Summary
Smittsam lunginflammation är bland de vanligaste infektionerna i mänskliga. En lämplig in-vivo -modellen är kritisk för att förstå sjukdomspatogenes och testa effekten av romanen therapeutics. Med denna murina orofaryngeal aspiration lunginflammation modell, kan man undersöka de patogenes och nya behandlingar mot dessa dödliga infektioner.
Abstract
Murina infektion modeller är avgörande för att förstå sjukdomspatogenes och testa effekten av nya behandlingar för att bekämpa orsakande patogener. Infektiös lunginflammation är bland de vanligaste infektioner som presenteras av patienter på kliniken och därmed garanterar en lämplig in-vivo -modell. Typisk lunginflammation modeller använder intranasalt Inympning, som deponerar överdriven organismer utanför lungan, orsakar ej åsyftade komplikationer och symtom såsom bihåleinflammation, gastrit, enterit, fysiskt trauma eller microparticle imma för att efterlikna aerosol sprida mer typiska för viral, tuberkulösa eller svamp lunginflammation. Dessa modeller återspeglar inte korrekt patogenesen av typiska eller hälso-och sjukvård-bakteriell pneumoni. Däremot härmar denna murina modell av orofaryngeal aspirationspneumoni droplet rutten i hälso-och sjukvård-pneumoni. Suspension i orofarynx sövda möss ympning 50 µL av bakterier och orsakar reflexiv aspiration, vilket resulterar i lunginflammation. Med denna modell kan man undersöka patogenesen av lunginflammation som orsakar patogener och nya behandlingar för att bekämpa dessa sjukdomar.
Introduction
Nedre luftvägsinfektion är världens dödligaste smittsamma sjukdomar och den vanligaste dödsorsaken i utvecklingsländerna1. Globalt, redovisa dessa infektioner mer än 3,2 miljoner dödsfall1. Dessutom nosokomial pneumoni är bland de vanligaste och mest dödliga formerna av hälso-och infektioner, och orsakas av den mest antibiotika-resistenta patogener2,3. Den typiska förvärv av bakteriell lunginflammation för båda samhällsförvärvad och nosokomial pneumoni är aspiration av orofaryngeal innehållet i alveolerna. Murina modeller används för att studera dessa sjukdomar ofta använder intranasalt inympning4, sätta in mycket av bakterierna utanför lungan, orsakar ej åsyftade komplikationer och symptomen som bihåleinflammation och fysiska trauman, som är oförenlig med sjukdomen progression i mänskliga att modellerna var utformade för att efterlikna. Andra modeller kan använda inandning chambers och micromisting enheter, vilket mer korrekt efterlikna viral, tuberkulösa och svamp lunginflammationer, men inte korrekt sammanfatta den normala vägen förvärvskostnaden för typiska bakteriella lunginflammationer.
Murina orofaryngeal aspiration lunginflammation modellen kan användas för att simulera naturlig väg och patogenesen av bakteriell lunginflammation. Genom ympning 50 µL av bakteriesuspensionen i orofarynx sövda möss med pipett, inträder reflexiv aspiration, vilket resulterar i smittsam lunginflammation. Använda denna modell, kan man undersöka patogenesen av lunginflammation som orsakar patogener och nya behandlingar för att bekämpa dessa sjukdomar med en högre trohet modell, mer jämförbar med aspiration lunginflammation infektioner observerats i mänskliga. Dessutom, till skillnad från liknande modeller som infekterar via munhålan5,6, garanterar denna modell att det fullständiga inokulatet når lungorna istället för tarmen, där det kan orsaka off-site inflammation och infektioner, såsom gastrit och enterit. Slutligen, till skillnad från en annan publicerad modell som kräver en laryngoskopet och infektionsstadierna genom luftstrupen7, denna modell skymmer inte luftvägarna med sondmatning nål och kräver inte injektion för inokulum leverans. I stället bygger inympning på den naturliga strävan reflexen av musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur måste godkännas av forskarens institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC).
1. beredning av bakteriell inokulatet
- Isolera bakteriekolonier.
- Streak en bakteriell stam (t.ex., A. baumannii ”HUMC1”) på lämplig steril agarsubstrat (t.ex., Tryptic soy agar), var noga med att generera isolerade kolonier.
- Inkubera vid lämpliga villkor (t.ex., över natten vid 37 ° C).
- Växa över natten kultur.
- Välj en representant, isolerad koloni från agarplattan med en steril inoculating loop och använda den för att Inokulera 10 mL lämplig steril buljong medium (t.ex., Tryptic soy buljong).
- Låt provet att nå den stationära fasen på lämpliga villkor (t.ex., 37 ° C under skakning på 200 rpm över natten i en ventilerad-cap, 50 mL koniska injektionsflaska).
- Växa subkultur.
- Överför 100 μL av övernattning kultur 10 ml av färska sterila buljong med pipett.
- Tillåta för att nå exponentiell/logga fas på lämpliga villkor (t.ex., 37 ° C under skakning på 200 rpm för 3 h i en ventilerad-cap, 50 mL koniska injektionsflaska).
- Tvätta subkultur.
- Ta bort subkulturen från dess ruvande miljö.
- Centrifugera vid 4000 × g i 5 min till pellet bakterierna.
- Aspirera och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 10 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till pellet och vortex kraftigt tills fullt resuspended.
- Upprepa steg 1.4.2 - 1.4.4 två gånger, för sammanlagt 3 tvättar.
- Justera koncentrationen av bakteriesuspensionen.
- Med en spektrofotometer som mäter optisk densitet vid 600 nm (OD600), Mät den optiska densiteten av bakteriesuspensionen.
- Lägga till steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i bakteriesuspensionen tills inokulatet optiska densitet sjunker till en OD600 0,5, använder den ekvation Cjag× Vjag = Cf× Vf, där ”C” är koncentration, ”V” är volym, ”jag” är ursprungliga, och ”f” är slutgiltigt. * Cf bör alltid 0,5; Vf är variabeln att lösa.
- Om bakteriesuspensionen sjunker under en OD600 0,5, Centrifugera det 4000 × g för 5 min till pellet bakterierna och ta bort en lämplig mängd supernatanten att nå en OD600 0,5.
- Utföra seriespädningar i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (t.ex., tre 1: 100 utspädningar att uppnå 1 × 10-6) och plattan på sterila agar att bestämma korrelationskoefficienten som avslöjar bakteriell koncentrationen i kolonibildande enheter per mL (CFUs/mL) på en OD600 0,5.
Obs: Värdet av denna korrelationskoefficienten varierar för varje stam av varje art och måste fastställas innan inokulum förberedelse för en infektion. - Efter bedömningen av korrelationskoefficienten, använda den för att skapa ett inokulum av önskad koncentration (t.ex., 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); om det önskade inokulatet är större än den OD600 0,5, Centrifugera bakteriesuspensionen vid 4000 × g i 5 min till pellet bakterierna och ta bort en lämplig mängd supernatanten till önskad koncentration.
- Utföra i vivo pilotstudier för att avgöra varje bakterie isolatet i varje stam av mus virulens eftersom dessa värden kommer att variera mellan bakteriell isolat av samma art och möss av olika genetiska bakgrunder. För olika gramnegativa arter är LD100 hos möss generellt 1-5 × 108 CFUs/mus, även om vissa stammar är dödliga på lägre inokulat.
- Frysa identiska alikvoter för framtida användning som på begäran, exakt inokulat, som tidigare publicerade8 (valfritt).
- Laga 1 L av bakteriell inokulatet som beskrivs ovan, överföring till två 500 mL koniska injektionsflaskor och centrifugera vid 4000 × g i 5 min.
- Kassera 450 mL av supernatanten från injektionsflaska koniska och resuspendera pellets av bakterier i återstående supernatanten.
- Överföra det koncentrerade bakteriell inokulatet till en 250 mL bägare som innehåller en magnetiska rör bar och kontinuerligt blanda ovanpå en uppståndelse tallrik vid 300 rpm.
- Noggrant överföra exakt 600 μL av koncentrerad bakteriell inokulatet (t.ex., 1 × 1010 CFUs/mL) med pipett till en kryogen 1.6-mL-injektionsflaska innehållande exakt 300 μL av sterila H2O och 300 μL av steril glycerol; Blanda och förvara vid-80 ° C.
Obs: Glycerol behövs för lagring kan förbrylla experimentella resultat och orsaka överdödligheten så är det nödvändigt att tvätta den. - När du är klar för användning, Tina provet under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Överför 1 mL till en 50 mL konisk injektionsflaska, lägga till 9 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och centrifugera vid 4000 × g i 5 min till pellet bakterierna. Aspirera supernatanten och återsuspendera förutbestämda mängden CFUs (1 mL × fryst lager koncentration i CFUs/mL) i en lämplig volym av PBS till önskad koncentration för det smittsamma inokulatet.
2. anesthetizing möss
- Ketamin/xylazin
Obs: Anestesi med ketamin/xylazin har en lång varaktighet, som erbjuder tillräckligt med tid för forskaren som är nytt på denna teknik för att slutföra förfarandet för inympning innan musen vaknar.- Förbereda 10 mL av injicerbar lösning genom att kombinera 8,5 mL av pharmaceutifcal grad PBS, 1 mL 100 mg/ml stamlösning av ketamin (slutliga koncentrationen 10 mg/mL), och 0,5 mL av 20 mg/mL xylazin stamlösning (slutlig koncentration 10 mg/mL).
- Administrera 10 μL/g av intraperitoneal (IP) injektion (t.ex., 250 μL för en 25-g-mus).
- Tillämpa oftalmologiska salva i ögonen hos de möss som bedövas med ketamin/xylazin eftersom deras ögon är benägna att skada under längre perioder av anestesi.
- Placera musen i en bur och övervaka tills den vaknar upp ur narkos.
Obs: Djuret bör inte lämnas utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning.
- Isofluran
Obs: Möss snabbt vakna upp från isofluran-inducerad anestesi efter att ha avlägsnats från induktion kammaren, så denna metod av anestesi bör endast användas efter att bli skickliga på att förfarandet för inympning.- Placera de naiva möss i en lämplig storlek induktion kammare med syre flyter.
- När kammaren är förseglade avstängning, söva möss med en precision spridare att lägga till isofluran på 4% (v/v) för minst 5 min; bekräfta anestesi genom att ta bort en mus från induktion kammaren och mäta hur lång tid det tar för att vakna upp ur narkos (~ 60 s).
Obs: Tänk på att anestesi kan variera baserat på institutionella riktlinjer och vissa djur kan behöva mer än 5 min att bli helt sövd. - Underhåll av anestesi för upp till 10 min genom justering av isofluran koncentrationen till 2-3%. om varaktigheten för anestesi är > 15 min, tillämpa oftalmologiska salva i ögonen hos sövda möss.
- Placera musen i en bur och övervaka tills den vaknar från anestesi, som i steg 2.1.
3. ympning/infekterar möss
- Avbryta en sövda mus, hänger det av dess övre framtänder på en stark, tunn sträng (t.ex., tandtråd) säkrade till ett fast objekt på en höjd ungefär dubbelt musens kroppslängd (t.ex., 20 cm) ovan Rörelseresultat ytan (t.ex. arbetsbänk).
- Dra försiktigt av musens tungan ur sin mun med steril, blunt-slutade pincett. Överföra tungan till en steril, handskar finger för att förhindra oavsiktlig krossning av musens tungan. Håll tungan utanför munnen, ger dig tillgång till orofarynx och förhindra att svälja av inokulatet sida.
- Medan du håller musens tungan, placera den 50-μL inokulatet (bakteriesuspension) i orofarynx med hjälp av en mikropipett; orofarynx är beläget vid korsningen av munhålan och svalget mot bakre delen av munnen.
Obs: Det är mycket viktigt att endast leverera vätska genom pipettering till första stoppet på mikropipett. Musen kommer att sluta andas för några sekunder när inokulatet placeras i orofarynx; så småningom, kommer att reflexiv strävan orsaka musen för att inhalera bakteriesuspensionen, indikeras av det distinkta knastrande ljudet vätska kommer in i lungorna, vilket resulterar i lunginflammation infektion. - Om inokulatet inte placeras långt tillbaka nog att blockera normala andning, nyp ihop näsborrarna med pincett att tvinga reflexiv aspiration genom munnen och efterföljande inandning av inokulatet.
- Efter inympningen, frigöra tungan, ta bort musen från strängen suspension, placera den i en bur och övervaka tills den vaknar från anestesi, som i steg 2.1.
4. övervaka sjukdomsprogression
Obs: På grund av djurens lidande, olika indikatorer bör användas för att indikera när möss blir döende; eutanasi bör utföras efter detta fastställande, i enlighet med en tidigare godkänd IACUC protokoll; olika markörer för moribundity inkluderar kroppstemperatur, viktminskning, utseende, gånganalys och andra biomarkörer som kan erhållas från blod (t.ex. via iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
- Euthanize möss enligt tidigare godkända IACUC protokoll (t.ex., CO2 följt av cervikal dislokation).
- Ta bort lungorna från euthanized mus genom att skära i luftstrupen, lungartären och pulmonell ven nära lungorna.
- Mikroskopi
- Placera den lungorna (eller del) i en specimen mögel.
- Fyll preparatet mögel med Optimal styckning temperatur (O.C.T.) förening, helt dränka vävnaden.
- Frysa provet vid-80 ° C.
- Skicka provet till en patologi laboratorium att avsnitt och montera på diabilder för mikroskopi.
- Bakteriella börda
- Väga lungvävnaden på en Analysvåg.
- Överföra lungvävnad till 50 mL koniska injektionsflaska innehållande 2-5 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (beroende på storleken av vävnaden).
- Homogenisera lungvävnaden med en vävnad Homogenisatorer.
- Utföra seriespädningar av Homogenatet i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att uppnå cirka 1000 CFUs/mL, baserat på förväntade bakteriell börda i lungorna.
- Exempelvis om 1 × 109 CFUs/mg förväntas, utföra tre 1: 100 utspädningar: överföra 100 μL av Homogenatet till 9,9 mL PBS och vortex; Detta är den första spädningen 1: 100. Överför 100 μL av den första spädningen 1: 100 till 9,9 mL PBS och vortex; Detta är den andra utspädningen 1: 100. Överför 100 μL av andra 1: 100 utspädning till 9,9 mL PBS och vortex; Detta är den tredje och sista 1: 100 utspädningen.
- Om bakteriell börda i lungorna är okänd, utföra en rad utspädningar att fånga det förväntade intervallet.
- Platta dilution(s) på sterila agar.
- Förbereda sterila Tryptic Soy buljong (TSB) med agarplattor (TSA): kombinera 30 g av TSB, 15 g agar, 1 L vatten, blanda med en magnetisk omrörare och Värm till kokpunkten vid ~ 100 ° C i 5 min. Tillåt svalna och sedan autoklav på flytande cykel för 15 min. Tillåt svalna till ~ 55 ° C, överföring 10 mL färsk Ånghärdad TSA till sterila petriskålar, och låt svalna till rumstemperatur. Låt torka på bänkmonterade för 2-5 d eller avslöjats under en biosäkerhet skåp i 10 min.
- Överför 100 μL spädning till en petriskål som innehåller steril TSA och spridda över TSA med en spridare eller glaskulor.
- Lagra petriskål över natten vid 37 ° C i en fuktad inkubator (dvs, 37 ° C inkubator som innehåller en avtäckta 1-litersbägare fylld med vatten)
- Bestämma CFUs/mL lung Homogenatet baserat på agar plätering (t.ex.100 CFUs på TSA tallrik med 100 μL av tredje och sista utspädning ovan skulle vara 100 CFUs/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
- Beräkna CFUs/mg lungvävnad baserat genom att dividera CFUs/mL lung Homogenatet av mg lunga vävnad/mL Homogenatet (t.ex., om de prov som beskrivs ovan används 100 mg av lungvävnad homogeniseras i 5 mL PBS och sedan 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 CFUs/mg).
- Mikroskopi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att noggrant följa protokollet, kan reproducerbar och robust data lätt erhållas. Det är viktigt att strikt följa en anpassad inokulum förberedelse protokoll för experiment för att jämföras med en varandra. Det är också viktigt att korrekt hantera möss under förfarandet för infektion. Var noga med att placera möss i en anestesi kammare saknar isofluran. Möss kommer panik om de placeras i en kammare som har varit förfylld med isofluran och kan uppleva överskott stress, som möjligen kan äventyra experimentella resultat. Efter att säkra behållare locket, långsamt introducera isofluran genom att stegvis öka dess koncentration från 0% till 4% (v/v); hastigt administrering av isofluran kan också orsaka möss till panik. När mössen blir medvetslös, minska isofluran koncentrationen till 2-3% (v/v) och tillåta dem att stanna kvar i kammaren för en ytterligare några minuter. Vid denna punkt, möss är redo att bli smittad (figur 1).
Ta bort musen från anestesi kammaren och avbryta det av dess övre framtänder att tillåta åtkomst till tungan (figur 2). Användning blunt-slutade pincett att försiktigt dra ut tungan (figur 3) sedan överföra pincett-held tungan till en steril, behandskade fingrar (figur 4) för att förhindra trauma till musens tungan. Med tungan utanför munnen, överföra det 50-µL inokulatet till orofarynx (figur 5). Här är det mycket viktigt att endast leverera vätska genom pipettering till första stoppet på mikropipett. Fortsätter till den andra hållplatsen kan införa en stor bubbla i den inokulum som stör infektionen.
När infektionen är komplett, finns det en myriad av alternativ för testning möss. För patogenes studier, man kan jämföra infekterade till infekterad vävnad (figur 6). Om analysera effektiviteten av romanen therapeutics, du kan ta bort lungorna och har dem sektioneras och målat. Detta kan göras vid en tidpunkt eller vid flera tidpunkter att Visa sjukdomsprogression (figur 7).
Ett annat alternativ är att bedöma den bakteriella bördan i lungorna av infekterade möss. Detta görs genom att ta bort lungorna, överföra till en injektionsflaska innehållande en känd volym av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, sedan homogenisering med en vävnad Homogenisatorer (sköljning mellan varje prov att förhindra korskontaminering). Plätering seriespädningar av lung Homogenatet på näringsrika agar möjliggör beräkning av den CFUs/mL för varje lunga Homogenatet och därefter CFUs/mg lungvävnad (figur 8). Detta, kan alltför göras vid en tidpunkt eller vid flera tidpunkter att Visa sjukdomsprogression.
Det finns otaliga andra analyser som kan utföras, inklusive cytokin analyser (figur 9), sepsis biomarkörer av iSTAT (figur 10), flödescytometri att undersöka cell yta markörer, cellular profilering, RNAseq, m.m.
Figur 1 : Att bestämma LD100. Det är nödvändigt att infektera möss med olika inokulat koncentrationer att avgöra den LD100. Här, den inokulum 2 × 108 CFUs/mus är för hög, 5 × 10-7 och 2 × 107 är för låga och 1 × 108 är lagom.
Figur 2 : Hänga möss av övre framtänder. När mössen är sövda, ta bort en mus från induktion kammaren, (A) använda pincett för att dra ut en slinga av sträng säkrade 20-30 cm ovanför arbetsytan, (B) flytta strängen bakom musens övre framtänder, (C) säkerställa strängen är säkrad bakom övre framtänder, och (D) låt musen hänga av dess övre framtänder på slingan av sträng.
Figur 3 : Dra tungan ur mun med pincett och överföring grepp till behandskade fingrar. Efter hängande musen av dess övre framtänder, (A) använda pincett för att ta försiktigt tag musens tungan, (B) dra försiktigt ut tungan, ()(C) noggrant föra tungan från tången behandskade fingrar och förhindra trauma till musens tunga, och (D) hålla tungan på plats med behandskade fingrar. Se till att tillräckligt tryck så att tungan glider tillbaka in i munnen men inte så mycket tryck att trauma inträder. Tungan ska hållas utanför mal och åt sidan för att möjliggöra mikropipett tillgång i nästa steg. Vid denna punkt, är musen redo för infektion.
Figur 4 : Infektera musen. Att upprätthålla tungan utanför munnen, Använd en mikropipett för att överföra det 50-µL inokulatet till orofarynx. Sätt Pipettera inne i munnen på baksidan av tungan och fördela bakteriesuspensionen, bara gå till första toppen på mikropipett; Gå inte till den andra hållplatsen som detta kan införa en stor bubbla i den inokulum som kan störa fullständig aspiration.
Figur 5 : Mikrograf av friska (oinfekterade) vs infekterad lungvävnad. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning av lung sektioner före och efter orofaryngeal aspiration av A. baumannii, som recapitulates rutten av ventilatorassocierad pneumoni (VAP), vilket resulterar i döden vanligtvis inom 1-3 dagar och betydande alveolär inflammation som kan ses här.
Figur 6 : Bedöma bakteriell bördan; omtryckt och modifierad med tillstånd14 . Efter infekterar möss, bort lungorna genom dissektion efter framgångsrika dödshjälp i enlighet med tillämpliga IACUC protokollet. Samla in massan av lungvävnad, överföra till en injektionsflaska innehållande en känd volym (2-5 mL) av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och homogenisera med en vävnad Homogenisatorer. Var noga med att skölja homogenisatorn med etanol och sterila PBS mellan varje prov att förhindra korskontaminering. Utföra seriespädningar av lung Homogenatet och tallrik olika spädningar på näringsrika agar och inkubera lämpligt för valda patogenen. Beräkna den CFUs/mL för varje lunga Homogenatet baserat på CFUs/platta × utspädning och sedan dividera med mg lunga vävnad/mL lung Homogenatet. Detta kan göras vid en tidpunkt eller vid flera tidpunkter att Visa sjukdomsprogression. Medianer visas med felstaplar som representerar interquartile spänner. p < 0,05 behandlat vs. obehandlad grupp.
Figur 7 : Mikrograf infekterad lungvävnad, obehandlad vs behandlade; omtryckt och modifierad med tillstånd14 . Efter infekterar möss, bort lungorna genom dissektion efter framgångsrika dödshjälp i enlighet med tillämpliga IACUC protokollet. På lämpligt sätt bevara vävnad (e.g., nedsänkt i Optimal skärtemperatur gel och fryst vid-80 ° C) sedan skicka till patologi lab eller annan kunnig individ för snittning och färgning. Detta kan göras vid en tidpunkt eller vid flera tidpunkter att Visa sjukdomsprogression.
Figur 8 : Cytokin analys; omtryckt och modifierad med tillstånd14 . För att analysera cirkulerande cytokiner, upphandla tillräckligt blod (t.ex., 50 µL via svans Hack), låt koagulera i 30 min i rumstemperatur, Centrifugera vid 1000 × g under 10 minuter vid 4 ° C, och samla serum supernatant. Serumet kan sedan analyseras med Luminex multiplex för cytokiner. Detta kan göras vid en tidpunkt eller vid flera tidpunkter att Visa sjukdomsprogression. Medianer visas med felstaplar som representerar interquartile spänner. p < 0,05 behandlade vs. obehandlad grupp vid samma tid-punkt.
Figur 9 : Sepsis biomarkörer; omtryckt och modifierade med tillstånd14 . Att analysera sepsis biomarkörer, upphandla 75 µL blod (t.ex., via svans Hack) och snabbt överföra till en iSTAT patron som testar för önskad analyter. Detta kan göras vid en tidpunkt eller vid flera tidpunkter att Visa sjukdomsprogression. Medianer visas med felstaplar som representerar interquartile spänner. p < 0,05 behandlade vs. obehandlad grupp vid samma tid-punkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att vara säker, är möss inte miniatyr människor. Resultat från musmodeller måste betraktas i sammanhang och därefter tolkas för tillämplighet till människa, baserat på skillnader och likheter mellan de två arter6. Det är också viktigt att välja lämpliga mus stam som vissa är mer mottagliga för vissa infektioner än andra. Detsamma gäller den patogen stam val16.
Det är viktigt att utföra infektioner i ett krävande och högt reproducerbart sätt. Inokulat kan vara dödliga för möss på ett värde än ofarliga på ens 90% av detta värde. Därför är det absolut nödvändigt att alla villkor som anges i detta protokoll återges på exakt samma sätt, särskilt när du förbereder inokulatet och när smittar. Dessutom kommer varje patogener orsaka sjukdom vid en unik inokulum. Det är därför nödvändigt att genomföra pilotförsök för att bestämma det lämpliga inokulatet för varje stam av patogen och i varje stam av musen.
Med gramnegativa bakterier är ett inokulum av ≤5 × 108 CFUs/mus tillräcklig för att orsaka död i virulenta stammar. Det rekommenderas att inte använda stammar som är icke-dödande på ≤1 × 109 CFUs/mus eftersom de föreslår tvivelaktig relevans för patogenes baserat på blotta mängden material som släpps in i lungorna16.
Jämfört med andra, det finns mycket få tekniska komplikationer för orofaryngeal aspiration lunginflammation modellen och reproducerbarhet är långt större. Endast en mindre komplikation av modell resultaten om ytspänning runt de 50-µL inokulatet placeras i orofarynx möjliggör nasal respiration, utgör hinder för aspiration-orsaken till infektion. I det här fallet tvingar helt enkelt nyper näsborrarna med pincett reflexiv aspiration genom munnen och efterföljande inandning av inokulatet inducera infektiös lunginflammation. Detta är dock ett tekniskt fel av teknikern, som är lätt undvikas med minimal träning.
När det gäller dess relevans för mänskliga sjukdomar är en begränsning av denna modell, liksom andra modeller av gramnegativa bakteriella infektioner, snabbhet med utvecklingen av sjukdomen. Människor är sällan infekterade med en stor bolus av en bakteriesuspension, varför möss så snabbt utvecklas till sjukdom. Ändå, alla FDA-godkända behandlingar genomgå sådan translationell forskning filmvisningar i djurmodeller att bedöma deras terapeutiska potential innan du går till kliniska prövningar på människor. Ironiskt nog, snabbhet med modellen är också en attraktiv funktion, eftersom det kan ge klarhet på terapeutisk effekt inom en kort tidsperiod.
Ingen murina modell är perfekt, men detta är en modell med förmågan att troget efterlikna infektionsväg och patogenes för mänskliga sjukdomar och bedöma effektiviteten hos potentiella therapeutics, vilket gör det möjligt för snabb översättning av nya terapier som desperat behövs i kliniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar vid National Institutes of Health [Grant nummer R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 och R42 AI106375 i BS] och US Food and Drug Administration [kontrakt HHSF223201710199C till BML].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BD | 214530 | Combine with TSB to make TSA |
| Beads, Borosilicate Glass | Kimble | 135003 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Beaker, 250 mL | Pyrex | 1003 | Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula |
| Centrifuge | Sorvall | ST 40R | Capable of 4,000×g at 4°C |
| Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | Accommodates up to 5 mice |
| Cryomold, Intermediate Size | Sakura Tissue-Tek | 4566 | Disposable vinyl specimen molds, 15×15×5 mm |
| Dental Floss | Oral-B | 37000469537 | Tie to stable post approx. 6" above table height |
| Forceps | VWR | 82027-440 | Used to gently pull tongue out of mouse's mouth |
| Homogenizer for Lung Tissue | Omni International | TM125-115 | Autoclave before first use; rinse between samples |
| Isoflurane for Anesthesia | Abbott | 10015516 | Alternative drug can be used; modify procedure accordingly |
| iSTAT Cartridge | Abbott | 03P79-25 | Various cartridges are available to suit your needs |
| Ketamine, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL |
| Ointment for Eyes | Akorn | Tears Renewed | Avoid touching eye with tip of dispenser |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Used to freeze lung samples at -80 °C to prepare for pathology sectioning |
| Petri Dish | VWR | 25384-302 | Polystyrene, disposable, sterilized, 100×15 mm |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CM | Dulbecco's PBS without calcium and magnesium |
| Pipette Tips, 200-μL | VWR | 10017-044 | Autoclave before use |
| Pipetter, 200-μL | Gilson | Pipetman P200 | Autoclave and calibrate before use |
| Spreader, Bacterial Cell | Bel-Art | F377360006 | Sterilize by baking or autoclaving before each use |
| Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter × 38.1 mm Length | VWR | 58948-150 | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | BD | 211822 | Combine with Agar to make TSA |
| Vial, Conical, Sterile, 50 mL | Corning | 431720 | Used for preparing bacterial inocula |
| Vial, Conical, Sterile, 500 mL | Corning | 431123 | Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula |
| Vial, Cryogenic, 2.0 mL | Corning | 430659 | Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula |
| Xylazine, 20 mg/mL | Akorn | AnaSed Injection | Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL |
References
- Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
- Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
- Medina, E.
- Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J.
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252 (2015).
- Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
- Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
- Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
- Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
- Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
- Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
- Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
