Summary
Hier presenteren we een procedure fluorescently functionalize de disulfides op Qβ VLP met dibromomaleimide. We beschrijven Qβ meningsuiting en zuivering, de synthese van dibromomaleimide-matiemaatschappij moleculen en de vervoeging reactie tussen dibromomaleimide en Qβ. Het resulterende gele fluorescerende geconjugeerd deeltje kan worden gebruikt als een fluorescentie sonde binnen cellen.
Abstract
De recente stijging van de virusachtige deeltjes (experimentele) in biomedische en onderzoek van materialen kan worden toegeschreven aan hun gebruiksgemak biosynthese, discrete grootte, genetische programmeerbaarheid en biologische afbreekbaarheid. Terwijl ze zeer vatbaar voor bioconjugation reacties voor het toevoegen van synthetische liganden op hun oppervlak, is het bereik in bioconjugation methodologieën op deze waterige geboren capsids relatief beperkt. Ter vergemakkelijking van de richting van functionele biomaterialen onderzoek, moeten niet-traditionele bioconjugation reacties worden beschouwd. De reactie beschreven in dit protocol maakt gebruik van dibromomaleimides om nieuwe functionaliteit in het oplosmiddel blootgestelde bisulfide obligaties van een VLP gebaseerd op bacteriofaag Qβ. Bovendien is het eindproduct TL, die heeft het extra voordeel van het genereren van een traceerbare in vitro sonde met behulp van een commercieel beschikbare filter set.
Introduction
Met behulp van virale capsids nano-sized heeft ontpopt als een spannende gebied, die gericht is op het verbreden van de reikwijdte van toepassingen in biomedisch onderzoek1,2,3. Recombinantly uitgesproken virusachtige deeltjes (experimentele) zijn structureel afgeleid van virussen, maar ze missen de oorspronkelijke virale genetische materiaal waardoor ze niet-infectieuze eiwithoudende nanodeeltjes. Aangezien de oppervlaktekenmerken zijn genetisch geprogrammeerd en elke Eiwitmantel identiek aan die voor en na het wordt uitgedrukt, is het mogelijk om te weten de locatie en het aantal reactieve zijketens van de aminozuren met atomistic precisie. In veel gevallen bezitten zowel het exterieur en interieur oppervlak vele soorten oplosmiddel blootgestelde aminozuurresidu's, die redelijkerwijs kunnen worden matiemaatschappij door bioconjugation reacties - reacties die covalente bindingen tussen een Biomolecuul en een synthetische vormen molecuul4,5.
Bioconjugation reacties helpen biomoleculen van belang hebben diverser functionaliteiten op een relatief eenvoudige manier. Moleculen van belang, zoals therapeutische drugs6, fluorescerende labels7 en polymeren8,9 kunnen worden vooraf gesynthetiseerd en gekenmerkt voordat ze zijn aangesloten op het oppervlak van experimentele. Een bijzonder gemeenschappelijk VLP transferoefeningen biomedische en biomaterialen onderzoek geweest de VLP gebaseerd op bacteriofaag Qβ, die als recombinantly uitgesproken, is een 28 nm icosahedrale virale Eiwitmantel10. De meest voorkomende reactie sites op Qβ zijn lysines door een brede marge, hoewel wij hebben onlangs de succesvolle vervoeging11 van dibromomaleimide verbindingen aan de verminderde disulfides die lijn de poriën van Qβ via de reactie van een Haddleton-Baker meegedeeld. De reactie verloopt met een goede opbrengst en, even belangrijk, zonder verlies van de thermische stabiliteit van de deeltjes. Op hetzelfde moment genereert deze reactie vervoeging-geïnduceerde fluorescentie, die kan worden gebruikt voor het bijhouden van de opname van deze deeltjes in cellen. In dit werk tonen we de vervoeging van polyethyleenglycol (PEG) op het oppervlak van Qβ door de Haddleton-Baker-reactie, wat in een heldere gele fluorophore resulteert. Deze deeltjes kunnen vervolgens worden bijgehouden als ze worden genomen door de cellen. Het protocol hierin zal helpen genereren van nieuwe TL gepegyleerde eiwithoudende nanodeeltjes gebaseerd op Qβ, hoewel haar beginselen zijn van toepassing op een van de vele andere experimentele oplosmiddel blootgestelde disulfides met onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
- Maken van lysogenie Bouillon (LB) agar en giet platen12.
-
Tover BL21(DE3) met een plasmide van de pET28 met de wtQβ jas eiwit sequentie.
- Ontdooi E. coli BL21(DE3) bevoegde cellen in een ijsbad. Plaats 50 μl van cellen in een buis van microcentrifuge.
- Voeg 2 l plasmide in één buis en zachtjes flick de buis. Incubeer vervolgens op ijs gedurende 30 minuten.
- Warmte-schok de cellen voor 45 s in een waterbad dat precies 42 ° C. Plaats de buis terug in het ijsbad onmiddellijk na het warmte-schokkend en incubeer gedurende 5 min.
- Toevoegen van 950 μL van LB-media die geen antibioticum bevat.
- Schudden van de cultuur bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 60 minuten bij 37 ° C.
- 100 μl van de cultuur op LB agar platen plaat (met kanamycine) en Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C. Selecteer wit kolonies wanneer nodig.
-
Super optimale Bouillon (SOB) media maken
- Autoclaaf twee 2 L verbijsterd conische kolven op een superdry cyclus.
- In een aseptische omgeving, weeg en Voeg 20,0 g trypton, 5,0 g gist extract, 2.469 g watervrij magnesium-sulfaat, 0.584 g natriumchloride en 0.186 g kaliumchloride aan elke maatkolf.
- Breng het volume tot 1 L met ultrazuiver water in elke kolf en autoclaaf op de vloeibare cyclus.
- Zodra de SOB-media kamertemperatuur na autoclaaf bereikt heeft, voeg 1 mL kanamycine (100 mg/mL) toe aan elke liter van media en bewaren bij 4 ° C.
-
0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00) maken
- 1 M kalium monobasisch oplossing door het oplossen van 68.045 g kalium monobasisch in 500 mL ultrazuiver water maken
- 1 M kalium dibasische oplossing door het oplossen van 87.09 g kalium dibasische in 500 mL ultrazuiver water maken
- Voeg 38.5 mL kalium monobasisch oplossing en 61,5 mL kalium dibasische op een 1 L-fles.
- Breng pH op 7,00 indien nodig, en brengen een volume van 1 L.
-
Maak 5 – 40% sucrose verlopen in 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).
- Bereiden in 50 mL centrifuge buizen, oplossingen met 5 – 40% (in stappen van 5% stijgt) sacharose opgelost in 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).
- Stort 3,3 mL 5% sacharoseoplossing onderin een ronde bodem polycarbonaat-tube 38 mL met behulp van een lange naald-spuit en herhaal deze procedure voor de vijf andere buizen.
- Zorgvuldig stort 3,3 mL 10% sacharoseoplossing aan de onderkant van de buis, en verwijder voorzichtig de naald wat betreft het verloop niet te storen. Herhaal voor de andere vijf buizen.
- Blijven storten 3,3 mL lagen van sacharose oplossingen, verhoging van 15% tot 40% in elke buis, terwijl ze voorzichtig om niet storen het verloop.
- Als alles klaar is, betrekking hebben op de toppen van de hellingen met folie en opslaan bij-80 ° C.
2. weergave van de Qβ
- Veeg Bank gebied met 1:1 bleekwater/ethanol.
- Maak twee 3 mL starterculturen in een aseptische omgeving door enkele kolonies van E. coli BL21(DE3) in 3 mL SOB media toe te voegen in een aseptische omgeving.
- Groeien in een roteerapparaat bij 250 omwentelingen per minuut in een 37 ° C en 0% relatieve vochtigheid (rH) kamer 's nachts.
-
Inoculeer starter cultuur in SOB media:
- Beide 3 mL starterculturen opstijgen de shaker en giet in een aseptische omgeving, elke starter cultuur in één van de twee 2 L verbijsterd conische kolven met 1 L voor verse SOB media in elk.
- Plaats de geënte media op een shaker op 250 toeren per minuut in een 37 ° C en 0% rH-kamer.
- De bacteriën in een roteerapparaat bij 250 omwentelingen per minuut in een ruimte van 37 ° C en 0% rH groeien totdat OD600 0.9-1.0 bereikt.
- Voeg 1 mL 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) met behulp van een pipet P1000 ertoe eiwit expressie.
- Laat de media in het roteerapparaat bij 250 omwentelingen per minuut in een 37 ° C en 0% rH kamer 's nachts.
- Verwijder media uit de shaker de volgende ochtend en centrifuge met behulp van 1000 mL flessen bij 20,621 × g gedurende 1 uur bij 4 ° C om te oogsten van de cellen.
-
Verwijder het supernatant en verzamelen van de cel-pellet.
- Giet het supernatant in een kolf met ongeveer 5 mL bleekwater om bacteriën te doden. Dit is afval.
- Gebruik een spatel om schrapen de cel pellet vanaf de onderkant van de centrifuge fles en zet de pellet in een centrifugebuis 50 mL.
3. de zuivering van Qβ
- Resuspendeer de pellet cel met ~ 20-30 mL 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).
- Controleer of de resuspensie heeft geen brokken en lyse de cellen met een microfluidizer-processor volgens protocol van de fabrikant (Zie Tabel van materialen). Lyse de cellen ten minste tweemaal te verhogen van het rendement van de deeltjes.
- Centrifugeer het lysate in flessen van 250 mL centrifuge op 20,621 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Negeren van de pellet en meten van de omvang van de bovendrijvende substantie in mL. Deze waarde vermenigvuldig met 0.265 en die hoeveelheid g ammoniumsulfaat toevoegen aan het supernatant.
- Roer bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur op een bord roer bij 200 t/min te precipiteren uit het eiwit.
- Centrifugeer in 250 mL flessen bij 20,621 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet met ongeveer 10 mL 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).
- Gelijke hoeveelheden van 1:1 chloroform/n-butanol aan het ruwe monster en de mix toevoegen door de vortexing voor een paar seconden.
- Centrifugeer in 38 mL tubes 20,621 × g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- De waterige toplaag met behulp van een precisiepipet Pasteur te herstellen. Wees voorzichtig niet te nemen een van de gel zoals laag die tussen de waterige en organische laag heeft gevormd.
- Ontdooi zes 5-40% pre-en-klare sacharose verlopen en laden van ongeveer 2 mL het extract op elk.
- Ultracentrifuge bij 99,582 x g gedurende 16 uur bij 4 ° C met gratis vertraging.
- Glans een licht emitterende diode (LED) licht onder elke buis en een blauwe band moet zichtbaar worden. Het herstellen van deze deeltjes met een lange naald-spuit.
- Ultrapellet de deeltjes op 370,541 x g gedurende 2,5 uur bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de transparante pellet van gezuiverde deeltjes met 0,1 M kalium fosfaatbuffer (pH 7,00).
4. kwantificering en bevestiging van het Product
- Gebruik analyse van Bradford te kwantificeren van de product-13.
- Stormloop te verminderen en niet-reducerende natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) om te bevestigen het product14.
Opmerking: Vermindering van de SDS-pagina wordt gebruikt om te bevestigen het molecuulgewicht van vacht eiwit; niet-vermindering van SDS-pagina is ter bevestiging van de hogere orderstructuur.
5. conjugating DB verbindingen op Qβ
-
Verminderen disulfides op Qβ.
- Los 0,0020 g tris(2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP) in 1 mL ultrazuiver water te maken van een stamoplossing van 100 x.
Opmerking: Bereiden verse TCEP vóór vermindering. - Voeg 200 µL van Qβ (5 mg/mL) in een microcentrifuge buis.
- Volg door 20 µL van 100 x TCEP stockoplossing toe te voegen.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Los 0,0020 g tris(2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP) in 1 mL ultrazuiver water te maken van een stamoplossing van 100 x.
-
Opnieuw een brug verminderde bisulfide met behulp van dibromomaleimide polyethyleenglycol (DB-PEG).
- Los 0.0017 g dibromomaleimide-polyethyleenglycol (DB-PEG) in 100 µL DMF.
- Voeg 680 µL van 10 mM natriumfosfaat oplossing (pH = 5,00).
- Voeg Qβ verminderd in de oplossing van DB-PEG en observeren het mengen proces onder een 365 nm UV-lamp. De heldere gele fluorescentie kan onmiddellijk worden gevisualiseerd met een 365 nm handbediende UV-lamp op het mengen.
- Laat de reactie gaan 's nachts bij kamertemperatuur (RT) op een rotisserie.
- Het reactiemengsel zuiveren door centrifugaal filter (COMW = 10 kDa) drie keer met 1 x PBS op 3,283 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Controleren de vervoeging doordat niet-SDS-pagina en inheemse agarose gel electroforese.
Opmerking: Experimentele uitgevoerd als intact deeltjes in native agarose gel, en zij worden gescheiden op basis van hun kosten, de grootte en de vorm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De dibromomaleimide derivaten kunnen worden gesynthetiseerd door de condensatiereactie tussen dibromomaleimide anhydride (en) en primaire amines15. U kunt ook een milde synthetische methode16 met behulp van N-methoxycarbonyl ingeschakeld 3,4-dibromomaleimide misbruik wordt gemaakt van hier door te reageren met methoxypolyethylene glycol (PEG) rendement DB-PEG (Figuur 1). NMR werd gebruikt voor het identificeren van de samengestelde structuur (Figuur 2). Qβ VLP is een 28 nm icosahedrale eiwithoudende nanoparticle, die bestaat uit 180 identiek vacht eiwitten. De vacht eiwitten neiging om noncovalent elkaar grijpende Dimeren vormen door hun α-Helix domeinen met de β-sheets van de aangrenzende vacht eiwitten17. Experimentele hebben de neiging om te worden geselecteerd voor hun stabiliteit bij hoge temperaturen, extreme pHs, en verschillende oplosmiddelen composities18. In dit geval is Qβ VLP stabieler dan andere RNA bacteriofagen uit de familie van de Leviviridac als gevolg van 180 Inter strand bisulfide obligaties ligt op de vijf - en zes-voudige assen van symmetrie op de Eiwitmantel19 (Figuur 3). Deze hexameer en pentameric structuren zijn verbonden door disulfides, die kunnen worden gevisualiseerd door niet-reducerende SDS-pagina19. Tien equivalenten van TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0.70 µmol), ten opzichte van de disulfides in 1 mg Qβ (0,070 µmol vacht eiwit, 0,070 µmol disulfides) werden gebruikt om alle disulfides voor het genereren van de verminderde Qβ capsids (rQβ) bij kamertemperatuur in een uur, en niet-reducerende SDS-pagina toont aan dat alle hogere orde structuren werden teruggebracht tot monomeer vacht eiwitten (Figuur 4 en figuur 5A). De reactie op de rebridge van hen werd gedaan als een one-pot synthese, zoals de vermenging van de ruwe rQβ was toegevoegd rechtstreeks naar 20 equivalenten van een oplossing van DB-PEG (1.4 µmol) in natriumfosfaat (10 mM, pH 5,00, 10% DMF) na de één uur durende reductie reactie11. Er was waarneembare helder gele fluorescentie onder 365 nm UV lamp (figuur 5D) onmiddellijk na toevoeging van de DB-PEG. Het mengsel werd vervolgens bij geïncubeerd RT's nachts op een grill, gevolgd door de zuivering met behulp van centrifugaal filter (MWCO = 10 kDa) spoelen met de gewenste buffer drie keer te verwijderen van de overtollige hoeveelheid kleine moleculen. De Qβ-malemide-geconjugeerde waren geresuspendeerde in 10 mM natriumfosfaat oplossing (pH = 5,00) ter bevordering van fotostabiliteit. De vervoeging werd bevestigd door niet-reducerende SDS-pagina onder UV en coomassie blue kleuring (figuur 5A). Alle banden toonde fluorescentie (figuur 5A) onder UV-licht die colocalized met de coomassie blue kleuring, vertegenwoordigen een succesvolle Woordherkomst en-opbouw. De integriteit van Qβ-PEG geconjugeerde werden bevestigd door inheemse agarose gel elektroforese en Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) (figuur 5B, C).
De Fluorescentiespectroscopie toonde de excitatie en emissie-maxima van Qβ-maleimide (Qβ-Μ) en Qβ-PEG te worden ongeveer 400 nm en 540 – 550 nm, respectievelijk (Figuur 6). Dit wordt uitgelijnd met de verkrijgbare GFP-UV-filter ingesteld, waarvan excitatie golflengte 405 is nm en emissie golflengte is 500-540 nm. De handige uitlijning van de fotofysische eigenschappen van de geconjugeerde met de verkrijgbare filter ingesteld vergunning met behulp van Qβ-PEG als een sonde van de in vitro , die werd gedaan en beeld in Figuur 7. Qβ-PEG (200 nM) was geïncubeerd met muis Raw-264.7 cellen in serumvrij DMEM medium, gevolgd door de kern kleuring. Colocalization afbeeldingen in Figuur 7 blijkt dat gele fluorescerende deeltjes uptaken door Raw-264.7 cellen werden en na vier uur incubatie kunnen worden bijgehouden. De unfunctionalized Qβ experimentele Toon te verwaarlozen fluorescentie.
Figuur 1: synthetische schema van de DB-PEG. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: NMR karakterisering. (A) 1 H NMR en (B) 13C van DB-PEG. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: kristallografische structuur van Qβ VLP Eiwitmantel zoals verwerkt in Chimera (VOB-ID: 1QBE). Twee cysteïne residuen (Cys 74 en Cys 80) worden weergegeven in oranje.
Figuur 4: vervoeging regeling van Qβ-maleimide (Qβ-M) geconjugeerde. Qβ (0.07 µmol van disulfides) werd verminderd met 10 equivalenten van TCEP (0.7 µmol) op RT gedurende één uur, gevolgd door toevoeging van 20 equivalenten van dibromomaleimide-verbindingen (DB en DB-PEG) (1.4 µmol). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: karakterisering van Qβ, rQβ, Qβ-M- en Qβ-PEG. (A) niet-reducerende SDS-pagina en (B) inheems agarose gel van Qβ, rQβ, Qβ-M en Qβ-PEG onder UV (boven) en coomassie blue kleuring (onder). (C) TEM-opname van Qβ-M (boven) en Qβ-PEG (onder). (D) foto van Qβ-PEG reactiemengsel onder 365 nm UV-verlichting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: fluorescentie spectra. Fluorescentie excitatie (A) en emissie (B) spectra van Qβ-M- en Qβ-PEG in 0,1 M fosfaatbuffer kalium (pH 7,00). De maximale excitatie is ongeveer 400 nm en emissie maximaal is rond 540-550 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: confocale fluorescentie beelden van Qβ-PEG conjugaat in cellen van de macrofaag 264.7. Blauw: NucRed Live 647 ReadyProbes reagentia. Geel: Qβ-PEG. Top van beelden: blauwe en gele kanalen samengevoegd. Onderste beelden: helder veld beelden. Filter sets: uv-GFP (λex = 405 nm, λem = 500-540 nm), Cy5. Tijd van incubatie was 4 h. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vergeleken met kleinere EiwitReiniging, is een unieke stap in het zuiveren van de bacteriofaag Qβ de gradiënt centrifugeren van sacharose. Na de chloroform/n-butanol extractie stap, is Qβ verder gezuiverd met behulp van 5-40% sucrose verlopen. Tijdens centrifugeren, worden deeltjes gescheiden op basis van hun grootte. Grotere deeltjes reizen naar de hogere dichtheid regio, terwijl de kleinere deeltjes blijven in de lagere regio van de dichtheid. Qβ reist naar het onderste derde van het verloop en blijft er terwijl kleinere eiwit onzuiverheden aan de bovenkant van de centrifugebuis zitten. De colloïdale opschorting van Qβ toont sterke Tyndall verstrooiing in het verloop van sacharose, die kan worden gezien als een blauwe band wanneer een LED-licht is scheen uit onder. Deze band is dan eenvoudig om uit te pakken met behulp van een lange spuit-naald. Qβ in sacharose is vervolgens Ingehuld door ultracentrifugatie, levert een duidelijke pellet. De pellet kan geresuspendeerde in de gewenste buffer of verder gezuiverd door snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC). De zuiverheid van de resulterende deeltje kan worden bevestigd door SDS-PAGE.
TCEP is niet stabiel in fosfaatbuffer, dus een 100 x TCEP-stockoplossing moet vers worden bereid in water recht vóór de vermindering. Daarnaast TCEP gratis thiol bevat noch reageert naar andere aminozuren, dus het is niet nodig om te verwijderen van de overdaad aan TCEP voordat de vervoeging-reactie wordt uitgevoerd. Dibromomaleimide verbindingen zijn opgelost in pH 5.00 natriumfosfaat, gevolgd door het toevoegen van de verminderde Qβ. Bij pH 5,00 is cysteïne (verminderde bisulfide) geprotoneerd, die de reactie van de conjugatie met dibromomaleimide door te voorkomen dat re-oxidatie terug naar een disulfide bevordert. Onder 365 nm UV-verlichting, het reactiemengsel straalt gele fluorescentie onmiddellijk nadat verminderde Qβ was toegevoegd in DB verbindingen. Anders wordt bijgevoegd vooraf samengestelde fluorophores op Qβ, wordt deze fluorescentie veroorzaakt door de reactie van de vervoeging. De fluorophore wordt gevormd zodra de nieuwe banden tussen zwavel en de ring van de maleimide zijn gemaakt. Spectra van de fluorescentie blijkt dat de excitatie (400 nm) en emissie (550 nm) maxima passen het filter van de uv-GFP instellen in een confocal microscoop (λex = 405 nm, λem = 500−540 nm). Qβ-PEG werd vervolgens geïncubeerd met macrofaag Raw 264.7 in serumvrij DMEM. Na vier uur incubatie was Qβ-PEG uptaken en punctate geel fluorescerende compartimenten kunnen worden gevisualiseerd in de cellen. Een feit dat moet worden vermeld is dat de fluorescentie mogen worden overgebracht voor enigszins naar bovien serumalbumine (BSA) in serum of andere cysteïne-rijke stoffen in de lysosomen of de late Endosomen van cellen. Na verloop van tijd zal dit verzwakken de fluorescentie in de cel voor cel traceringstoepassingen; Het biedt echter ook een kans voor een nieuw ontwerp voor drug delivery systems.
Wij hebben tot slot aangetoond DB-PEG op Qβ VLP conjugating via dibromomaleimide-thiol chemie. De vervoeging van de alles-in-één reactie niet alleen functionalizes het disulfides langs de poriën op VLP met PEG, maar maakt het ook een fluorescently geëtiketteerde eiwithoudende nanoparticle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
J.J.G. erkent de National Science foundation (DMR-1654405) en de kanker preventie Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) voor hun steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
