Summary
Bu araştırmada, sarmal atalet Havacilik kapalı çevrim işlemi kullanılarak klinik hava yolu salgıları bir etiket içermeyen nötrofil ayırma yöntemi göstermektedir. Önerilen yöntem çeşitli solunum yolu hastalıkları klinik vitro deneyleri artıracağı.
Abstract
Hava yolu salgıları hücreleri bağışıklık ile ilgili, Örneğin, nötrofiller, makrofajlar ve lenfositler, göğüs hastalıkları, araştırma ve klinik amaçlar için hem de çeşitli değerlendirmek için önemli bir kaynak olarak kullanılan çok sayıda içerir. Ancak, hasta mukus türdeş olmayan ve yapışkan doğası gereği yoktur Şu anda hasta havayolu salgı ana bilgisayar bağışıklık hücreleri zarar vermez hiçbir güvenilir ayrılma yöntemi. Bu araştırmada, hastanın bağışıklık değerlendirmesi için atalet Havacilik kullanan bir örnek hazırlama yöntemi tanıtmak. Klinik örneklerin heterojen Akışkan özellikleri ne olursa olsun, önerilen yöntem nötrofil % 95'den fazla 1000 kat daha fazla sulandırılmış hava yolu salgı örneklerinden kurtarır mililitre temiz salin ile. İlk örnek rezervuar konsantre çıktı akışına sirkülasyon tarafından yüksek konsantrasyon, kurtarma ve bağışıklık hücreleri saflığı sağlanmaktadır; devridaim bir ticaret-off tek tarafından işletilen şırınga tabanlı işleyişi ile atalet Havacilik olarak kabul edilir. Sarmal Havacilik kapalı çevrim işlemi lökosit fiziksel veya kimyasal karışıklık olmadan phorbol 12-myristate 13-asetat tarafından (PMA) gösterildiği gibi sağlar-elastase yayın sıralanmış nötrofil indüklenen.
Introduction
Hücreler mukus hava yolu salgıları içinde büyük miktarda içinde kapsüllü beri bir vitro tahlil tarafından lökositlerin işlevsel değerlendirme engel. Dithiothreitol (DTT) ayırmak ve balgam saytolojik analiz ve izole hücreler1,2tolere edilebilir canlılığı sağlarken arabulucu tespiti için homojenize için en yaygın lizis tampon var. Ancak, DTT hava yolu nötrofil, yüzey bağlı antijenleri ile elastase ve myeloperoxidase (MPO)2,3serbest bırakmak gibi nötrofil fonksiyon bozulma sonucu etkileyebilir. Bu nedenle, insan hava yolu nötrofil fonksiyon kaç çalışmalar pulmoner4fizyolojik özellikleri gösterebilir değil periferik kan nötrofil ile yapılmıştır. Bu arada, atalet Havacilik çeşitli hasta biomatrices5,6hücreleri yalıtmaya gelişmeler yaptı. Dean sürükle ve atalet Asansör güçleri arasında denge parçacık/hücre etiket içermeyen parçacık ayrılık7sağlar onların büyüklüğüne göre hizalar. Bizim grup daha önce dolaşımdaki tümör hücreleri8,9, kan8patojenler, hücreleri bir süspansiyon kültürü10,11, için bir örnek hazırlama yöntemi tanıtıldı 12ve polimorfonükleer lökosit (PMNs) kan13,14.
Burada, bir hastanın solunum yolu salgıları nötrofil elastase (NE) tahlil gibi bir aşağı akım vitro tahlil için kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak bağışıklık hücreleri hazırlamak için bir protokol tanıtmak. Özellikle hücre/olan kaldırılacak, hücre/parçacık-in-ilgi olduğunu klinik örneklerinde yaygın olarak gözlenen parçacık yanal yönünde önemli bir çakışma olduğunda bu yöntem yüksek konsantrasyon ve kurtarma, sağlar. İç duvar (IW) recirculating tarafından-arka plan sıvıları küçük müsin toplamları ile atık su deposu geçmek iken büyük parçacıkları veya giriş örnek tüp, partikül veya özgün depo, faiz hücre konsantreleri geri hücrelere duruldu. Klinik örnekler heterojen Akışkan özellikleri rağmen nötrofil 1000 kat daha fazla sulandırılmış hava yolu salgı örneklerinden % 95'i yukarıda önerilen yöntem tutarlı bir şekilde kurtarır temiz tuz solüsyonu (~ 1 mL). Buna karşılık, lizis Yöntem kurtarma oranları örnek koşula bağlı olarak bir geniş PMNs aralığı sunuyor. Önerilen protokol lökosit klinik olarak minimal invaziv yordamlar ile biyometrik zorlu hassas hücreler hasat imkanı sağlar hiçbir fiziksel veya kimyasal bozulma ile etiket içermeyen bir şekilde yakalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Örnek koleksiyon Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından (IRB # PRO16060443, PRO10110387) kabul edildi. Tüm deneylerin bir Biyogüvenlik ile uygun kişisel koruyucu ekipman kabin altında gerçekleştirilir.
1. cihaz imalat ve yumuşak litografi
Not: Standart yumuşak litografi teknikleri15,16 polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel oluşturmak için kullanılmıştır.
- 10:1 oranında temel ve kür Aracısı PDMS habercisi karıştırın.
- Mikro-işlenmiş alüminyum kalıp üzerinde 30 g PDMS habercisi karışımı dökün (bkz. Şekil 1 boyutları için) ve 20 gr 100 mm Petri kabına PDMS habercisi karışımı.
Not: Petri kabına destek katmanı için PDMS (~ 3 mm) kalın film yapmak için kullanılır. PDMS destekleyen tabakası Havacilik boyunca üniforma fiziksel yüzey özellikleri sağlar. Alternatif olarak, ince bir PDMS film cam slayt üzerinde kullanılabilir. Ana kalıp belirli kanal boyutları ile tasarlanmış ve mikro-freze alüminyum kağıda tarafından imal edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan sarmal bir 8-döngü sarmal microchannel bir ağzı ve verimli boyutlu tabanlı ayrılması için 24 mm için 8 mm artan yarıçapı ile iki çıkışları kanalıdır. - Hava kabarcığı yok yüzeyi genellikle 5-10 dakika desiccator bir ev vakum kullanıma görünür hale gelene kadar degas için bir vakum desiccator kalıp ve Petri kabına yerleştirin.
- Vakum yayın ve 1 h 90 ° C fırında kalıp ve Petri kabına yerleştirin.
Not: Bir ocağın veya diğer Isıtma araçları bir fırın yerine kullanılabilir. - Kalıp ve Petri kabına Fırından çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika soğumasını bekleyin.
- Dikkatle anahat kesebilir ve 2 mm zımba kullanarak aygıt üzerinde sıvı erişim delikler.
Not: Yumruk büyüklüğünde borulama veya sıvı Kılavuzu boyutuna bağlı olarak değişebilir. - Bir teyp cihazı kanal tarafında ve PDMS kalın film için uygun ve dikkatle forseps ile toz kaldırmak için soyma.
- Her iki kanal yan aygıt ve düz PDMS hava plazma ile ve bond düz PDMS (Şekil 1A) hazırlanan destekleyen tabakası ile tedavi.
- 50 x 70 mm cam slayt üzerinde çip yerleştirin ve bağ gücünü artırmak en az 30 dk. 70 ° C fırında yerleştirin.
2. trakeal salgı koleksiyonu mekanik havalandırmalı hastalardan
Not: Trakeal salgıları mekanik havalandırmalı hastalar normal rutin havayolu bakım sırasında standart, Yetişkin havalandırılmış hasta karşılamak için geleneksel yöntemler değiştiren bir protokolü kullanarak elde edilebilir. Örnekleri de-tespit ve hemen işleme için gönderdi.
- Trakeal aspirasyon belirtilmişse, bir kateter hava yolu salgıları ayıklamak için kullanın.
- Endotrakeal Tüpün içine kateter dikkatli bir şekilde yarı yolda ilerlemek ve 5 mL % 0,9 steril normal salin önceden doldurulmuş 10 mL şırınga üzerinden de aşılamak.
- Kateter tam olarak gelişmiş ya da direnç karşılanır, salgıları Aspire edin ve steril balgam koleksiyonu konteyner içine toplamak.
- 10 mL steril balgam kapsayıcısında salgıları trakeal toplamak ve buz üzerinde yerleştirin. Örnekleri işleme için hemen gönderin.
3. trakeal salgı numune hazırlama
Not: Tüm deneylerin bir Biyogüvenlik ile uygun kişisel koruyucu ekipman kabin altında gerçekleştirilmelidir.
- Hava yolu salgı örneklerinde fosfat tamponlu tuz (PBS) plastik 10 mL (için 10 x seyreltme) kullanarak 9 mL 1 mL dağıtmak. Künt bir pipet mukus örnek homojenize için kullanın.
- Eritici büyük boyutta veya blok Havacilik erişim delik veya Kanal kan pıhtıları kaldırmak için bir 40 µm naylon hücre süzgeç ile süzün. Örnek işlendikten sonra buza koyun.
- PBS arabelleğinin, bir 1.000 x seyreltilmiş süspansiyon sonuçlanan bir 100 x birim için her örnek seyreltici dağıtmak. Örnek tüm ayrılma işlemi sırasında buz üzerinde bir yer.
4. deneysel Kur
Not: Tüm deneylerin bir Biyogüvenlik ile uygun kişisel koruyucu ekipman kabin altında gerçekleştirilmelidir.
- Sıvı Kılavuzu Tekdüzen akışı her dört sarmal mikro (Şekil 1B) uygulama için PDMS çip bir araya getirin.
Not: Dört kanal iş çıkarma yeteneğini artırmak için parallelization, hem de elde edilen süspansiyon birim ve hücre yoğunluğu duruma getirilmesi tarafından kullanılmıştır. Sıvı Kılavuzu tasarlanmış ve stereolitografi türü 3D yazıcı açık reçine ile yapılır. Giriş ve çıkış bağlantı noktası sıvı Kılavuzu için rahatlık-in bağlantı ve istikrarlı mühürleme işlemi sırasında kadın radarı konektörlerini kullanın. - 1/16-inç erkek radarı bağlayıcı giriş, iç duvar (IW) çıkış ve sıvı Kılavuzu'nun dış duvar (OW) çıkış bağlantı noktasına bağlayın ve silikon tüp örnek süspansiyon bağlayın.
- Künt keyif-e doğru giriş ve çıkışları örnek rezervuar alt ulaşmak için her iki ucuna yerleştirin.
- Peristaltik pompa giriş tüp ile bağlanır.
- Örnek rezervuar giriş boru ve IW çıkış boru sonuna yerleştirin ve atık haznesi (Şekil 1 c, D) OW çıkış boru sonuna yerleştirin.
- Kalsiyum ve magnezyum olmadan filtre uygulanmış PBS 50 mL tüp örnek rezervuar yerleştirin.
- Cihazın hazırlamak için bir düşük debi (~ 1 mL/dk) pompalamaya başlayın.
Not: Kanal istikrarsızlaştırmak ve hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için cımbız ile üst kabarcıklar kanalda yakalandığında, itin. Cihazın tam arabellek çözüm ile dolduğunda, hava yolu salgı örnek tüp hazırlamak için PBS tüp değiştirin. - Örnek örnek rezervuar yerleştirildiğinde, peristaltik pompa geçiş ve akış hızı 4 mL/dk (Şekil 1 c, D) ayarlayın.
- Numune hacmi belirlenen birimi (~ 1 mL) ulaştığında, işlemi durdurmak ve silikon tüp bağlantısını kesin.
Not: Önerilen yöntem seyreltici büyük miktarda azaltarak daha etkilidir (> 50 mL) içine bir mikro-santrifüj tüpü hacmi (~ 1 mL) (Şekil 2).
5. Akış Sitometresi Analizi
Not: akış sitometresi ile ayirt ayrılma yöntemleri (havacilik ve lizis) karşılaştırmak için kullanıldı.
- Floresein isothiocyanate (FITC) - Konjüge fare anti-insan CD66b monoklonal antikor ve allophycocyanin (APC) - fare anti-insan CD45 monoklonal antikor (200 µL ilk süspansiyonlar (adım 3.3) ve elde edilen süspansiyonlar (adım 4,9) Birleşik Ekle Her antikor), 1:25 oranında v/v.
- Karanlıkta 30 dk 4 ° C'de örnekleri kuluçkaya.
- Her iki PMNs ölçmek için bir akış sitometresi örneği analiz.
Not: FITC APC Çift Kişilik pozitif, CD66b pozitif ve CD45 pozitif nüfus nötrofil olarak kabul edildi. Kurtarma giriş ve elde edilen süspansiyon toplam cep numaralarını oranı tarafından hesaplanır.
6. NE yayın Analizi
Not: izole işlevselliğini karşılaştırmak için nötrofil havacilik ve lizis yöntemi tarafından bir Doğu tahlil kiti kullanıldı.
- (4,9 adımda elde edilen) elde edilen her süspansiyon 50 son bir konsantrasyon için PMA (tahlil Seti'nde sağlanan) eklemek nM.
- Örnekleri için 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Süspansiyonlar vasıl 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.
- Her süpernatant ile 10 µL (tahlil Seti'nde sağlanan) bir 96-şey plaka aktarın.
Not: 96-şey Mikroplaka bir düz dipli ve siyah Polistiren ile de kullanılabilir. - 90 µL seyreltilmiş tahlil arabelleği (tahlil Seti'nde sağlanan) her şey için ekleyin.
- Elastase substrat (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, tahlil Seti'nde sağlanan) 10 µL ekleyin.
- 37 ° C'de 1,5 saat için kuluçkaya
- 485 bir uyarma dalga boyu bir yer kullanarak 96-şey plaka okuma nm ve emisyon dalga boyu 525 nm.
Not: NE düzeyde PMN sayısı Akış Sitometresi Analizi tarafından bölünmüştü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz şeffaf bağışıklık hücreli süspansiyonlar her iki DTT mucolysis ve havacilik ayrılma (Şekil 3A) ile elde. Havacilik ayrılma toplanan 4,40 x 105 PMNs ortalama (2.1 x 104 x 105 PMNs, 5,60 için n = 6) temiz süspansiyon 1 ml hava yolu salgı örneklerinden (50 mL toplam hacim) 1000 kat daha fazla sulandırılmış. İlk seyreltici, %94.0 PMNs karşılaştırıldığında (CD66b+/CD45+) küçük bir hacim içinde sürekli olarak 6 klinik örnekler üzerinde ele geçirildi. Ancak, DTT mucolysis yöntemi %53.5 kurtarma ortalama ile önemli örnek örnek varyasyonları (30.8-%96,0) gösterdi (Şekil 3B).
Daha sonra elastase sürümü bir kanıtı-of-concept bir ticari Kuzey tahlil kiti ile incelenmiştir. Dış stimülasyon, mucolytic yöntemi tarafından hazırlanan örnek daha yüksek ND düzey örnek Havacilik yönteminden daha gösterdi. PMA havacilik ve Kuzey yayın tetiklemek için mucolytic ayrılma yöntemleri elde edilen süspansiyonlar eklendi. Hava yolu salgı örnekleri 6 farklı hastalardan her yöntemiyle test ettik. Bağışıklık hücreleri Havacilik ile ayrılmış sunulan sağlam işlevselliği, NE artan miktarda gösterilen yayın PMA stimülasyon tarafından. Öte yandan, mucolytic ayrılma yöntemi tarafından hazırlanan hücreleri Doğu yayın (Şekil 3 c) tutarsız bir artış gösterdi.
Şekil 1: sarmal mikrosıvısal aygıt ve deneysel ayarları. (A)sarmal havacilik ve (B) cihazın fotoğraf görüntülerini sıvı adaptörü ile toplandı. (C) Şematik diyagramı sarmal atalet Havacilik kullanarak kapalı çevrim ayrılması. Parçacık/hücre konsantre akışı (IW çıkış) orijinal örnek havzanın sirkülasyon, hücreleri bağışıklık ile ilgili müsin toplamları içeren arka plan sıvı ise küçük bir hacim içinde yoğunlaşmıştı ve küçük RBCs sürekli vardı OW prizine bağlı atık tüpünden kaldırıldı. (D) deneysel Kur ve floresan görüntü 10 µm parçacık, merminin (yeşil) ve sarmal kanal (sağ üst) çıkış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kapalı çevrim atalet Havacilik kullanarak hava yolu salgı numune hazırlama Şematik diyagramı. Klinik olarak mekanik olarak arabellek çözüm 1000 x hacmindeki dağınık hava yolu salgı indüklenen. Eritici havacilik, ~ 1 mL hücre süspansiyon açık arka plan ile sonuçlanan tarafından yoğunlaşmıştır. Ryu ve ark., telif hakkı (2017) Amerikan Kimya Birliği17izniyle uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: mikrosıvısal ayrılma yöntemine DTT mucolytic yönteminin temsilcisi karşılaştırmalar. (A)trakeal salgıları örnek (sol) ve sonra mikrosıvısal ayrılma mikroskobik görüntü. (B) orijinal ve elde edilen süspansiyonlar fotoğrafik görüntü. (C) PMN kurtarma oranları mucolytic ve havacilik yöntemleri arasında karşılaştırılması. (D) Kuzey yayın havacilik ve DTT mucolytic yöntemleri öncesi ve sonrası PMA stimülasyon tarafından ayrılmış nötrofil karşılaştırılması. Kuzey yayın önemli ölçüde tetiklenen PMA tarafından örneği mikrosıvısal ayrılması (p < 0.0001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Atalet Havacilik içinde bir mikro-kanallı onların boyutu5,18,19,20üzerinde belirli bir lateral pozisyonda, parçacık ve hücre belirle. Dekan Birleşik etkisi nedeniyle kuvvet ve atalet kabiliyeti eğri microchannel, büyük parçacıkları veya nötrofil sürükleyin (> 10 µm) Kanal ve küçük parçacıklar, mukus toplamları ve enkaz içinde 6'dan daha küçük yer alan µm konumlandırılmış belirli akış hızı kanalda dışında10,11,13,14koşulları.
Ancak, özellikle diğer hücreleri/parçacıkları ile parçacık ayırma boyutu aralığını veya hücre ilgi ile çakışıyor zaman havacilik, kullanırken bir ticaret-off konsantrasyon ve kurtarma ayrılık arasında yoktur. Yüksek bir konsantrasyon sıralanmış parçacıklar ve hücreleri elde etmek için ayırma aralığı dar olması gerekir ve her örnek çalıştırmak mikroskobik gözlem ile bir ince ayar gerektirir; Bu hava yolu salgıları gibi heterojen Biyometri üzerinde atalet Havacilik kullanımını sınırlar.
Burada, bir klinik hava yolu salgıları örnek hazırlama yöntemi kullanarak kapalı çevrim atalet Havacilik (Şekil 1B, C) vitro deneyleri için tanıtmak. Kapalı çevrim işlemi devridaim parçacık/hücre aracılığıyla odaklama bir çıkış tarafından yüksek konsantrasyon faktörler ve yüksek kurtarma oranları elde. OW çıkış atık tüpün içine akar ve IW çıkış sürekli olarak orijinal örnek tüp beslenir. Hücrelerin çapı 10 µm daha büyük arka plan sıvı atık tüp elenirse ise örnek, hücre yoğunluğu artan ilk örnek tüp, böylece, görüntülenmeye devam eder. Yüksek seyreltme oranı, enkaz ve mukus gibi arka plan sıvı boşluk sağlar. Ayrıca, hasta örnek durumu ne olursa olsun, önerilen yöntem aynı şekilde ayırmak ve bağışıklık hücreleri izole.
DTT hücre içeriğini zamk1,21,22ayırmak için proteoglikan toplama disülfür bağları cleaves yaygın olarak kullanılan müsin lizis arabellek olur. Ancak, DTT bildirildi lökosit işlevi2etkileyen beyaz kan hücre yüzey antijenleri ile müdahale. Bizim çalışmada, DTT ayrılma tarafından kurtarılan hücresel içeriği örnekleri arasında üniform olmayan mucolytic verimliliği ve Filtre tıkanma nedeniyle tutarsız edildi. Bu daha küçük birimler ile ilk örnekleri ve nispeten kalın hava yolu salgı örnekleri hazırlanması için kritik hale gelir. Öte yandan, havacilik kullanarak yöntemi heterojen hasta numuneleri (Şekil 3 c) hücre içeriğinin tutarlı kurtarma etkinleştirilmiş. Şekil 3B' de gösterildiği gibi sürekli olarak temiz bir arabellekte özgün örnek durumu, Yani, kanlı, inatçı veya sulu ne olursa olsun hava yolu salgısı hücre içeriğini ayırabilirsiniz. Geleneksel yönteme göre önerilen yöntem daha az enkaz olası girişim enkaz mansap biyokimyasal analizlerde en aza indirir kurtarılan örnek vardır.
Kuzey yayın yakalanan nötrofil fonksiyonel bütünlüğünü değerlendirmek için her iki zenginleştirme yöntemi (şekil 3D) tarafından incelenmiştir. Nötrofil yabancı kaldırmak NE aracılığıyla organik moleküller serbest23,24,25. PMA nötrofil vitro26etkinleştirmek için yaygın olarak kullanılır. Havacilik ve mucolytic (DTT) yöntemleri tarafından izole hücreler 50 ile teşvik PMA nM. Her yöntemin insan hava yolu salgı örnekleri (P173, P174, P176, P177, P181 ve P182 etiketli) ile test ettik. Havacilik tarafından konsantre örnekleri tüm 6 örnekleri için PMA stimülasyon tarafından NE içinde artış gösterdi. Buna ek olarak, sadece 3 tedavi DTT örnekleri artan Doğu etkinliği PMA stimülasyon sonra neden. Buna ek olarak, DTT mucolytic yöntemle izole nötrofil Havacilik tarafından izole nötrofil daha çok daha yüksek temel faaliyet gösterdi. Yani, yüzey çalışmasının bağlı Havacilik yöntemi koruma açısından geliştirilmiş bir yöntem olduğunu göstermektedir antijen2,3, Kuzey makinelerin olası kimyasal rahatsızlık bu sonuçlar gösterdi nötrofil fonksiyon DTT homojenizasyon daha. Önerilen ayrılma yöntemi da hasta numuneleri pozlama dış çevrenin potansiyel tehlikeleri ile en aza indirme otomatik ve tamamen temiz biçimde çalışır.
Ancak, önerilen yöntem yüksek debi ve bu nedenle, kararlı bir sıvı bağlantı gerektirir. Ayrıca, peristaltik sirkülasyon pompası doğal dalgalanma, nedeniyle IW çıkış boyut OW çıkış boyutu büyük olmalıdır, aksi halde işlem hacmi tehlikeye olabilir. Biz daha istikrarlı bir akış hızı sağlayabilir bir sirkülasyon pompası ise önerilen yöntem daha yüksek aktarıma sağlayacaktır bekliyoruz.
Nötrofil klinik hava yolu salgıları den yakalamak için bir ayrılma protokol sağlayarak, bu çalışmada sunulan Yöntem pnömoni, astım, kistik fibrozis, gibi solunum yolu hastalıkları klinik araştırma kapsamını genişletmek için beklenen ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar burada açıklanan teknoloji patent başvurusunda.
Acknowledgments
Bu eser NIH U24 örnek tutumlu tahlil programı yanı sıra (U24-AI118656) (R21AI119042) NIH/NIAID tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D.
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
