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Immunology and Infection

लेबल-रोगी से मुक्त न्युट्रोफिल संवर्धन-व्युत्पन्न Airway स्राव का उपयोग बंद पाश Inertial Microfluidics

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57673
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,2, 3,5, 1,2,4
1Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Medicine, University of Pittsburgh, 4Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 5Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh

Summary

इस शोध में, हम एक लेबल-मुक्त सर्पिल inertial microfluidics के बंद लूप आपरेशन का उपयोग नैदानिक airway स्राव से न्युट्रोफिल जुदाई विधि प्रदर्शित करता है । प्रस्तावित विधि विभिंन श्वसन रोगों के लिए इन विट्रो परख में नैदानिक विस्तार होगा ।

Abstract

Airway स्राव प्रतिरक्षा से संबंधित कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में होते हैं, जैसे, न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, और लिम्फोसाइटों, जो एक प्रमुख संसाधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है फेफड़े के रोगों की एक किस्म का मूल्यांकन, दोनों अनुसंधान और नैदानिक प्रयोजनों के लिए. हालांकि, रोगी बलगम की विषम और चिपचिपा प्रकृति के कारण, वहाँ वर्तमान में कोई विश्वसनीय पृथक्करण विधि है कि रोगी airway स्राव में मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं को नुकसान नहीं करता है. इस शोध में, हम एक नमूना तैयारी विधि है कि रोगी की प्रतिरक्षा आकलन के लिए inertial microfluidics का उपयोग करता है परिचय । नैदानिक नमूनों की विषम द्रवित गुणों की परवाह किए बिना, प्रस्तावित विधि airway स्रावी नमूनों से न्यूट्रोफिल के ९५% से अधिक ठीक हो जाता है कि १,००० पतला कर रहे हैं-साफ खारा के मिलीलीटर के साथ गुना. प्रारंभिक नमूना जलाशय, एक उच्च एकाग्रता, वसूली, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की शुद्धता के लिए केंद्रित उत्पादन स्ट्रीम reसंचारित द्वारा प्रदान की जाती हैं; संचलन एक व्यापार माना जाता है-एक सिरिंज inertial microfluidics के आधार आपरेशन चलाने के लिए बंद । सर्पिल microfluidics के बंद लूप आपरेशन शारीरिक या रासायनिक अशांति के बिना ल्यूकोसाइट्स प्रदान करता है, के रूप में phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) द्वारा प्रदर्शन-हल elastase के प्रेरित न्यूट्रोफिल रिलीज ।

Introduction

के बाद से कोशिकाओं airway स्राव में बलगम की एक बड़ी राशि में समझाया जाता है, ल्यूकोसाइट्स के कार्यात्मक आकलन एक इन विट्रो परख में बाधा गया है । Dithiothreitol (डीटीटी) सबसे आम lysis बफर अलग कर देना और homogenize विश्लेषण और मध्यस्थों का पता लगाने के लिए थूक कोशिकाविज्ञान जबकि अलग कोशिकाओं1,2की संतोषजनक व्यवहार्यता प्रदान करने के लिए है । हालांकि, डीटीटी airway न्यूट्रोफिल की सतह-बाउंड एंटीजन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप elastase और myeloperoxidase (MPO) रिलीज़2,3के रूप में न्युट्रोफिल फ़ंक्शन का विघटन होता है । इसलिए, मानव airway न्युट्रोफिल समारोह के कुछ अध्ययनों परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल, जो फुफ्फुसीय4की शारीरिक विशेषताओं का खुलासा नहीं हो सकता है के साथ आयोजित किया गया है । इस बीच, inertial microfluidics विभिंन रोगी से अलग कोशिकाओं में अग्रिम किया है5,6। inertial लिफ्ट बलों और डीन खींचें के बीच संतुलन उनके आकार, जो लेबल मुक्त कण जुदाई7की अनुमति देता है के अनुसार कण/ हमारे समूह पहले एक नमूना तैयारी विधि परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं के लिए शुरू की8,9, रक्त8में रोगजनकों, एक निलंबन संस्कृति से कोशिकाओं10,11, 12, और polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (PMNs) से रक्त13,14.

यहां, हम एक रोगी के airway स्राव से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तैयार करने के लिए बंद का उपयोग-पाश inertial microfluidics इन विट्रो परख में एक बहाव के लिए, जैसे न्युट्रोफिल elastase (NE) परख के रूप में एक प्रोटोकॉल परिचय । इस विधि दोनों उच्च एकाग्रता और वसूली प्रदान करता है, खासकर जब वहाँ एक महत्वपूर्ण ओवरलैप कक्ष/कण से जो कक्ष/कण-का-ब्याज है, जो सामांयतः नैदानिक नमूनों में मनाया जाता है की पार्श्व दिशा में है । भीतरी दीवार (IW) को परिचालित करके-बड़े कणों या कोशिकाओं को वापस इनपुट नमूना ट्यूब करने के लिए, कण या सेल के ब्याज मूल जलाशय में केंद्रित है, जबकि छोटे mucin समुच्चय के साथ पृष्ठभूमि तरल पदार्थ अपशिष्ट जलाशय के माध्यम से गुजरती हैं । नैदानिक नमूनों की विषम द्रवित गुणों के बावजूद, प्रस्तावित विधि लगातार airway स्रावी नमूनों से न्यूट्रोफिल के ९५% से ऊपर है कि १,००० पतला कर रहे है-एक साफ खारा समाधान (~ 1 एमएल) के साथ गुना से उबरने । इसके विपरीत, lysis विधि नमूना शर्त के आधार पर PMNs वसूली दरों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रस्तुत करता है । प्रस्तावित प्रोटोकॉल कोई शारीरिक या रासायनिक व्यवधान के साथ एक लेबल मुक्त तरीके से ल्यूकोसाइट्स कब्जा है, जो ंयूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के साथ चिकित्सकीय चुनौतीपूर्ण बायोमैट्रिक्स से नाजुक कोशिकाओं फसल की संभावना प्रदान करता है ।

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Protocol

नमूना संग्रह पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी # PRO16060443, PRO10110387) द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी प्रयोगों उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं ।

1. डिवाइस निर्माण और नरम लिथोग्राफी

नोट: मानक नरम लिथोग्राफी तकनीक15,16 polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

  1. बेस और इलाज एजेंट के एक 10:1 अनुपात में PDMS अग्रदूत मिक्स ।
  2. माइक्रो मशीनी एल्यूमिनियम मोल्ड पर PDMS के अग्रदूत मिश्रण के 30 ग्राम डालो (आयाम के लिए 1 चित्रा देखें) और PDMS के मिश्रण के लिए 20 जी १०० mm पेट्री डिश पर अग्रदूत ।
    नोट: पेट्री डिश को सपोर्टिंग लेयर के लिए PDMS (~ 3 एमएम) की मोटी फिल्म बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । PDMS के समर्थन परत microfluidics भर वर्दी भौतिक सतह गुण प्रदान करता है । वैकल्पिक रूप से, कांच स्लाइड पर एक पतली PDMS फिल्म इस्तेमाल किया जा सकता है । विशिष्ट चैनल आयामों के साथ मास्टर मोल्ड डिजाइन और एल्यूमीनियम शीट पर सूक्ष्म मिलिंग द्वारा गढ़े गया था । सर्पिल चैनल इस अध्ययन में इस्तेमाल एक 8-पाश सर्पिल microchannel एक प्रवेश और दो दुकानों के साथ, 8 मिमी से 24 मिमी कुशल आकार आधारित जुदाई के लिए बढ़ रही त्रिज्या के साथ था ।
  3. एक निर्वात desiccator में मोल्ड और पेट्री डिश प्लेस degas जब तक कोई बुलबुले सतह पर दिखाई दे रहे हैं, आमतौर पर 5-10 min. desiccator के लिए एक घर-निर्वात का उपयोग करें ।
  4. वैक्यूम छोड़ें और मोल्ड और पेट्री डिश को 1 h के लिए ९० ° c ओवन में रखें ।
    नोट: एक चूल्हा या अंय हीटिंग उपकरण के बजाय एक ओवन इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. मोल्ड और ओवन से पेट्री पकवान निकालें और यह 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  6. ध्यान से बाहर रूपरेखा में कटौती और एक 2 मिमी पंच का उपयोग कर डिवाइस पर द्रव का उपयोग छेद पंच ।
    नोट: पंच का आकार टयूबिंग या द्रव गाइड के आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
  7. डिवाइस और PDMS की मोटी फिल्म के चैनल पक्ष के लिए एक टेप का पालन करें, और धूल को दूर करने के लिए संदंश के साथ ध्यान से छील ।
  8. डिवाइस और सादे PDMS के दोनों चैनल पक्ष हवा प्लाज्मा और सादे PDMS की तैयार समर्थन परत के साथ बांड के साथ व्यवहार (1a आंकड़ा) ।
  9. ५० mm x ७० mm ग्लास स्लाइड पर चिप लगाएं और बॉन्डिंग स्ट्रेंथ को बढ़ाने के लिए इसे एक ७० डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें ।

2. यांत्रिक रूप से हवादार रोगियों से सांस स्राव संग्रह

नोट: सांस स्राव सामान्य दिनचर्या airway देखभाल के दौरान यांत्रिक रूप से हवादार रोगियों से प्राप्त किया जा सकता है एक पारंपरिक तरीके से संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानक, वयस्क हवादार रोगी को समायोजित. नमूनों को डी-पहचान लिया गया और प्रोसेसिंग के लिए तुरंत भेजा गया ।

  1. सांस आकांक्षा संकेत दिया जाता है, तो airway स्राव निकालने के लिए एक कैथेटर का उपयोग करें ।
  2. endotracheal ट्यूब में कैथेटर सावधानी से आधा रास्ता अग्रिम और एक पूर्व से भर 10 मिलीलीटर सिरिंज से ०.९% बाँझ सामान्य खारा के 5 मिलीलीटर टपकाना.
  3. कैथेटर पूरी तरह से उन्नत है, या प्रतिरोध से मुलाकात की है, स्राव महाप्राण और एक बाँझ थूक संग्रह कंटेनर में इकट्ठा ।
  4. एक बाँझ थूक कंटेनर में सांस स्राव के 10 मिलीलीटर ले लीजिए और यह बर्फ पर जगह है । प्रसंस्करण के लिए तुरंत नमूने भेजें ।

3. सांस स्राव नमूना तैयारी

नोट: सभी प्रयोगों उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट के तहत किया जाना चाहिए ।

  1. (एक 10x कमजोर पड़ने के लिए) एक प्लास्टिक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 9 मिलीलीटर में airway स्रावी नमूनों की 1 मिलीलीटर फैलाने । बलगम का नमूना homogenize करने के लिए एक कुंद पिपेट का प्रयोग करें ।
  2. एक ४० µm नायलॉन सेल छलनी के साथ मंदक तनाव बड़ा हिस्सा या रक्त के थक्के, जो microfluidics का उपयोग छेद या चैनल ब्लॉक कर सकते है हटाने के लिए । प्रसंस्करण के बाद बर्फ पर नमूना रखें ।
  3. पंजाबियों बफर की एक 100x मात्रा का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के मंदक फैलाने, एक 1, 000x पतला निलंबन में जिसके परिणामस्वरूप. पूरे पृथक्करण आपरेशन के दौरान बर्फ पर नमूना रखें ।

4. प्रायोगिक सेटअप

नोट: सभी प्रयोगों उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक सुरक्षा कैबिनेट के तहत किया जाना चाहिए ।

  1. द्रव गाइड के साथ PDMS चिप को इकट्ठा करने के लिए चार सर्पिल microchannels (आंकड़ा 1b) में से प्रत्येक के लिए समान प्रवाह लागू होते हैं ।
    नोट: चार चैनलों parallelization द्वारा प्रवाह को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया, साथ ही मात्रा और परिणामी निलंबन के कोशिका घनत्व का अनुकूलन. द्रव गाइड बनाया गया है और स्पष्ट राल के साथ एक stereolithography प्रकार 3 डी प्रिंटर के साथ बनाया गया है । प्रवेश और तरल पदार्थ गाइड के आउटलेट बंदरगाह आपरेशन के दौरान कनेक्शन और स्थिर सीलिंग की आसानी के लिए महिला Luer connectors का उपयोग करें ।
  2. प्रवेश करने के लिए एक 1/16 इंच पुरुष Luer संबंधक कनेक्ट, भीतरी दीवार (IW) आउटलेट, और बाहरी दीवार () तरल पदार्थ गाइड के आउटलेट बंदरगाह और नमूना निलंबन करने के लिए एक सिलिकॉन टयूबिंग कनेक्ट ।
  3. प्रवेश के प्रत्येक छोर और दुकानों के लिए कुंद युक्तियां डालें नमूना जलाशय के नीचे तक पहुंचने के लिए ।
  4. प्रवेश टयूबिंग के साथ सिकुड़नेवाला पंप कनेक्ट ।
  5. नमूना जलाशय में प्रवेश टयूबिंग और IW आउटलेट टयूबिंग के अंत प्लेस और अपशिष्ट जलाशय (चित्रा 1C, घ) में दुकान टयूबिंग के अंत जगह ।
  6. नमूना जलाशय में कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना फ़िल्टर्ड पंजाबियों की ५० मिलीलीटर ट्यूब प्लेस ।
  7. एक कम प्रवाह दर पर पम्पिंग शुरू (~ 1 एमएल/मिनट) के लिए डिवाइस प्रधानमंत्री ।
    नोट: जब बुलबुले चैनल में कब्जा कर लिया, नोचना के साथ चैनल के शीर्ष को अस्थिर करने के लिए धक्का और हवा के बुलबुले को खत्म कर रहे हैं । जब डिवाइस पूरी तरह से बफर समाधान के साथ भरा है, airway स्राव नमूना ट्यूब तैयार करने के लिए पंजाबियों ट्यूब बदल जाते हैं ।
  8. नमूना जलाशय में रखा जाता है जब नमूने, सिकुड़नेवाला पंप पर स्विच और 4 एमएल/मिनट पर प्रवाह दर निर्धारित (चित्रा 1C, डी).
  9. जब नमूना मात्रा निर्दिष्ट खंड (~ 1 एमएल) तक पहुंच जाता है, कार्रवाई को रोकने और सिलिकॉन टयूबिंग डिस्कनेक्ट ।
    नोट: प्रस्तावित विधि मंदक की एक बड़ी मात्रा को कम करने में अधिक कुशल है (> 50 एमएल) एक माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब मात्रा (~ 1 मिलीलीटर) (चित्रा 2) में ।

5. फ्लो Cytometry एनालिसिस

नोट: पृथक्करण विधियों (microfluidics और lysis) की तुलना करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ प्रवाह cytometry का उपयोग किया गया था ।

  1. Add fluorescein isothiocyanate (FITC)-संयुग्मित माउस एंटी-ह्यूमन CD66b मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और allophycocyanin (APC)-संयुग्मित माउस एंटी-ह्यूमन CD45 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी करने के लिए प्रारंभिक निलंबन (चरण ३.३) और परिणामी निलंबन (चरण ४.९) (२०० µ l प्रत्येक एंटीबॉडी के अनुपात में) 1:25 वी/
  2. 30 मिनट के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन ।
  3. PMNs को यों तो एक प्रवाह cytometer पर दोनों नमूनों का विश्लेषण करें ।
    नोट: जनसंख्या कि FITC-APC डबल पॉजिटिव, CD66b पॉजिटिव और CD45 पॉजिटिव माना जाता था न्यूट्रोफिल । पुनर्प्राप्ति इनपुट और परिणामी निलंबन की कुल कक्ष संख्याओं के अनुपात द्वारा परिकलित किया गया था ।

6. NE रिलीज विश्लेषण

नोट: microfluidics और lysis विधि द्वारा पृथक न्युट्रोफिल की कार्यक्षमता की तुलना करने के लिए, एक NE परख किट का इस्तेमाल किया गया था ।

  1. पमा जोड़ें (परख किट में प्रदान की) प्रत्येक परिणामी निलंबन (४.९ कदम पर प्राप्त) ५० एनएम के अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  2. 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन
  3. 10 मिनट के लिए ३०० x g पर निलंबन केंद्रापसारक ।
  4. एक ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए प्रत्येक supernatant के 10 µ एल स्थानांतरण (परख किट में प्रदान की) ।
    नोट: एक सपाट नीचे और काले polystyrene के साथ एक ९६-अच्छी तरह से microplate के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. जोड़ें ९० µ पतला परख बफर के एल (परख किट में प्रदान की) के लिए एक अच्छी तरह से ।
  6. elastase सब्सट्रेट के 10 µ l जोड़ें (Z-ाला-अला-ाला-ाला 2Rh110, परख किट में प्रदान की).
  7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर १.५ घंटे के लिए मशीन ।
  8. ९६-खैर थाली ४८५ एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और ५२५ एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में एक fluorometer का उपयोग कर पढ़ें ।
    नोट: ण् का स्तर प्रवाह cytometry विश्लेषण से PMN गणना द्वारा विभाजित किया गया था.

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Representative Results

हम दोनों डीटीटी mucolysis और microfluidics पृथक्करण (चित्रा 3ए) के साथ पारदर्शी प्रतिरक्षा सेल निलंबन हासिल की । Microfluidics पृथक्करण एकत्र ४.४० x 105 PMNs औसत पर (२.१ x 104 से ५.६० x 105 PMNs, n = 6) airway स्रावी नमूनों से पतला १,०००-गुना (५० मिलीलीटर कुल मात्रा) 1 मिलीलीटर में साफ निलंबन । प्रारंभिक मंदक की तुलना में, ९४.०% PMNs (CD66b+/CD45+) एक छोटी मात्रा में बरामद किए गए, लगातार 6 नैदानिक नमूनों पर । हालांकि, डीटीटी mucolysis विधि एक ५३.५% पुनर्प्राप्ति औसत पर महत्वपूर्ण नमूना-से-नमूना रूपांतरों के साथ दिखाया (३०.८-९६.०%) (चित्र बी) ।

अगले, elastase के रिलीज के एक सबूत के रूप में एक वाणिज्यिक NE परख किट के साथ की जांच की थी अवधारणा । बाहरी उत्तेजना के बिना, mucolytic विधि द्वारा तैयार नमूना microfluidics विधि से नमूने से एक उच्च NE स्तर दिखाया । पमा दोनों microfluidics और mucolytic पृथक्करण तरीकों से परिणामी निलंबन के लिए NE रिलीज़ को ट्रिगर करने के लिए जोड़ा गया था । हम 6 विभिंन रोगियों से airway स्राव के नमूनों के साथ प्रत्येक विधि का परीक्षण किया । microfluidics के साथ अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं को बरकरार कार्यशीलता प्रस्तुत, पमा उत्तेजना द्वारा NE रिहाई की एक वृद्धि की राशि दिखा । दूसरी ओर, mucolytic पृथक्करण विधि द्वारा तैयार कोशिकाओं NE रिलीज (चित्रा 3सी) की एक असंगत वृद्धि दिखाई ।

Figure 1
चित्रा 1: सर्पिल microfluidic डिवाइस और प्रयोगात्मक सेटिंग्स. (क) सर्पिल microfluidics की तस्वीर छवियों और (ख) द्रव अनुकूलक के साथ इकट्ठे हुए उपकरण । (ग) बंद लूप जुदाई सर्पिल inertial microfluidics का उपयोग कर के योजनाबद्ध आरेख । कण/सेल केंद्रित स्ट्रीम (IW आउटलेट) वापस मूल नमूना जलाशय में परिचालित करके, प्रतिरक्षा-संबंधित कोशिकाओं को एक छोटी मात्रा में केंद्रित किया गया था, जबकि पृष्ठभूमि द्रव mucin समुच्चय और लघु RBCs युक्त लगातार थे बेकार ट्यूब के माध्यम से हटाया आउटलेट से जुड़े । (घ) प्रयोगात्मक सेटअप और एक 10 µm कण की फ्लोरोसेंट छवि, पथ (हरा) और सर्पिल चैनल के आउटलेट (ऊपरी दाएं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: airway स्राव नमूना तैयारी का योजनाबद्ध आरेख बंद लूप inertial microfluidics का उपयोग कर. नैदानिक प्रेरित airway स्राव 1 में यांत्रिक रूप से फैलाया, बफर समाधान के 000x मात्रा. मंदक microfluidics द्वारा केंद्रित है, स्पष्ट पृष्ठभूमि के साथ सेल निलंबन के ~ 1 मिलीलीटर में जिसके परिणामस्वरूप है । Ryu एट अलसे अनुमति के साथ अनुकूलित., कॉपीराइट (२०१७) अमेरिकन केमिकल सोसायटी17। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: डीटीटी mucolytic विधि के प्रतिनिधि तुलना microfluidic पृथक्करण विधि के लिए । (क) microfluidic पृथक्करण के बाद सांस स्रावी नमूना (बाएँ) और सूक्ष्म छवि. (ख) मूल और परिणामी निलंबन के फोटोग्राफिक छवि । (ग) mucolytic और microfluidics विधियों के बीच PMN वसूली दरों की तुलना. (घ) microfluidics और डीटीटी mucolytic विधियों से पहले और बाद में पमा उत्तेजना द्वारा पृथक न्यूट्रोफिल की ण् रिहाई की तुलना. NE रिलीज काफी microfluidic जुदाई से नमूने पर पमा द्वारा ट्रिगर किया गया था (p < 0.0001) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

inertial microfluidics में, कण और कोशिकाओं को अपने आकार5,18,19,20के आधार पर एक माइक्रो चैनल में एक निश्चित पार्श्व स्थिति में स्थानीयकृत । डीन ड्रैग फोर्स और घुमावदार microchannel में inertial लिफ्ट बल के संयुक्त प्रभाव के कारण, बड़े कणों या न्यूट्रोफिल (> 10 µm) चैनल और छोटे कणों के अंदर स्थित हैं, बलगम समुच्चय, और मलबे से छोटे 6 µm तैनात हैं कुछ प्रवाह वेग की स्थिति पर चैनल के बाहर10,11,13,14.

हालांकि, वहां एक व्यापार है एकाग्रता और जुदाई की वसूली के बीच जब microfluidics का उपयोग, खासकर जब कण या ब्याज की कोशिका के जुदाई आकार रेंज अंय कोशिकाओं के साथ ओवरलैप/ हल कणों और कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए, जुदाई रेंज संकीर्ण होने की जरूरत है और प्रत्येक नमूना चलाने के लिए सूक्ष्म अवलोकन के साथ एक ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता है; यह विषम बायोमैट्रिक्स पर inertial microfluidics के उपयोग को सीमित करता है, जैसे airway स्राव ।

यहां, हम के लिए एक नैदानिक airway स्राव नमूना तैयारी विधि परिचय इन विट्रो में बंद लूप inertial microfluidics (आंकड़ा 1b, सी) का उपयोग कर परख । एक ध्यान केंद्रित आउटलेट के माध्यम से कण/सेल के संचलन द्वारा बंद लूप आपरेशन दोनों उच्च एकाग्रता कारकों और उच्च वसूली दर हासिल की । ओ आउटलेट बेकार ट्यूब में बहती है, और IW आउटलेट लगातार मूल नमूना ट्यूब को खिलाया जाता है । व्यास में 10 µm से बड़ा कोशिकाओं प्रारंभिक नमूना ट्यूब में रहते हैं, इस प्रकार, नमूना के सेल घनत्व में वृद्धि, जबकि पृष्ठभूमि द्रव अपशिष्ट ट्यूब करने के लिए समाप्त हो गया है. उच्च कमजोर पड़ने की दर की अनुमति देता है, मलबे और बलगम सहित पृष्ठभूमि द्रव की मंजूरी । इसके अलावा, रोगी नमूना की स्थिति की परवाह किए बिना, प्रस्तावित विधि समान रूप से अलग कर देना और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं ।

डीटीटी एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है mucin lysis बफर है कि proteoglycan1,21,22से अलग सेल सामग्री के लिए डाइसल्फ़ाइड बांडों से सट जाता है । हालांकि, डीटीटी कथित तौर पर सफेद रक्त कोशिका सतह एंटीजन, जो ल्युकोसैट समारोह2को प्रभावित कर सकते हैं के साथ हस्तक्षेप । हमारे अध्ययन में, सेलुलर सामग्री डीटीटी पृथक्करण द्वारा बरामद नमूनों भर असंगत थे, गैर वर्दी mucolytic दक्षता और फिल्टर की कॉलेस्ट्रॉल के कारण. यह छोटी मात्रा और अपेक्षाकृत मोटी airway स्रावी नमूनों के साथ प्रारंभिक नमूनों की तैयारी के लिए और अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है । दूसरी ओर, microfluidics का उपयोग कर विधि विषम रोगी नमूनों में सेल सामग्री के अनुरूप वसूली सक्षम (आंकड़ा 3सी). जैसा चित्र बीमें दिखाया गया है, हम लगातार मूल नमूना राज्य की परवाह किए बिना एक साफ बफर में airway स्राव की कोशिका सामग्री को अलग कर सकता है, यानी, खूनी, दृढ़, या पानी. पारंपरिक विधि की तुलना में, प्रस्तावित विधि बरामद नमूने में कम मलबा है, जो बहाव जैव रासायनिक विश्लेषण में मलबे के संभावित हस्तक्षेप को कम करता है ।

NE रिलीज दोनों संवर्धन विधियों (चित्रा 3 डी) द्वारा कब्जा कर लिया न्यूट्रोफिल के कार्यात्मक अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए जांच की थी । न्यूट्रोफिल NE रिलीज23,24,25के माध्यम से विदेशी कार्बनिक अणुओं को हटा दें । पमा सामान्यतः प्रयोग गरिएको न्यूट्रोफिल इन विट्रो२६. microfluidics और mucolytic (डीटीटी) विधियों द्वारा पृथक की गई कोशिकाओं को ५० एनएम के साथ उत्तेजित किया गया था । हम मानव airway स्रावी नमूनों के साथ प्रत्येक विधि का परीक्षण किया (P173 के रूप में लेबल, P174, P176, P177, P181, और P182). microfluidics द्वारा ध्यान केंद्रित नमूनों सभी 6 नमूनों के लिए पमा उत्तेजना द्वारा पूर्वोत्तर में वृद्धि दिखाई । इसके विपरीत, केवल 3 डीटीटी के नमूनों का इलाज पमा उत्तेजना के बाद बढ़ NE गतिविधि पैदा सकता है । इसके अलावा, डीटीटी mucolytic विधि द्वारा पृथक न्यूट्रोफिल microfluidics द्वारा पृथक न्यूट्रोफिल से ज्यादा उच्च आधारभूत गतिविधि दिखाई । इन परिणामों ने पूर्वोत्तर मशीनरी के संभावित रासायनिक अशांति को दिखाया, यानी, सतह के विघटन प्रतिजन2,3, जो पता चलता है कि microfluidics विधि के संरक्षण के संदर्भ में एक बेहतर तरीका है न्युट्रोफिल फ़ंक्शन भन्दा डीटीटी homogenization । प्रस्तावित पृथक्करण विधि भी एक स्वचालित और पूरी तरह से निहित तरीके से चल रही है, बाहरी वातावरण के संभावित खतरों के साथ रोगी के नमूनों के जोखिम को कम करने ।

हालांकि, प्रस्तावित विधि एक उच्च प्रवाह की दर की आवश्यकता है और, इसलिए, एक स्थिर द्रव कनेक्शन । इसके अलावा, सिकुड़नेवाला संचलन पंप के अंतर्निहित अस्थिरता के कारण, IW आउटलेट आयाम ओ आउटलेट आयाम से अधिक होना चाहिए, अंयथा प्रवाह समझौता किया जा सकता है । हमें उंमीद है कि प्रस्तावित विधि उच्च प्रवाह प्रदान अगर वहां एक संचलन पंप है कि एक अधिक स्थिर प्रवाह दर प्रदान कर सकते है होगा ।

नैदानिक airway स्रावों से न्यूट्रोफिल को कैप्चर करने के लिए एक पृथक्करण प्रोटोकॉल प्रदान करके, इस अध्ययन में प्रस्तुत विधि में श्वसन संबंधी रोगों, जैसे निमोनिया, अस्थमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस, और जीर्ण पर नैदानिक अनुसंधान के दायरे का विस्तार अपेक्षित है । प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग ।

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Disclosures

लेखकों ने यहां बताई गई तकनीक पर पेटेंट आवेदन दायर किया है ।

Acknowledgments

यह काम NIH/NIAID (R21AI119042) के साथ ही NIH U24 नमूना संयम परख कार्यक्रम (U24-AI118656) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS precursor Dow corning 184 SIL ELAST KIT 3.9KG 10:1 ratio of base and curing agent
VWR gravity convection oven VWR 414005-128 PDMS precursor to be cured in 90 deg.
100mm petri dish VWR 89000-324 Fabrication of PDMS Supporting layer
Harris Uni-core puncher Sigma-aldrich WHAWB100076 2mm diameter or other depending on the tubing size
Air plasma machine Femto Science Cute Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.
2” x 3” glass slide TED PELLA, INC. 2195 To support PDMS device
Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 Cole-Parmer EW-96410-14 Tubing for microfluidics and peristlatic pump
1/16 inch Luer connector, male Harvard apparatus PC2 72-1443 Connector for fluid guide
50mL Falcon tube Corning 21008-940 sample collection & preparation
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium Corning 45000-446  Buffer solution to dilute sample
Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm HALYARD HEALTH 22113 Tracheal seceation suction catheter
0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe BD PosiFlush NHRIC: 8290-306547 For tracheal seceation collection from the patients
SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL Simport 1176R36 Sterile sputum (airway secretion) collection container
Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL BD BD309604 To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
BD  Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok  Tip BD To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
40µm nylon cell strainer  Falcon 21008-949 To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.
Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) Cole-Parmer HV-07522-30 operation of microfluidics
BD LSR II flow cytometer BD Bioscience LSR II flow cytometer Quantification of cell recovery ratio
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody BD Bioscience 561927 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody BD Bioscience 561864 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Plate reader Thermo Fisher scientific Varioskan Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525
Neutrophil elastase assay kit Cayman Chemical 600610 Neutrophil functionality assessment
Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm PolyScience, Inc. 18140-2 Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३६ Inertial microfluidics airway स्राव लेबल-मुक्त सेल छँटाई विषम उपद्रवी न्युट्रोफिल संवर्धन रोगी नमूना तैयारी
लेबल-रोगी से मुक्त न्युट्रोफिल संवर्धन-व्युत्पन्न Airway स्राव का उपयोग बंद पाश Inertial Microfluidics
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Ryu, H., Choi, K., Qu, Y., Kwon, T., Lee, J. S., Han, J. Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics. J. Vis. Exp. (136), e57673, doi:10.3791/57673 (2018).

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