 셀을 시각적으로 확인 한 기록 피 펫은 피 펫의 끝에 세포 파편 오염을 방지 하기 위해 긍정적인 압력 접근 이다. 이 신경의 막에 보조 개 note 긍정적인 압력은 다음 셀 연결 구성 Gigaohm 단단한 물개를 형성 하기 위하여 중단 된다. 짧은 suctions는 전체 셀 구성 전환에 적용 됩니다. 녹음의 끝에, 세포질은 피펫으로에 단단한 물개를 유지 하면서 부드러운 부정적인 압력을 적용 하 여 수확 합니다. 수확 동안 세포 체의 수축 note. 기록 피 펫은 다음 부드럽게 호의 후속 biocytin 계시, 그리고 패치 피 펫에서 수확된 자료의 보존에 대 한 세포 막 폐쇄는 외부 아웃 패치를 철회 했다. 화학의 왕 사회에서 허가 함께 Cauli 및 Lambolez47 에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 레이어 V neocortical 피라미드 세포의 특성. (A) 막 레이어 V 피라미드 세포의 잠재적인 응답-100,-40,-10, 60, 120, 및 + 500 pA (하단 성분)의 전류 펄스에 의해 유도. 신경 초기 hyperpolarizing 응답 (위 추적) 후 약한 잠재적인 편향 표시 됩니다. Supraliminal 도발은에 대응, 신경 방전 후 hyperpolarization (위 추적)을 천천히 개발 오랫동안 활동 전위. 채도, 근처 신경 낮은 주파수에서 방전 하 고 발음된 적응 (상단 회색 추적)을 전시 합니다. 삽입: 기록 된 레이어 V 피라미드 뉴런의 적외선 사진. Pial 표면 위로 이다입니다. 눈금 막대: 20 µ m (B) 다중 RT-PCR 분석 공개 vGluT1, 솜, ATP1α1, 및 ATP1α3의 표현. (C) 26의 샘플에서 진 식 프로필 레이어 V 피라미드 세포. vGluT1는 GAD65, GAD67, 및 COX2 결코 검색 하는 동안 모든 신경 세포에 표현 했다. NPY, 솜, Kir6.2, SUR1, 및 솜int 드물게 관찰 되었다. 피라미드 세포 표현 ATP1α3 Na+의 1 소 단위 /K+ ATPase, 그리고 낮은 범위를 ATP1α2. (D) 최대 강도 투영 confocal 이미지 (A)에 기록 된 biocytin 신경의 라벨 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 유전자 / 은행 번호 | 외부 뇌관 | 크기 (bp) | 내부 뇌관 | 크기 (bp) | ||
| vGlut1 NM_182993 |
감각,-113 | 259 | 감각,-54 | 153 | ||
| GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC | ATTCGCAGCCAACAGGGTCT | |||||
| 반대로 감각, 126 | 반대로 감각, 79 | |||||
| CCAGCCGACTCCGTTCTAAG | TGGCAAGCAGGGTATGTGAC | |||||
| GAD65 NM_008078 |
감각, 99 | 375 | 감각, 219 | 248 | ||
| CCAAAAGTTCACGGGCGG | CACCTGCGACCAAAAACCCT | |||||
| 반대로 감각, 454 | 반대로 감각, 447 | |||||
| TCCTCCAGATTTTGCGGTTG | GATTTTGCGGTTGGTCTGCC | |||||
| GAD67 NM_008077 |
감각, 529 | 598 | 감각, 801 | 255 | ||
| TACGGGGTTCGCACAGGTC | CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC | |||||
| 반대로 감각, 1109 | 반대로 감각, 1034 | |||||
| CCCAGGCAGCATCCACAT | AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC | |||||
| 콕스 2 NM_011198 |
감각, 199 | 268 | 감각, 265 | 181 | ||
| CTGAAGCCCACCCCAAACAC | AACAACATCCCCTTCCTGCG | |||||
| 반대로 감각, 445 | 반대로 감각, 426 | |||||
| CCTTATTTCCCTTCACACCCAT | TGGGAGTTGGGCAGTCATCT | |||||
| NPY NM_023456 |
감각, 16 | 294 | 감각, 38 | 220 | ||
| CGAATGGGGCTGTGTGGA | CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT | |||||
| 반대로 감각, 286 | 반대로 감각, 236 | |||||
| AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT | GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA | |||||
| 솜 NM_009215 |
감각, 43 | 208 | 감각, 75 | 146 | ||
| ATCGTCCTGGCTTTGGGC | GCCCTCGGACCCCAGACT | |||||
| 반대로 감각, 231 | 반대로 감각, 203 | |||||
| GCCTCATCTCGTCCTGCTCA | GCAAATCCTCGGGCTCCA | |||||
|
ATP1Α1 NM_144900 |
감각, 1287 | 288 | 감각, 1329 | 183 | ||
| CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA | TAAGCGGGCAGTAGCGGG | |||||
| 반대로 감각, 1556 | 반대로 감각, 1492 | |||||
| CCGTGGAGAAGGATGGAGC | AGGTGTTTGGGCTCAGATGC | |||||
| ATP1Α2 NM_178405 |
감각, 1392 | 268 | 감각, 1430 | 213 | ||
| AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG | AAATCCCCTTCAACTCCACCA | |||||
| 반대로 감각, 1640 | 반대로 감각, 1623 | |||||
| ACAGAAGCCCAGCACTCGTT | GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC | |||||
| ATP1Α3 NM_144921 |
의미, 127 | 216 | 감각, 158 | 128 | ||
| CGGAAATACAATACTGACTGCGTG | TGACACACAGTAAAGCCCAGGA | |||||
| 반대로 감각, 324 | 반대로 감각, 264 | |||||
| GTCATCCTCCGTCCCTGCC | CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA | |||||
| Kir6.2 NM_010602 |
감각, 306 | 431 | 감각, 339 | 342 | ||
| CGGAGAGGGCACCAATGT | CATCCACTCCTTTTCATCTGCC | |||||
| 반대로 감각, 719 | 반대로 감각, 663 | |||||
| CACCCACGCCATTCTCCA | TCGGGGCTGGTGGTCTTG | |||||
| SUR1 NM_011510 |
감각, 1867 | 385 | 감각, 2041 | 211 | ||
| CAGTGTGCCCCCCGAGAG | ATCATCGGAGGCTTCTTCACC | |||||
| 반대로 감각, 2231 | 반대로 감각, 2231 | |||||
| GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG | GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG | |||||
| SOMint X51468 |
감각, 8 | 240 | 감각, 16 | 182 | ||
| CTGTCCCCCTTACGAATCCC | CTTACGAATCCCCCAGCCTT | |||||
| 반대로 감각, 228 | 반대로 감각, 178 | |||||
| CCAGCACCAGGGATAGAGCC | TTGAAAGCCAGGGAGGAACT | |||||
표 1입니다. 시퀀스의 첫 번째 및 두 번째 PCR 뇌관. 각 PCR 뇌관 및 그들의 시퀀스의 위치를 3' 5'에서 부여 됩니다. Somatostatin intron 제외 1 각 유전자의 시작 codon의 1 루에 해당합니다.
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Discussion
단일 셀 다중 RT-PCR 후 패치 클램프 동시에 하 고 확실 하 게 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 유전자의 표현을 조사할 수 있습니다. 단일 셀 수준에서 유전자 발현을 분석 고효율 PCR 뇌관을 요구 한다. 가장 제한 단계 중 하나를 셀의 내용의 모음입니다. 그것의 효율성은 셀 크기를 일치 하는 동안 가능한 한 크게 해야 패치 피 펫 팁의 직경에 따라 다릅니다. 1-2 µ m 오픈 팁 직경을 가진 펫은 가장 신경 종류에 적합 해야 입증 되었다. 또한 셀룰러 콘텐츠만 수집 되도록 필수적 이다 고 하지 주위 조직. 이 제어 electrophysiologically 수확 동안 단단한 물개를의 보존 하 여 이루어집니다. 피 펫 철수 더 동안 외부 아웃 패치 구성의 형성 세포 파편에서 수확된 세포질을 보호합니다. 멀티플렉스 RT-PCR는 또한 조사 셀 형식의 mRNAs 풍부에 따라 단일 셀의 성공률. 예를 들어, 항복 이다, 상대적으로 낮은 금액3mRNAs를 표현 하는 얻은 뉴런으로 얻은 것 보다 일반적으로 낮은 하며 따라서 샘플 크기15,16증가. 반전 녹음 방송, 튜브48에 낮은 효율을가지고, 단일의 제한 반응 셀 다중 RT-PCR입니다. 그것은 따라서-80 ° C에서 aliquots로 그들을 저장 하 고만 하루 동안 그들을 사용 하 여 최고 품질 시 약을 사용 하 여 중요 한. 마지막으로,는 RTase의 DNA 중 합 효소 활동은 종종 뇌관 이합체 형성의 간과 소스. 이 문제를 해결 하려면 증폭 효율을 높이 중요 한가 한 뇌관으로 뜨거운 시작을 수행 합니다. 또한이 Taq DNA 중 합 효소 활동49에 RTase의 억제 효과 줄일 것 이다.
단일 셀 다중 RT-PCR 기술은 매우 다양 한입니다. 그것은 광범위 하 게 사용 되었다 설치류10,11,13,19,20,34,,5051,52 ,,5354 그러나 거의 모든 동물 모델 및 유전자 조직 및 유전자 시퀀스를 사용할 수 있습니다 가정에 적용할 수 있습니다. 다양 한 패치 클램프 솔루션으로 그들은 RT-PCR 셀 무료 분석 실험에 방해 하지 않습니다 사용할 수 있습니다. 예를 들어 K+ + Cs 양이온, Cl- 또는 구 루 콘 내부 솔루션에 성공적으로 사용 된6,36,,4155되었습니다 수 있습니다.
클래식 틀린 부정적인 결과 패치 피 펫 필 라 멘 트 내부 패치 클램프 솔루션의 RNase 오염에서 줄기. 신중 하 게 chlorinating는 필 라 멘 트 및 내부 솔루션을 일반적으로 확인이 문제를 해결 합니다. 틀린 부정적인 결과 세포질의 비율만 수확 이후 낮은 단일 세포 수준에서 유전자는 표현 하는 경우에 발생할 수 있습니다. 더 큰 펫을 사용 하 여 또는 전체 세포 기록의 시간을 줄여 수확 품질을 높일 수 있습니다. 품질을 수확 단일 셀20에 낮은 수준에서 표현 될 알려진 유전자를 포함 하 여 평가 될 수 있다. 거짓 긍정적인 결과 나쁜 조직 품질, 오염 세포질 파편의 양을 높습니다 발생할 수 있습니다. 파편의 존재를 테스트 어떤 인감을 수행 하 고 피펫으로 제거 전에 긍정적인 압력을 방출 하지 않고 패치 피 펫을 조각에 삽입 하 여 수행 됩니다. Amplifiable 재료의 존재는 다음 다중 실시간 PCR42에 의해 조사 됩니다. Silanizing 패치 피 펫 또한 세포 외 오염 물질56의 컬렉션을 줄이기 위해 사용 되었습니다. 단 세포 PCR 이중 좌초 DNA57의 단일 복사본으로 약간 감지할 수 있는 매우 중요 한 기술입니다. Intron 없는 유전자의 경우 핵에 포함 된 gDNA 또한 가양성을 생성할 수 있습니다. 이 문제를 해결 하기 위해 수확 수 중 핵에서 피 펫을 배치 하 여 gDNA 컬렉션을 피하고. GDNA의 존재는 intronic 시퀀스25를 증폭 시켜 안정적으로 조사 될 수 있다.
RT-PCR에 의해 mRNA 분자의 검출 RTase48의 낮은 효율 때문에 아마도 10 부44, 신뢰할 수 없는 되 고 이어질 수는 낮은 풍부 녹취 록26,42의 아래. 이 intron 없는 유전자의 경우 문제가 될 수 있습니다. 실제로, 수집 될 수 있는 세포질의 양과 따라서 검출 감도 감소는 핵의 수확을 피하. 단일 셀 RT-PCR 후 biocytin 라벨로 패치 클램프 셀의 모양을 최대한 유지는 필요의 조합 (그림 3). 피할,이 수집 될 수 있습니다, 성공률을 줄이는 물질의 양을 줄일 수 있습니다. 세포질 컬렉션 및 세포 형태학의 보존 사이 타협은 필수입니다.
그들은 단지 cDNAs 여부에 정보를 제공으로 다중 단일 셀 RT-PCR 데이터 양적 되지 않습니다 제시 하거나 수집 된 자료에서 결 석. 그러나, 위에서 설명한 감지 한계 때문에 인구 수준에서 검출의 발생 단일 세포 수준에서 유전자의 풍부를 반영할 수 있습니다. 대체 방법을 수 있도록 더 많은 양적 데이터를 생성 하지만의 수를 제한 하는 그들의 특정 확대 전략 (즉, 동종 유전자 또는 실시간 정량의 상대 부 량)에 의해 크게 부과 기술적 제약 동시에 될 수 있는 유전자 분석41,53,55,,5859,60,61,62,63 ,,6465,66. 패치 클램프 기록 및 단일 셀 RNaseq, 패치-seq30,31, 라고 최근 조합 electrophysiologically 특징 세포의 양적 transcriptomic 분석을 수 있습니다. 새로운 유망 접근, 아직 높은 처리량 시퀀서에 대 한 액세스 요구 이며 생성 된 데이터는 시간이 걸리는 분석이 필요.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
원고에 대 한 그의 의견에 감사 박사 알렉산더 Mourot 하 고. 이 작품은 직원 회 드 라 검색 (ANR 2011 MALZ 003 01;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 ANR-15-CE16-0010 고 ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation 부 라 검색 르 츠에서에서 친교에 의해 지원 됩니다. 우리는 IBPS (파리, 프랑스)의 동물 시설 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
| Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
| Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
| BT10 Series - 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
| BT20 Series - 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
| BT200 Series - 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
| BT1000 Series - 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
| DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
| ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
| EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
| Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
| Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
| Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
| Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
| 5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
| Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
| Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
| PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
| BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
| XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| 10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
| E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |
References
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