Summary
Qui, presentiamo una procedura per funzionalizzare fluorescente disolfuri su Qβ VLP con dibromomaleimide. Descriviamo Qβ espressione e purificazione, la sintesi di molecole dibromomaleimide-funzionalizzate e la reazione di coniugazione tra dibromomaleimide e Qβ. La particella coniugata fluorescente gialla risultante utilizzabile come una sonda a fluorescenza all'interno delle cellule.
Abstract
Il recente aumento in particelle simili al virus (VLPs) in biomedica e ricerca dei materiali può essere attribuito alla loro facilità di biosintesi, dimensioni discrete, genetica programmabilità e biodegradabilità. Mentre sono altamente suscettibili di reazioni bioconjugation per l'aggiunta di ligandi sintetici sulla loro superficie, la gamma bioconjugation metodologie su questi capsidi nata acquose è relativamente limitata. Per facilitare la direzione della ricerca di biomateriali funzionali, sono da considerarsi reazioni bioconjugation non tradizionali. La reazione descritta in questo protocollo utilizza dibromomaleimides per introdurre nuove funzionalità nel solvente legami bisolfurico esposte di un VIP basati su Qβ del batteriofago. Inoltre, il prodotto finale è fluorescente, che ha il vantaggio di generare una sonda rintracciabile in vitro utilizzando un set di filtri disponibili in commercio.
Introduction
Utilizzando nano-dimensioni capsidi virali è emerso come un campo emozionante, che mira ad ampliare la portata delle applicazioni nella ricerca biomedica1,2,3. Recombinantly espresse particelle simili al virus (VLPs) sono strutturalmente derivate dai virus, ma mancano il materiale genetico virale originale che li rende non infettive nanoparticelle proteinica. Come le caratteristiche della superficie sono geneticamente programmate e ogni capside è espresso in modo identico a quelli prima e dopo di esso, è possibile conoscere la posizione e il numero delle catene laterali reattivi degli aminoacidi con precisione atomistica. In molti casi, entrambe le superfici interne ed esterne possiedono molti generi di solvente esposta dell'amminoacido residui che possono essere funzionalizzati concretamente attraverso reazioni di bioconjugation - reazioni che formano legami covalenti tra una biomolecola e un sintetico molecola4,5.
Reazioni di bioconjugation aiutano biomolecole di interesse hanno funzionalità più diversificata in modo relativamente semplice. Molecole di interesse, come farmaci terapeutici6, fluorescente tag7 e polimeri8,9 possono essere pre-sintetizzati e caratterizzati prima sono attaccati sulla superficie di VIP. Un VLP particolarmente comune in biomedica e biomateriali la ricerca è stata la VLP basato su batteriofago Qβ, che, come recombinantly espresso, è un 28 nm icosaedrica del capside virale10. I più comuni siti di reazione su Qβ sono lisine con un ampio margine, anche se recentemente abbiamo comunicato la coniugazione successo11 dibromomaleimide composti per la ridotte disolfuri che costeggiano i pori di Qβ tramite una reazione di Haddleton-Baker. La reazione procede con una buona resa e, altrettanto importante, senza perdere la stabilità termica delle particelle. Allo stesso tempo, questa reazione genera fluorescenza indotta da coniugazione, che può essere utilizzato per monitorare l'assorbimento di queste particelle nelle cellule. In questo lavoro, dimostriamo la coniugazione di polietilenglicole (PEG) sulla superficie del Qβ attraverso la reazione di Haddleton-Baker, che si traduce in un fluoroforo giallo brillante. Queste particelle possono essere monitorate quindi come si sono presi dalle cellule. Il protocollo qui aiuterà i ricercatori a generare nuova pegilato fluorescente proteinica nanoparticelle basate su Qβ, anche se i suoi principi sono applicabili ad uno di molti altri VIP contenente solvente disolfuri esposte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione
- Fare agar di brodo (LB) di Lisogenesi e versate piastre12.
-
Trasformare BL21 (DE3) con un plasmide pET28 contenente la sequenza della proteina di wtQβ cappotto.
- Scongelare e. coli BL21 (DE3) cellule competenti in un bagno di ghiaccio. Mettere 50 μL di cellule in un tubo del microcentrifuge.
- Aggiungere 2 μL del plasmide in una provetta e flick delicatamente il tubo. Quindi Incubare in ghiaccio per 30 min.
- Shock termico delle celle per 45 s in un bagno di acqua che è esattamente a 42 ° c. Collocare la provetta nel bagno di ghiaccio subito dopo calore-scioccante e incubare per 5 min.
- Aggiungere 950 μL di LB media che non contiene alcun antibiotico.
- Scuotere la cultura a 200 giri/min per 60 min a 37 ° C.
- Piatto 100 μL della coltura su piastre di agar LB (con kanamicina) e incubare la piastra durante la notte a 37 ° C. Selezionare colonie bianchi quando necessario.
-
Fai Super ottimale brodo (SOB) media.
- Autoclave due 2 L sconcertato matracci di Erlenmeyer su un ciclo di superdry.
- In un ambiente asettico, pesare e aggiungere 20,0 g di tryptone, Estratto di 5,0 g di lievito, 2,469 g di solfato di magnesio anidro, 0,584 g di cloruro di sodio e 0,186 g di cloruro di potassio in ciascuno dei palloni.
- Portare il volume a 1 L con acqua ultrapura in ogni boccetta ed autoclave sul ciclo liquido.
- Una volta che i media SOB ha raggiunto la temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di kanamicina (100 mg/mL) per ogni litro di media e conservare a 4 ° C.
-
Fare il tampone di fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
- Fanno 1 M potassio monobasico soluzione sciogliendo 68,045 g di potassio monobasico in 500 mL di acqua ultrapura.
- Fanno 1 M potassio bibasico soluzione sciogliendo 87,09 g di potassio bibasico in 500 mL di acqua ultrapura.
- Aggiungere 38,5 mL di soluzione di potassio monobasico e 61,5 mL di potassio bibasico per una bottiglia da 1 litro.
- Regolare il pH a 7.00 se necessario e portare a un volume di 1 L.
-
Fai 5 – 40% pendenze del saccarosio in tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
- In provette da 50 mL centrifuga, preparare soluzioni con saccarosio 5 – 40% (in aumento in incrementi del 5%) dissolto in tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
- Deposito 3,3 mL di soluzione di 5% di saccarosio nella parte inferiore di un tubo di policarbonato di turno-fondo 38 mL utilizzando una siringa ago lungo e ripetere questa operazione per cinque altri tubi.
- Depositare con attenzione 3,3 mL di soluzione di saccarosio di 10% nella parte inferiore del tubo e rimuovere con cautela l'ago per non disturbare la sfumatura. Ripetere per gli altri cinque tubi.
- Continuare depositare strati di 3,3 mL delle soluzioni di saccarosio, in aumento dal 15% al 40% in ogni provetta, pur essendo prudente per non disturbare la sfumatura.
- Al termine, coprire le cime dei gradienti con lamina e conservare a-80 ° C.
2. espressione di Qβ
- Pulire la zona di panca con 1:1. candeggina/etanolo.
- Fai due colture starter di 3 mL in ambiente asettico aggiungendo singole colonie di e. coli BL21 (DE3) in 3 mL di media SOB in ambiente asettico.
- Crescere su un agitatore a 250 rpm in una stanza 37 ° C e 0% di umidità relativa (rH) durante la notte.
-
Inoculare coltura starter media SOB:
- Togliere entrambe colture starter 3ml shaker e, in un ambiente asettico, versare ogni coltura starter in uno dei due 2 L sconcertato matracci di Erlenmeyer con 1 L di fresco media SOB in ciascuno.
- Posizionare il supporto di inoculate su un agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH.
- Crescere i batteri su un agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH OD600 fino a 0,9-1,0.
- Aggiungere 1 mL di 1 M isopropilico β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) usando una pipetta P1000 per indurre l'espressione della proteina.
- Lasciare i media sull'agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH durante la notte.
- Rimuovere dal shaker la mattina seguente e centrifuga utilizzando flaconi da 1000 mL a 20.621 × g per 1 h a 4 ° C per raccogliere le cellule.
-
Scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare.
- Versare il surnatante in una boccetta con circa 5 mL di candeggina per uccidere i batteri. Si tratta di rifiuti.
- Utilizzare una spatola per raschiare il pellet cellulare dalla parte inferiore della bottiglia della centrifuga e mettere la pallina in una provetta da centrifuga 50 mL.
3. purificazione di Qβ
- Risospendere il pellet cellulare con ~ 20 – 30 mL di tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
- Assicurarsi che la risospensione non ha nessun blocchi e lisare le cellule utilizzando un processore microfluidizer secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali). Lisare le cellule almeno due volte per aumentare la resa delle particelle.
- Centrifugare il lisato in flaconi da 250 mL Centrifuga a 20.621 x g per 1 ora a 4 ° C.
- Scartare il pellet e misurare il volume del surnatante in mL. Moltiplicare tale valore per 0,265 e aggiungere che la quantità di g di solfato di ammonio al supernatante.
- Mescolare a 4 ° C per almeno 1 h su una zolla di mescolare a 200 giri/min per precipitare le proteine.
- Centrifugare in flaconi da 250 mL a 20.621 x g per 1 h a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante e risospendere il sedimento con circa 10 mL di tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
- Aggiungere volumi uguali di 1:1 cloroformio/n-butanolo campione grezzo e mescolare nel Vortex per pochi secondi.
- Centrifugare a provette mL 38 a 20.621 × g per 30 minuti a 4 ° C.
- Recuperare lo strato acquoso superiore utilizzando una pipetta Pasteur. Fare attenzione a non prendere uno qualsiasi del gel come strato che si è formata tra lo strato acquoso e organico.
- Scongelare i sei pendenze del saccarosio pre-fatte di 5-40% e caricare circa 2 mL di estratto su ciascuno.
- Ultracentrifuga a 99.582 x g per 16 h a 4 ° C con decelerazione gratis.
- Brillare di una luce che emettono luce a diodi (LED) sotto ogni tubo e una banda blu dovrebbe diventare visibile. Recuperare queste particelle con una lungo ago siringa.
- Ultrapellet le particelle a 370.541 x g per 2,5 ore a 4 ° C.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet trasparente delle particelle purificate con tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
4. quantificazione e conferma del prodotto
- Utilizzare analisi di Bradford per quantificare il prodotto13.
- Esecuzione di riduzione e non riducenti sodio dodecil solfato elettroforesi del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) per confermare il prodotto14.
Nota: Riduzione dello SDS-PAGE viene utilizzato per confermare il peso molecolare della proteina del cappotto; non-riduzione dello SDS-PAGE è quello di confermare la struttura di ordine superiore.
5. coniugazione composti DB su Qβ
-
Ridurre disolfuri su Qβ.
- Sciogliere 0,0020 g di tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) in 1 mL di acqua ultrapura per rendere una soluzione stock di 100 x.
Nota: Preparare fresco TCEP prima riduzione. - Aggiungere 200 µ l di Qβ (5 mg/mL) in un tubo del microcentrifuge.
- Seguire con l'aggiunta di 20 µ l di soluzione madre di 100 x TCEP.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
- Sciogliere 0,0020 g di tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) in 1 mL di acqua ultrapura per rendere una soluzione stock di 100 x.
-
Ri-ponte disolfuro ridotta utilizzando dibromomaleimide polietilenglicole (DB-PEG).
- Sciogliere 0,0017 g dibromomaleimide-polietilenglicole (DB-PEG) in 100 µ l di DMF.
- 680 µ l di soluzione di sodio fosfato 10 mM (pH 5,00).
- Aggiungere ridotto Qβ nella soluzione di DB-PEG e osservare il processo di miscelazione sotto una lampada a UV 365 nm. La fluorescenza gialla luminosa possa essere visualizzata immediatamente con una lampada palmare UV 365 con la miscelazione di nm.
- Lasciare che la reazione procedere durante la notte a temperatura ambiente (TA) su un girarrosto.
- Purificare la miscela di reazione dal filtro centrifugo (COMW = 10 kDa) tre volte utilizzando 1X PBS a 3.283 x g per 20 min a 4 ° C.
- Monitorare la coniugazione non riducenti SDS-PAGE e l'elettroforesi del gel dell'agarosi nativo.
Nota: VLP eseguire come particelle intatte in gel di agarosio nativo, e sono separati base alla loro carica, dimensione e forma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I derivati di dibromomaleimide possono essere sintetizzati attraverso la reazione di condensazione tra anidride dibromomaleimide e ammine primarie15. In alternativa, un metodo sintetico mite16 utilizzando N-metossicarbonile attivato 3,4-dibromomaleimide è stata sfruttata qui reagendo con metossipolietilen glicole (PEG) a rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR è stato utilizzato per identificare la struttura composta (Figura 2). Qβ VLP è un 28 nm icosahedral proteinico delle nanoparticelle, che si compone di 180 proteine cappotto identico. Le proteine di cappotto tendono a formare dimeri ad incastri non covalenti attraverso i loro domini α-elica con il β-fogli dal cappotto adiacente proteine17. VLP tendono ad essere selezionati per la loro stabilità alle alte temperature, pHs estreme e in varie composizioni solvente18. In questo caso, Qβ VLP è più stabile di altri fagi del RNA della famiglia Leviviridac a causa di 180 disolfuro inter-strand che si trova presso il piega a cinque e a sei assi di simmetria il capside19 (Figura 3). Queste strutture esamerica e pentamerica sono collegate da disolfuri, che possono essere visualizzate da non riducenti SDS-PAGE19. Dieci gli equivalenti di TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0.70 µmol), riguardante i disolfuri in 1 mg di Qβ (0.070 µmol coat protein, 0,070 µmol disolfuri), sono stati utilizzati per ridurre tutti i disulfides per generare i capsidi Qβ ridotti (rQβ) a temperatura ambiente in una ora e non riducenti SDS-PAGE mostra che tutte le strutture di ordine superiore sono stati ridotti alle proteine monomeriche cappotto (Figura 4 e Figura 5A). La reazione di rebridge li è stato fatto come una sintesi one-pot, come la mescolanza di greggio rQβ è stato aggiunto direttamente al 20 equivalenti di una soluzione di DB-PEG (1.4 µmol) in fosfato di sodio (10 mM, pH 5,00, 10% DMF) seguendo la reazione di riduzione di un'ora11. C'era osservabile fluorescenza giallo brillante sotto la lampada di 365 nm UV (Figura 5) immediatamente dopo l'aggiunta del DB-PEG. La miscela è stata quindi incubata a RT durante la notte su un girarrosto, seguito da purificazione mediante filtro centrifugo (MWCO = 10 kDa) risciacquo con il buffer desiderato tre volte per rimuovere una quantità eccessiva di piccole molecole. I coniugati Qβ-malemide sono state risospese in soluzione di sodio fosfato 10 mM (pH 5,00) per promuovere la fotostabilità. La coniugazione è stata confermata da non-riduzione dello SDS-PAGE sotto UV e coomassie blu colorazione (Figura 5A). Tutte le bande hanno mostrato la fluorescenza (Figura 5A) sotto UV che colocalized con il blu di coomassie macchiatura, rappresentando una coniugazione di successo. L'integrità dei coniugati Qβ-PEG sono stati confermati da microscopia di nativo dell'agarosi gel elettroforesi e trasmissione elettronica (TEM) (figura 5B, C).
La spettroscopia di fluorescenza ha mostrata i massimi di eccitazione e di emissione di Qβ-maleimide (Qβ-Μ) e Qβ-PEG per essere circa 400 nm e 540 – 550 nm, rispettivamente (Figura 6). Questo si allinea con il set di filtri di GFP-uv disponibile in commercio, cui lunghezza d'onda di eccitazione è 405 nm ed emissione lunghezza d'onda è 500 – 540 nm. L'allineamento comodo delle proprietà fotofisiche dei coniugati con il filtro disponibile in commercio imposta permesso utilizzando Qβ-PEG come una sonda in vitro , che è stato fatta e ripreso nella Figura 7. Qβ-PEG (200 nM) è stato incubato con Mouse Raw-264.7 celle in medium DMEM senza siero, seguito macchiando di nucleo. Immagini di colocalizzazione nella Figura 7 Mostra che particelle fluorescenti gialle erano uptaken da Raw 264.7 celle e possono essere rintracciate dopo quattro ore di incubazione. I VIP Qβ interessante mostrare fluorescenza trascurabile.
Figura 1: schema sintetico di DB-PEG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratterizzazione NMR. (A) 1 H NMR e (B) 13C di DB-PEG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: struttura cristallografica del capside Qβ VLP trasformati in Chimera (PDB ID: 1QBE). Due residui di cisteina (Cys 74 e 80 Cys) sono mostrati in arancione.
Figura 4: schema di Coniugazione dei coniugati Qβ-maleimide (Qβ-M). Qβ (0,07 µmol di disolfuri) è stato ridotto utilizzando 10 equivalenti di TCEP (0,7 µmol) a temperatura ambiente per un'ora, seguita dalla aggiunta di 20 equivalenti di composti dibromomaleimide (DB e DB-PEG) (1.4 µmol). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: caratterizzazione di Qβ, rQβ, Qβ-M e Qβ-PEG. (A) Non ridurre SDS-PAGE e (B) nativo dell'agarosi gel di Qβ, rQβ, Qβ-M e Qβ-PEG sotto UV (in alto) e coomassie blu colorazione (in basso). (C) micrografia TEM di Qβ-M (in alto) e Qβ-PEG (in basso). Miscela di reazione di fotografare di Qβ-PEG (D) nell'ambito dell'illuminazione di 365 nm UV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: spettri di fluorescenza. Eccitazione (A) ed emissione (B) spettri di fluorescenza di Qβ-M e Qβ-PEG in 0,1 M di tampone fosfato di potassio (pH 7,00). L'eccitazione massima è circa 400 nm ed emissione massima è intorno a 540 – 550 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: immagini di fluorescenza confocale di Qβ-PEG coniugano in cellule macrofagiche 264,7. Blu: NucRed Live 647 ReadyProbes reagenti. Giallo: Qβ-PEG. Top immagini: fuse canali blu e gialli. Fondo immagini: immagini luminose del campo. Filtrare i set: uv-GFP (λex = 405 nm, λem = 500 – 540 nm), Cy5. Tempo di incubazione è stato h. 4 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rispetto al più piccolo purificazione della proteina, un unico passo a depurare il batteriofago Qβ è la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Dopo la fase di estrazione di cloroformio/n-butanolo, Qβ viene ulteriormente purificato usando 5-40% pendenze del saccarosio. Durante la centrifugazione, le particelle vengono separate in base alle loro dimensioni. Le particelle più grandi in viaggio per la regione di densità superiore, mentre le particelle più piccole soggiorno nella regione più bassa densità. Qβ viaggia al terzo inferiore della sfumatura e rimane lì, mentre le più piccole impurità di proteina sono intrappolate nella parte superiore della provetta centrifugo. La sospensione colloidale di Qβ Mostra Tyndall forte dispersione del gradiente di saccarosio, che può essere visto come una banda blu quando una luce LED è brillata da sotto. Questa band è quindi facile da estrarre utilizzando un ago di siringa lunga. Qβ in saccarosio è quindi pellettato di ultracentrifugazione, producendo un pellet chiaro. Il pellet può essere risospese nel buffer desiderato o ulteriormente purificato mediante cromatografia liquida della proteina veloce (FPLC). La purezza della particella risultante può essere confermata da SDS-PAGE.
TCEP non è stabile in tampone fosfato, quindi una soluzione di riserva x TCEP 100 deve essere preparata in acqua a destra prima della riduzione. Inoltre, TCEP contiene tiolo libero né reagisce verso altri aminoacidi, quindi non è necessario rimuovere l'eccesso di TCEP prima di eseguire la reazione di coniugazione. Dibromomaleimide composti vengono disciolte in soluzione di 5.00 sodio fosfato pH, seguito aggiungendo il Qβ ridotto. A pH 5,00, cisteina (ridotta disolfuro) è protonata, che promuove la reazione di coniugazione con dibromomaleimide da impedire re-ossidazione torna a un bisolfuro. Illuminazione di UV sotto 365 nm, la miscela di reazione emette fluorescenza giallo immediatamente dopo Qβ ridotto è stato aggiunto in composti di DB. Diversamente da allegare fluorofori pre-sintetizzati su Qβ, questa fluorescenza è indotta tramite la reazione di coniugazione. Il fluoroforo è formato, non appena vengono creati i nuovi legami tra lo zolfo e l'anello di maleimide. Spettri di fluorescenza dimostra che l'eccitazione (400 nm) e delle emissioni (550 nm) maxima montare il filtro uv-GFP impostato in un microscopio confocale (λex = 405 nm, λem = 500−540 nm). Qβ-PEG è stato poi incubato con macrofagi Raw 264.7 in DMEM privo di siero. Dopo quattro ore di incubazione, Qβ-PEG era uptaken e punctata giallo fluorescente scomparti possono essere visualizzati all'interno delle cellule. Un fatto che deve essere menzionato è che la fluorescenza può essere trasferita per una certa misura all'albumina di siero bovino (BSA) nel siero o altre sostanze ricche di cisteina all'interno dei lisosomi o il late endosomes delle cellule. Nel corso del tempo, questo indebolirà la fluorescenza all'interno della cellula per cellula monitoraggio delle applicazioni; Tuttavia, fornisce anche un'opportunità per un nuovo design per sistemi di drug delivery.
In conclusione, abbiamo dimostrato coniugando DB-PEG su Qβ VLP attraverso la chimica dibromomaleimide-tiolo. La reazione di coniugazione di all-in-one non solo functionalizes i disolfuri lungo i pori su VLP con PEG, ma rende anche una nanoparticella proteinica fluorescente contrassegnata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
J.J.G. riconosce la National Science foundation (DMR-1654405) e cancro Prevenzione Research Institute del Texas (CPRIT) (RP170752s) per il loro sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
