Summary
Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes en humanos. Un modelo apropiado en vivo es fundamental para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica de la novela. Con este modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea, uno puede examinar la patogenesia y nuevos tratamientos contra las infecciones mortales.
Abstract
Modelos murinos de infección son fundamentales para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica novedosa para combatir agentes patógenos causales. Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes que presentan los pacientes en la clínica y así garantiza un modelo apropiado en vivo . Neumonía típica modelos utilizan la inoculación intranasal, que deposita excesiva organismos fuera del pulmón, causando complicaciones fuera del objetivo y los síntomas, tales como sinusitis, gastritis, enteritis, trauma físico o micropartículas de la bruma para imitar el aerosol propagación más típica de la neumonía viral, tuberculosa o micótica. Estos modelos no reflejan con exactitud la patogenia de la neumonía bacteriana típica o healthcare-adquirida en la comunidad. En contraste, este modelo murino de neumonía por aspiración orofaríngea imita el recorrido de la gota en neumonía adquirida en el cuidado de la salud. Suspensión en la orofaringe de ratones anestesiados inocular 50 μl de las bacterias hace que aspiración reflexiva, que produce neumonía. Con este modelo, uno puede examinar la patogenesia de patógenos causantes de neumonía y nuevos tratamientos para combatir estas enfermedades.
Introduction
Infección de vías respiratoria inferiores es la enfermedad contagiosa más mortífera del mundo y la causa más común de muerte en los países en desarrollo1. Estas infecciones representan a nivel mundial, más de 3,2 millones de muertes de1. Además, neumonía nosocomial es una de las formas más comunes y mortales de salud infecciones adquiridas y es causada por los patógenos más resistentes a los antibióticos2,3. La ruta típica de adquisición de neumonía bacteriana tanto adquiridas en la comunidad y neumonía nosocomial es la aspiración de contenido orofaríngeo en el alvéolo. Modelos murinos utilizados para estudiar estas enfermedades a menudo utilizan la inoculación intranasal4, depositando gran parte de las bacterias fuera de los pulmones, causando síntomas como sinusitis o trauma físico, que son incongruentes con la enfermedad y las complicaciones fuera del objetivo progresión en humanos que los modelos fueron diseñados para emular. Otros modelos pueden utilizar cámaras de inhalación y los dispositivos micromisting, que más exactamente imitan a neumonías virales, tuberculosas y micóticas, pero exactamente no recapitular la ruta normal de adquisición de las neumonías bacterianas típicas.
El modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea puede utilizarse para simular la ruta natural y patogenia de la neumonía bacteriana. Por inoculación 50 μl de la suspensión bacteriana en la orofaringe de ratones anestesiados con una pipeta, sobreviene la aspiración reflexiva, que produce neumonía infecciosa. Usando este modelo, uno puede examinar la patogenesia de patógenos causantes de neumonía y nuevos tratamientos para combatir estas enfermedades con un modelo de fidelidad mayor, más análogo a las infecciones de neumonía de aspiración observadas en humanos. Además, a diferencia de modelos similares que infectan a través de la cavidad bucal5,6, este modelo asegura que el inóculo completo llegue a los pulmones en lugar del intestino, donde puede causar inflamación externa e infecciones, como gastritis y la enteritis. Por último, a diferencia del otro modelo publicado que requiere un laringoscopio y que inocula a través de la tráquea7, este modelo no obstruye la vía aérea con una aguja de la sonda y no requiere de inyección para la entrega de inóculo. Por el contrario, la inoculación se basa en el reflejo de la aspiración natural del ratón.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran animales deben ser aprobados por el investigador institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC).
1. preparación del inóculo bacteriano
- Aislar colonias bacterianas.
- Racha de una cepa bacteriana (p. ej., a. baumannii "HUMC1") en medio de agar estéril adecuada (por ejemplo, agar soja tríptico), teniendo cuidado de generar colonias aisladas.
- Incubar en condiciones apropiadas (por ejemplo, durante la noche a 37 ° C).
- Crecer el cultivo durante la noche.
- Seleccione a un representante de Colonia aislada de la placa de agar con un asa de inoculación estéril y se usa para inocular 10 mL de medio de caldo estéril adecuada (por ejemplo, caldo de soja tríptica).
- Permita que la muestra llegar a la fase estacionaria en las condiciones adecuadas (por ejemplo, 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche en un frasco cónico tapa de ventilación, 50 mL).
- Crecer la subcultura.
- Transferir 100 μL de la cultura durante la noche a 10 mL de caldo estéril fresca con ayuda de una pipeta.
- Permiten llegar a la fase exponencial/registro en las condiciones adecuadas (por ejemplo, 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 3 horas en un frasco cónico tapa de ventilación, 50 mL).
- Lave la subcultura.
- Retire la subcultura de su entorno de incubación.
- Centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las bacterias.
- Aspirar y descartar el sobrenadante.
- Añadir 10 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) al pellet y vortex vigorosamente, hasta que completamente suspendidas.
- Repita los pasos 1.4.2 - 1.4.4 dos veces, para un total de 3 lavados.
- Ajustar la concentración de la suspensión bacteriana.
- Usando un espectrofotómetro que mide la densidad óptica a 600 nm (OD600), medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana.
- Añadir PBS estéril en la suspensión bacteriana hasta que la densidad óptica del inóculo a un OD600 de 0.5, utilizando la ecuación C× V = Cf× Vf, donde "C" es la concentración, "V" es el volumen, "" es inicial, y "f" es final. * Cf debe ser siempre 0,5; Vf es la variable a resolver.
- Si la suspensión bacteriana cae por debajo de un OD600 0.5, centrifugar a 4.000 × g por 5 min a las bacterias de la pelotilla y extraiga una cantidad apropiada del sobrenadante a un OD600 de 0.5.
- Realizar diluciones seriadas en PBS estéril (p. ej., tres diluciones 1: 100 para lograr 1 × 10-6) y la placa de agar estéril para determinar el coeficiente de correlación que revela la concentración bacteriana en la formación de Colonia unidades por mL (UFC/mL) a un OD600 de 0.5.
Nota: El valor de este coeficiente de correlación puede variar para cada cepa de cada especie y debe ser determinado antes de la preparación del inóculo para una infección. - Después de determinar el coeficiente de correlación, utilizarlo para crear un inóculo de la concentración deseada (p. ej., 2 × 108- 1 × 109 UFC/mL); Si el inóculo deseado es mayor que el OD600 0.5, centrifugar la suspensión bacteriana en 4.000 × g por 5 min a las bacterias de la pelotilla y extraiga una cantidad apropiada del sobrenadante para alcanzar la concentración deseada.
- Realizar en vivo estudios piloto para determinar la virulencia de cada cepa bacteriana en cada cepa de ratón, estos valores pueden variar entre aislamientos bacterianos de la misma especie y ratones de diferentes fondos genéticos. Para varias especies Gram-negativas, LD100 en ratones es generalmente 1-5 × 108 UFC/ratón, aunque algunas cepas son letales en inóculos inferiores.
- Congelar alícuotas idénticas para uso futuro como inóculo en la demanda, precisa, como previamente publicados8 (opcional).
- Preparar 1 L de inóculo bacteriano como se describe anteriormente, transferencia a dos frascos cónicos de 500 mL y centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos.
- Deseche 450 mL del sobrenadante de cada frasco cónico y resuspender el pellet de bacterias en el sobrenadante restante.
- Transferir el inóculo bacteriano concentrado a un vaso de precipitados de 250 mL que contiene una barra de agitación magnética y mezclar continuamente en la parte superior una placa de agitación 300 RPM.
- Cuidadosamente transfiera exactamente 600 μL del inóculo bacteriano concentrado (p. ej., 1 × 1010 UFC/mL) usando una pipeta a un frasco de 1,6 mL criogénico que contiene exactamente 300 μL de estéril de H2O y 300 μL de glicerol estéril; mezclar y almacenar a-80 ° C.
Nota: El glicerol necesario para almacenamiento puede confundir los resultados experimentales y causar exceso de mortalidad, por lo que es necesario lavar a cabo. - Cuando esté listo para su uso, descongelar la muestra 10 min a temperatura ambiente.
- Transferir 1 mL a un frasco cónico de 50 mL, añadir 9 mL de PBS estéril y centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las bacterias. Aspirar el sobrenadante y resuspender la cantidad predeterminada de UFC (× 1 mL congelada stock concentración en UFC/mL) en un volumen adecuado de PBS para alcanzar la concentración deseada para el inóculo infeccioso.
2. anestesiar ratones
- Ketamina/xilacina
Nota: La anestesia con ketamina/xilacina tiene una larga duración, que ofrece el tiempo suficiente para el investigador que es nuevo en esta técnica para completar el procedimiento de inoculación antes de que el ratón se despierta.- Preparar 10 mL de solución inyectable combinando 8,5 mL de pharmaceutifcal grado PBS, 1 mL de 100 mg/mL ketamina solución (concentración final 10 mg/mL) y 0.5 mL de xilacina solución stock de 20 mg/mL (concentración final 10 mg/mL).
- Administrar 10 μL/g por inyección intraperitoneal de (IP) (por ejemplo, 250 μL de un ratón de 25 g).
- Aplicar ungüento oftálmico en los ojos de los ratones anestesiados con ketamina/xilacina porque sus ojos son propensos a daños durante largos periodos de la anestesia.
- Coloque el ratón en una jaula y vigilar hasta que despierta de la anestesia.
Nota: El animal no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
- Isoflurano
Nota: Ratones rápidamente despiertan de la anestesia isoflurano-inducida después de ser eliminado de la cámara de inducción, por lo que este método de anestesia sólo debe utilizarse después de ser competente en el procedimiento de inoculación.- Colocar los ratones ingenuos en una cámara de tamaño adecuado de la inducción con flujo de oxígeno.
- Después de que la cámara está sellada, anestesiar los ratones utilizando un vaporizador de precisión para añadir isoflurano en el 4% (v/v) por menos de 5 min; la anestesia para confirmar eliminación de un ratón de la cámara de inducción y medir cuánto tarda en despertarse de la anestesia (~ 60 s).
Nota: Tenga en cuenta que anestesia los tiempos pueden variar basado en las directrices y algunos animales pueden requerir más de 5 minutos para ser completamente anestesiada. - Mantener la anestesia hasta 10 minutos ajustando la concentración de isoflurano al 2-3%; Si la duración total de la anestesia es > 15 minutos, aplicar pomada oftálmica en los ojos de los ratones anestesiados.
- Coloque el ratón en una jaula y vigilar hasta que despierta de la anestesia, como en el paso 2.1.
3. inocular/infectar ratones
- Suspender un ratón anestesiado, colgando de sus incisivos superiores sobre una cuerda fuerte y delgada (por ejemplo, seda dental) fijado a un objeto fijo a una altura aproximadamente dos veces del ratón longitud de cuerpo (p. ej., 20 cm) por encima de la superficie de funcionamiento (p. ej. Banco de laboratorio).
- Tire suavemente de la lengüeta del ratón de su boca con unas pinzas estériles, punta Roma. Transferencia de la lengua a un dedo enguantado estéril para evitar aplastamiento accidental de la lengua del ratón. Mantener la lengua fuera de la boca, permitiendo el acceso a la orofaringe y prevención de la ingestión del inóculo al lado.
- Mientras sujeta la lengua del ratón, colocar el inóculo de 50-μL (suspensión bacteriana) en la orofaringe utilizando una micropipeta; la orofaringe está situada en el cruce de la cavidad bucal y la faringe hacia la parte posterior de la boca.
Nota: Es muy importante entregar sólo líquido transfiriendo a la primera parada de la micropipeta. El ratón dejará de respirar durante unos segundos cuando el inóculo se coloca en la orofaringe; Finalmente, aspiración reflexiva hará que el ratón inhalar la suspensión bacteriana, indicada por la crepitación característico de líquido en los pulmones, que resulta en la infección por neumonía. - Si el inóculo no se coloca muy atrás lo suficiente como para bloquear la respiración normal, pellizcar las narinas con pinzas a la fuerza de aspiración reflexiva a través de la boca y posterior inhalación del inóculo.
- Después de la inoculación, soltar la lengua, quitar el mouse de la cadena de suspensión, colocarlo en una jaula y monitorear hasta que despierta de la anestesia, como en el paso 2.1.
4. monitoreo de la progresión de la enfermedad
Nota: Debido al sufrimiento de los animales, varios indicadores deben utilizarse para indicar cuando ratones moribundos; eutanasia se debe realizar esta determinación, de conformidad con un protocolo previamente aprobado de IACUC; diversos marcadores de la trata incluyen la temperatura corporal, pérdida de peso, aspecto, marcha y otros biomarcadores que pueden obtenerse de la sangre (por ejemplo, a través de iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
- Eutanasia a los ratones según protocolo previamente aprobado de IACUC (p. ej., de CO2 seguido por dislocación cervical).
- Retire los pulmones de ratón sacrificaron mediante la reducción de la tráquea, la arteria pulmonar y vena pulmonar cerca de los pulmones.
- Microscopia
- Colocar los pulmones (o porción) en un molde de la muestra.
- Llenar el molde de la muestra con temperatura óptima de corte (O.C.T.) compuesto, sumergir completamente el tejido.
- Congelación de la muestra a-80 ° C.
- Enviar la muestra a un laboratorio de patología para la sección y montar en portaobjetos para microscopía.
- Carga bacteriana
- Pesa el tejido pulmonar con una balanza analítica.
- Transferir el tejido pulmonar al frasco cónico de 50 mL que contiene 2-5 mL de PBS estéril (dependiendo del tamaño del tejido).
- Homogeneizar el tejido pulmonar con un homogeneizador de tejidos.
- Realizar diluciones seriadas del homogeneizado de la PBS estéril para lograr aproximadamente 1.000 ufc/mL, basado en la carga bacteriana esperada en los pulmones.
- Por ejemplo, si se espera que 1 × 109 UFC/mg, realizar tres diluciones 1: 100: transferir 100 μL de homogenado a 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; se trata de la primera dilución 1: 100. Transferir 100 μL de la primera dilución 1: 100 en 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; Esta es la segunda dilución 1: 100. Transferir 100 μL de la dilución 1: 100 segundo a 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; Esta es la dilución 1: 100 tercer y final.
- Si se desconoce la carga bacteriana en los pulmones, realizar una serie de diluciones para capturar el rango esperado.
- Añadir placa sobre agar estéril.
- Preparar caldo de soja tríptica el estéril (TSB) con las placas de agar (TSA): cosechadora 30 g de TSB, 15 g de agar, 1 L de agua, mezclar con un agitador magnético y calentar hasta que hierva a ~ 100 ° C durante 5 minutos dejar enfriar y luego autoclave en el ciclo líquido durante 15 minutos dejar enfriar ~ 55 ° C, la transferencia recién esterilizada 10 mL TSA a cajas Petri estériles y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Deje seca de sobremesa para 2-5 d o descubierto debajo de un gabinete de 10 min de bioseguridad.
- Transferir 100 μL de la dilución a una caja de Petri que contenga estéril TSA y repartidos en TSA con perlas de vidrio o esparcidor.
- Guarde la caja Petri durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada (es decir, que contiene un vaso de 1 L al descubierto llenada de agua de la incubadora de 37 ° C)
- Determinar homogeneizado de pulmón UFC/mL en placas de agar base (por ejemplo, 100 unidades formadoras de colonias en placa de TSA con 100 μL de dilución del tercer y último descrito sería 100 UFC/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- Calcular el tejido pulmonar de UFC/mg base dividiendo homogeneizado de pulmón UFC/mL de homogeneizado de tejido/mL de pulmón mg (por ejemplo, si muestra descrita anteriormente utilizado 100 mg de tejido pulmonar homogeneizado en 5 mL de PBS, luego 1 × 109 UFC/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 CFUs/mg).
- Microscopia
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Representative Results
Con cuidado, siguiendo el protocolo, pueden obtenerse fácilmente reproducibles y robustos de datos. Es importante apegarse estrictamente a la personalizada inóculo preparación protocolo para experimentos para ser comparado con una entre sí. También es importante manejar adecuadamente los ratones durante el proceso de infección. Asegúrese de colocar ratones en una cámara de anestesia desprovisto de isoflurano. Ratones se asuste si se colocan en una cámara que ha sido previamente llenada con isoflurano y pueden experimentar estrés excesivo, que posiblemente puedan comprometer los resultados experimentales. Después de asegurar la tapa del recipiente, poco a poco introducir isoflurano incrementando progresivamente su concentración de 0% a 4% (v/v); rápidamente administrando isoflurano puede también causar ratones pánico. Una vez que los ratones se convierten en inconscientes, reducen la concentración de isoflurano al 2-3% (v/v) y que puedan permanecer en la sala pocos minutos. En este punto, los ratones están listos para ser infectados (figura 1).
Quite un ratón de la cámara de anestesia y suspender por sus incisivos superiores para permitir el acceso a la lengua (figura 2). Uso pinzas de punta Roma para tirar suavemente hacia fuera la lengüeta (figura 3) entonces traslado la lengua celebrada pinzas a un estéril, guantes dedos (figura 4) para evitar trauma en la lengua del ratón. Con la lengua aún fuera de la boca, transferir el inóculo de 50 μl a la orofaringe (figura 5). Aquí, es muy importante entregar sólo líquido transfiriendo a la primera parada de la micropipeta. Continuar a la segunda parada puede introducir una gran burbuja en el inóculo que interfiere con la infección.
Una vez completada la infección, hay una gran variedad de opciones para la prueba de ratones. Estudios de patogénesis, uno puede comparar no infectados a tejidos infectados (figura 6). Si analizando la efectividad de la terapéutica de la novela, uno puede eliminar los pulmones y seccionadas y manchado. Esto puede hacerse en un momento o en varios puntos del tiempo para mostrar la progresión de la enfermedad (figura 7).
Otra opción es evaluar la carga bacteriana en los pulmones de ratones infectados. Esto se hace mediante la eliminación de los pulmones, transferir a un frasco que contiene un volumen conocido de PBS estéril, luego, homogeneizar con un homogeneizador de tejidos (enjuague entre cada muestra para evitar la contaminación cruzada). Diluciones seriadas del homogeneizado de pulmón en el agar de ricos en nutrientes de la galjanoplastia permite calcular las UFC/mL de cada homogenado de pulmón y posteriormente UFC/mg tejido pulmonar (figura 8). Esto, también puede hacerse en un momento o en varios puntos del tiempo para mostrar la progresión de la enfermedad.
Hay incontables otros ensayos que pueden realizarse, incluyendo análisis de citocinas (figura 9), biomarcadores de sepsis por iSTAT (figura 10), citometría de flujo para investigar marcadores de superficie celular, celular de perfiles, RNAseq, etc.
Figura 1 : Determinar LD100. Es necesario infectar ratones con diferentes concentraciones de inóculo para determinar el LD100. Aquí, el inóculo 2 × 108 UFC/ratón es demasiado alta, 5 × 107 y 2 × 107 son demasiado bajos, y 1 × 108 es la correcta.
Figura 2 : Colgar ratones por incisivos superior. Después de que los ratones son anestesiados, retire un ratón de la cámara de inducción, (A) utilizar fórceps para extraer un bucle de cuerda aseguró 20-30 cm por encima de la superficie de trabajo, (B) mueva la cadena detrás de incisivos superiores del ratón, (C) garantizar la cadena de se fija detrás de los incisivos superiores, y (D) dejó el ratón cuelgan por sus incisivos superiores en el lazo de cuerda.
Figura 3 : Tirar lengua de boca con agarre de pinzas y transferencia hacia los dedos enguantados. Después de colgar el ratón por sus incisivos superiores, (A) utilizar pinzas para agarrar con cuidado la lengüeta del ratón, (B) tire suavemente hacia fuera la lengüeta, () C) transferir cuidadosamente la lengüeta de fórceps a dedos enguantados para evitar traumas en el ratón lengua, y (D) Sujete la lengüeta con los dedos enguantados. Asegúrate de aplicar suficiente presión para evitar que la lengua caiga hacia atrás en la boca pero no tan mucho la presión que el trauma sobreviene. La lengua debe realizarse fuera de la polilla y al lado para permitir el acceso de la micropipeta en el paso siguiente. En este punto, el ratón está listo para la infección.
Figura 4 : Infectan el ratón. Mantener la lengua fuera de la boca, utilice una micropipeta para transferir el inóculo de 50 μl a la orofaringe. Coloque la punta de la pipeta dentro de la boca en la parte posterior de la lengua y dispensar la suspensión bacteriana, sólo te vas a la primera cima de la micropipeta; no van a la segunda parada como este puede introducir una gran burbuja en el inóculo que puede interferir con la aspiración completa.
Figura 5 : Micrografía de sanos (no infectados) vs infectado el tejido pulmonar. Hematoxilina y eosina (H & E) tinción de secciones del pulmón antes y después de la aspiración orofaríngea de a. baumannii, que recapitula el recorrido de la neumonía asociada al ventilador (VAP), dando por resultado muerte típicamente dentro de 1-3 días y sustancial alveolar inflamación como se ve aquí.
Figura 6 : Evaluar la carga bacteriana; reeditado y modificado con permiso14 . Después de infectar ratones, quite los pulmones por disección después de la exitosa eutanasia en cumplimiento con el protocolo IACUC aplicable. Recoger la masa del tejido pulmonar, transferir a un frasco que contiene un volumen conocido (2-5 mL) de PBS estéril y homogeneizar con un homogeneizador de tejidos. Asegúrese de enjuagar el homogeneizador con etanol y PBS estéril entre cada muestra para evitar la contaminación cruzada. Realizar diluciones seriadas del homogeneizado de pulmón y placa varias diluciones en agar rico en nutrientes e incubar adecuadamente para el patógeno solicitado. Calcular las UFC/mL de cada homogenado de pulmón en dilución del × de UFC/placa base y luego dividir por el homogeneizado de pulmón mg pulmón tejido/mL. Esto puede hacerse en un momento o en varios puntos del tiempo para mostrar la progresión de la enfermedad. Medianas se muestran con barras de error que representan rangos intercuartil. p < tratado 0.05 vs grupo no tratado.
Figura 7 : Micrografía del tejido pulmonar infectado, no tratados vs tratados; reeditado y modificado con permiso14 . Después de infectar ratones, quite los pulmones por disección después de la exitosa eutanasia en cumplimiento con el protocolo IACUC aplicable. Preservar adecuadamente el tejido (e.g., inmersa en la gel de la temperatura óptima de corte y congelados a-80 ° C) enviar a laboratorio de patología u otra persona competente para el seccionamiento y la coloración. Esto puede hacerse en un momento o en varios puntos del tiempo para mostrar la progresión de la enfermedad.
Figura 8 : Análisis del Cytokine; reeditado y modificado con permiso14 . Para analizar las citocinas circulantes, adquirir suficiente sangre (p. ej., 50 μL por mellar la cola), dejar coagular durante 30 min a temperatura ambiente, centrifugar a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C y recoger el suero sobrenadante. El suero se puede analizar entonces por Luminex multiplex para citoquinas. Esto puede hacerse en un momento o en varios puntos del tiempo para mostrar la progresión de la enfermedad. Medianas se muestran con barras de error que representan rangos intercuartil. p < 0.05 tratados vs grupo sin tratar en el mismo momento.
Figura 9 : Biomarcadores de sepsis; reimpreso y modificado con permiso14 . Analizar biomarcadores de sepsis, procurar 75 sangre μl (p. ej., mediante cola muesca) y transferir rápidamente a un cartucho de iSTAT que prueba para los analitos deseados. Esto puede hacerse en un momento o en varios puntos del tiempo para mostrar la progresión de la enfermedad. Medianas se muestran con barras de error que representan rangos intercuartil. p < 0.05 tratados vs grupo sin tratar en el mismo momento.
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Discussion
Sin duda, los ratones no son seres humanos miniatura. Resultados obtenidos en modelos de ratón deben ser considerados en contexto y posteriormente interpretadas para su aplicación a seres humanos, basada en las diferencias y similitudes entre las dos especies6. También es importante elegir la cepa de ratón apropiado como algunos son más susceptibles a algunas infecciones que otros; lo mismo se aplica a la cepa del patógeno de elección16.
Es imprescindible realizar infecciones de una manera exigente y altamente reproducible. Inóculo puede ser letal para ratones en un valor pero inofensivo incluso el 90% de ese valor. Por lo tanto, es imperativo que todas las condiciones enumeradas en el presente Protocolo se reproducen de la misma manera exacta, particularmente al preparar el inóculo y cuando infectando. Además, cada patógeno provocan la enfermedad en un único inóculo. Por lo tanto, es necesario realizar experiencias piloto para determinar el inóculo apropiado para cada cepa del patógeno y en cada cepa de ratón.
Con bacterias Gram-negativas, un inóculo de ≤5 × 108 UFC/ratón es suficiente para causar la muerte en cepas virulentas. Se aconseja no utilizar cepas que son no letales en ≤1 × 109 UFC/ratón porque sugieren dudosa relevancia a patogenesia basada en gran cantidad de material en los pulmones16.
En comparación con otros, hay muy pocas complicaciones técnicas para el modelo de neumonía de aspiración orofaríngea y es mucho mayor. Sólo una complicación de menor importancia de los resultados del modelo cuando la tensión de superficie alrededor del inóculo de 50 μl se coloca en la orofaringe permite la respiración nasal, imposibilitando la aspiración-la causa de la infección. En este caso, simplemente pellizcando las narinas con el fórceps obliga aspiración reflexiva a través de la boca y posterior inhalación del inóculo para inducir neumonía infecciosa. Esto es, sin embargo, un error técnico por el técnico, que se evita fácilmente con un mínimo de práctica.
En términos de su relevancia para la enfermedad humana, una limitación de este modelo, como otros modelos de infecciones por bacterias gramnegativas, es la rapidez de la progresión de la enfermedad. Los seres humanos rara vez están infectados con un bolo grande de una suspensión bacteriana, razón por la cual ratones progresan a la enfermedad tan rápidamente. Sin embargo, todos los tratamientos aprobados por la FDA se someten a estos exámenes de investigación traslacional en modelos animales para evaluar su potencial terapéutico antes de pasar a ensayos clínicos en seres humanos. Irónicamente, la rapidez de la modelo es también una característica atractiva, ya que puede proporcionar claridad sobre eficacia terapéutica dentro de un período breve de tiempo.
No hay modelo murino es perfecto, pero este es un modelo con la capacidad de imitar fielmente la ruta de la infección y la patogenia de enfermedades humanas y evaluar la eficacia de la terapéutica potencial, lo que permite la traducción rápida de nuevas terapias se necesitan desesperadamente en la clínica.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas en los institutos nacionales de salud [Grant número R01 AI117211 AI130060 R01, AI127954 R21 y R42 AI106375 a BS] y nos Food and Drug Administration [contrato HHSF223201710199C a BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
- Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
- Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
- Medina, E.
- Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J.
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
- Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
- Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
- Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
- Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
- Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
- Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
- Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
