Summary
Aquí, presentamos un protocolo para realizar un fraccionamiento celular simple para la separación subcelular de proteínas citoplásmicas y nucleares en biopsias intestinales humanas frescas y congeladas.
Abstract
El propósito de este protocolo es fraccionar tejido intestinal humano obtenido por endoscopia en compartimentos citoplásmicos y nucleares para el análisis de localización de proteínas específicas o complejos de proteína en Estados diferentes del tejido (es decir, saludable frente a la enfermedad). Este método es útil para el fraccionamiento de ambas muestras de tejido intestinal frescos y congelados; es fácilmente accesible para todos los laboratorios y no requiere mucho tiempo.
Introduction
Las proteínas participan en casi todas las funciones biológicas dentro de una célula y cualquier variación en su estructura, la cantidad o la ubicación puede conducir a un escenario de patógeno. Métodos de fraccionamiento de muestras de tejido son un método útil para reducir la complejidad de la enfermedad relacionados con el análisis de la proteína. Algunos estudios utilizan información de localización de la proteína o enriquecen una proteína de un compartimento celular específico, por lo que un protocolo reproducible fraccionamiento de proteínas intactas es útil para responder a ciertas cuestiones biológicas. Determinación de la localización subcelular de las proteínas y vigilar su redistribución compartimentación o interacciones en basal y las condiciones de la enfermedad ayudará a identificar la enfermedad relacionada con las diferencias funcionales1,2. Así, este método pretende fraccionar reproducible las biopsias de tejido intestinal, frescas y congeladas, en compartimentos subcelulares citoplásmicas y nucleares.
Las muestras de biopsia intestinal habitualmente se obtienen durante la endoscopia procedimientos3 (figura 1) y pueden ser utilizadas eficazmente para la cuantificación de la proteína o los estudios de inmunoprecipitación. Puesto que las muestras de tejido del intestinal epitelios contiene proteínas que pueden estar directamente involucradas en la patogénesis de la enfermedad4, las muestras de biopsia intestinal son una fuente muy valiosa para la identificación exitosa de específicos de la enfermedad intestinal proteínas. Muestras de tejido congelado, paciente almacenados junto con la información clínica son recursos útiles para el análisis de la proteína, y una preparación simple y reproducible es una cuestión clave para proporcionar información de compartimentación celular utilizando cantidades limitantes de congelados tejido5.
Hay varios kits disponibles en el mercado para la separación de fracciones celulares, pero son más caras y generalmente más lento que el protocolo presentado aquí. Protocolos basados en varios pasos centrifugación degradado y gradientes continuos también se han utilizado previamente para el fraccionamiento de los diversos compartimentos celulares en diferentes tejidos6,7. Sin embargo, mantener la consistencia de gradientes continuos suele ser una tarea difícil. Similares protocolos basados en la secuencial lisis de las membranas se han descrito anteriormente pero generalmente necesitan más de dos tampones y las manos el tiempo es más largo8 .
Fraccionamiento de muestras de tejido, tener en cuenta ese tejido muestras presentes célula-célula y célula-matriz de interacciones que son no presentes en células cultivadas e importantes cuando proceder a la extracción de proteínas. El adecuado desglose entre células y matriz extracelular sin afectar la calidad de la proteína será un factor crítico en el tejido intestinal proteínas aislamiento9. En este protocolo, contactos célula-célula y célula matriz primero se rompen, liberando las células y permitiendo que el búfer llegar a las células individuales. Para evitar la proteína-compartimiento de mezcla antes del fraccionamiento, la ruptura de los contactos debe ocurrir sin alterar la integridad de las células o las membranas nucleares.
Por el enriquecimiento de distintas proteasas en la mucosa intestinal10, es importante para el control de la degradación de la proteína durante la extracción. Para minimizar la potencial degradación de las proteínas, múltiples inhibidores de proteasa deben incluirse en los buffers de extracción de proteína. Además, si extractos van a utilizarse para el análisis funcionales, es esencial para evitar la desnaturalización de las proteínas o la proteólisis, pues esto ocasionará una pérdida de proteína actividad11. Para ello, el protocolo se lleva a cabo a 4 ° C y fresco phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) se añade a los buffers en una concentración final de 0,1 mM justo antes de usar además inhibir la proteólisis.
El primer paso en el fraccionamiento celular es interrupción de tejido y lisis celular. Como se mencionó anteriormente, el objetivo es separar las células y les abren con mínimo daño de rotura. Las muestras de tejido intestinal deben ser homogeneizadas y lisis de las células para lograr máxima rotura de la membrana celular. En este protocolo, utilizamos una batidora de mano motorizado para romper el tejido intestinal que se homogeneiza dentro de segundos por medio de la acción de Vortex de alta velocidad. Después de la homogeneización, se incuban las células del tejido en un tampón hipotónico que estallará la membrana de la célula pero mantendrá los núcleos intactos, seguido por la adición de un detergente no desnaturalizantes (nonil phenoxypolyethoxylethanol) y un vortex corto para separar los núcleos de la fracción citoplasmática. Después de la separación del citoplasma, la membrana celular de los núcleos es irrumpió en un buffer hipertónico con agitación.
El método presentado aquí es un método adecuado para el fraccionamiento subcelular de las biopsias intestinales frescos y congelados que se han obtenido durante procedimientos endoscópicos y oscilan entre los 2 y 10 mg de peso. El protocolo es fácil y reproducible y se podría realizar utilizando equipos de laboratorio básicos y reactivos en menos de una hora.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Consejo de ética de Hospital de Universitario de Cruces y los análisis se realizaron después de que se obtuvo consentimiento informado de todos los sujetos o a sus padres.
1. biopsia de la colección
Nota: Especímenes de la biopsia de duodeno distal de pacientes se obtienen durante la endoscopia de diagnóstico rutinaria gestión de biopsias que varían entre 2 y 10 mg de peso. Tejido hecho una biopsia es un tejido complejo compuesto por diversos tipos celulares incluyendo células epiteliales, inmunes y endoteliales. Gastroenterólogos clínicos realizan la endoscopia siguiente establecido guías de práctica clínicas.
- Colocar la biopsia en un papel de filtro estéril justo después de la endoscopia.
- Utilice pinzas para transferir las biopsias en tubos de 1,5 mL, remójelos con PBS y colóquelo en un criotubo.
- Mantener los tubos en hielo hasta que llegan al laboratorio.
- Iniciar proceso de biopsias frescas inmediatamente.
- De biopsias congeladas, flash congelación de la biopsia que contienen tubos y almacenar en nitrógeno líquido hasta su utilización.
Nota: Es importante mantener la muestra congelada hasta que se añade el buffer suplementado frío 1.
2. preparación de buffer
Nota: Antes de iniciar, complementar los buffers como sigue.
- Añadir 1 mM TDT (concentración final) y proteasa y fosfatasa inhibidor de cóctel (1 x concentración final) en el búfer hipotónico hipertónico y 1 Tampón 2 (tabla 1).
- Preparar 1,5 mL de tampón 1 y 150 μL de tampón 2 por muestra. TDT previene la oxidación de las muestras.
- Preparar el tampón de lavado núcleos mediante la adición de detergente al 1% (nonil phenoxypolyethoxylethanol) a una concentración final de 0.1% en el búfer ya completado 1. Preparar 1 mL de tampón de lavado núcleos por muestra.
3. biopsia de la homogeneización
-
Biopsias frescas
- Coloque el mortero descartable en el mezclador motorizado. Garantizar que el mortero llegue a la parte inferior del tubo.
- Sacar la biopsia desde el criotubo y colóquelo en un tubo de 1,5 mL con una pipeta.
- Añadir 200 μL de buffer suplementado 1 al tubo de 1,5 mL.
- Homogeneizar la biopsia con la mano del mortero hasta que el tejido es totalmente trastornado y mantenerlo en hielo.
- Una vez que todas las biopsias son homogeneizadas continúe con el paso 4.
Nota: Disponibles Pisones deben cambiarse entre las biopsias.
-
Biopsias congeladas
PRECAUCIÓN: Manipule nitrógeno líquido cuidadosamente; contacto del nitrógeno líquido con la piel o los ojos puede causar daños de congelación. Proteger las manos y los ojos siempre con nitrógeno líquido.- Tomar algunos nitrógeno líquido en una caja para almacenar criotubos obtenido desde el tanque de nitrógeno.
- Encontrar la biopsia en el tanque de nitrógeno y el criotubo en la caja con el nitrógeno líquido. Repita este paso para todas las biopsias.
- Transferencia de la biopsia de la criotubo a un tubo de 1,5 mL.
Nota: Las biopsias se unirá al tubo de congelados. Empuje la biopsia con una pipeta estéril para que se desprenda del tubo. - Añadir 200 μL de buffer suplementado 1.
- Homogeneizar el tejido con la maja y el mortero hasta que el tejido se interrumpe totalmente, manteniendo la temperatura a 4 ° C a lo largo de todo el procedimiento.
Nota: No deje que las biopsias descongelar antes de agregar el buffer.
4. citoplasma aislamiento
- Incubar la biopsia homogeneizada en hielo durante 10 minutos.
- Añadir 10 μl de detergente al 1% (nonil phenoxypolyethoxylethanol) a cada muestra a una concentración final de 0.05%.
Nota: Las células se hinchan y estallan por lisis osmótica como el detergente, se interrumpirán la membrana celular. - Incubar en hielo durante 5 minutos.
- Mezclar brevemente y centrifugar a 400 x g a 4 ° c por 2 min.
- Después de Vortex, quite el sobrenadante y transferir a un tubo limpio de 1.5 mL nuevo; se trata de la fracción citoplasmática. Deseche los pellets.
5. nuclear aislamiento
- Resuspender el precipitado del paso anterior con 200 μL de tampón de lavado de núcleos.
- Centrifugar el tubo durante 2 min a 400 x g a 4 ° C.
- Deseche el sobrenadante y repetir el lavado dos veces más.
Nota: El lavado eliminará contaminación citoplásmica en la fracción nuclear. - Después del tercer lavado, Resuspender el precipitado en 100 μl de buffer 2.
- Agitar la muestra vigorosamente a 4 ° c durante 30 minutos o bien, incubar la muestra en hielo y agitar cada 5 min.
- Después de agitar, centrifugar la muestra 10 min a velocidad máxima (> 12.000 x g) y 4 ° C.
- Después de Vortex, transferir el sobrenadante a un nuevo 1.5 limpio. tubo mL. Se trata de la fracción nuclear.
6. cuantificación de proteínas
Nota: Cuantificar las proteínas bicinchoninic ácido (BCA) proteína análisis kit. La concentración de proteínas en las fracciones que van entre 0.5 y 5 μg/μl, siendo menor en la fracción nuclear (ver tabla 2 para las concentraciones de la proteína resultantes de las biopsias de 2 mg).
- Preparar una curva estándar con los siguientes albúmina de suero bovino (BSA) cantidad (μg)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- Preparar los reactivos necesarios para utilizar 100 μl de la mezcla final de BCA por muestra.
- Pipetear 2 μl de cada fracción de proteína en un plato bien 96, añadir la mezcla BCA y siga las instrucciones del fabricante para la lectura.
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Representative Results
La figura 1 muestra una hematoxilina eosina de una sección de la biopsia intestinal con las vellosidades intactas y las estructuras de la cripta.
Resultados representativos de fraccionamiento citoplasmática y nuclear mediante este protocolo se muestran en las figuras 2 y 3. En el experimento se muestra en la figura 2, un fresco (Fh) y un helado (Fz) biopsia al mismo tiempo se fracciona siguiendo el protocolo que presentamos y un western blot se realizó con 20 μg de cada muestra. Concentraciones de proteína en cada fracción y biopsia se muestran en la tabla 2, y las concentraciones de proteína no son muy diferentes entre el fresco y el tejido congelado. La producción de proteína extraída de las biopsias de 2 mg es alrededor de 3-4 μg/μl de la fracción citoplasmática y aproximadamente 1,5 μg/μl de la fracción nuclear. Para comprobar la pureza de las fracciones, HSP90 y tubulina como controles se utilizaron un citoplásmico y HDAC1 y H3 como controles nucleares13. Puede observarse que HSP90 y tubulina son primarios situado en el citoplasma y HDAC1 y H3 se encuentran en el núcleo con la mínima mezcla entre las dos fracciones. Para determinar si el protocolo afecta a la muerte celular, hemos borrado también de la presencia de caspasa 3. De la figura 2, ambas muestras presentan una coloración muy mínima para la caspasa 3, confirmando que el procedimiento no afecta la vía de muerte celular incluso después de las biopsias de la congelación de flash. También se analizó si modificaciones de proteínas se mantienen después del procedimiento, por lo que las proteínas pueden utilizarse para posteriores ensayos funcionales. PhosphoSTAT1 fue utilizado para la tinción como la biopsia congelada en este fraccionamiento de un individuo con una enfermedad inflamatoria intestinal; Esto no es cierto de la biopsia fresca. Como era de esperar, phosphoSTAT1 se encuentra en el citoplasma de la biopsia congelada, confirmando que las modificaciones de la proteína se mantienen después de fraccionamiento.
La reproducibilidad del método utilizando biopsias congeladas se muestra en la figura 3. Una mancha blanca /negra occidental fue realizada después de fraccionamiento de la independiente tres congeladas de las biopsias, y las fracciones están limpias con proteína mínima del compartimiento de mezcla (Figura 3A): HSP90 ubicado en la fracción citoplasmática y HDCA1 en la fracción nuclear. Además, la proteína XPO1 que está presente en ambas fracciones citoplasmáticas y nucleares14 también fue borrada. Puede observarse que los niveles de XPO1 cuantificados mediante ImageJ son estables en cada fracción (figura 3B), confirmando la reproducibilidad de los resultados utilizando diferentes biopsias.
Figura 1 : Micrografía de luz de una sección epitelial intestinal, manchada con hematoxylin eosina, de una biopsia adquirida por procedimiento endoscópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Representante de Western blot de un fraccionamiento subcelular realizado en un fresco (Fh) y una biopsia de congeladas la (Fz). Hsp90 y tubulina fueron utilizados como controles citoplásmicos y HDAC1 y H3 como controles nucleares. También se evaluaron la presencia de CASP3 y phosphoSTAT3.
Figura 3 : Resultados del fraccionamiento de la independiente tres congeladas de las biopsias. (A) representante de Western blot de un fraccionamiento subcelular realizado en biopsias congeladas tres (1, 2 y 3). Hsp90 se utilizó como control citoplásmico y HDAC1 como control nuclear. También se evaluó la localización de XPO1. (B) cuantificación relativa de XPO1 en cada uno de la fracción realizada utilizando el software ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tampón de | Componentes | Notas |
| Tampón hipotónico 1 | pH HEPES 10 mM 7.9 | 1,5 ml de tampón/muestra |
| 10 mM de KCl | ||
| EDTA 0.1 nmM | ||
| Hipertónica buffer 2 | pH HEPES 20 mM 7.9 | 150 μL de tampón/muestra |
| 400 mM NaCl | ||
| 0.1 mM EDTA | ||
| * Nota: Buffers pueden almacenarse a 4 º c durante un mes. | ||
| ** Nota: Buffers tienen que complementarse con los inhibidores de la proteinasa y fosfatasa y TDT antes del uso | ||
Tabla 1: Composición de búfer.
| Fresco | Congelados | |
| Citoplasma | 2.975 | 4.612 |
| Núcleo | 1.516 | 1.385 |
Tabla 2: Concentración de proteína de cada una de las fracciones en una biopsia de frescos y congelados 2 mg utilizados en la figura 2; concentración se presenta en μg/μL.
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Discussion
El protocolo aquí descrito se utiliza para el fraccionamiento citoplasmático y nuclear de las biopsias intestinales. Las proteínas purificadas no son desnaturalizadas y puede ser utilizadas no sólo en el análisis de western blot como se muestra en la figura 2 y 3 y también en ensayos que requieren proteínas doblado nativo como inmunoprecipitación, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (página).
El método descrito se basa en la homogeneización mecánica del tejido junto con lisis osmótica estalle la membrana celular sin afectar a la membrana nuclear. El resultado es un limpio fraccionamiento de las proteínas citoplasmáticas y nucleares que se utilizará para los análisis posteriores. Es importante controlar la degradación de las proteínas durante el proceso de la adición de inhibidores de la proteína y fosfatasa. Por otra parte, si las proteínas extraídas se van a utilizar para posteriores ensayos funcionales, también es importante evitar la desnaturalización y proteolisis de las muestras. Los procesos deben realizarse a 4 º C y PMSF se debe agregar también a los buffers.
El procedimiento descrito en el presente Protocolo es simple y asequible, y el tiempo de procesamiento de la muestra es mínimo. Problemas tales como largos tiempos de procesamiento y el uso de kits de fraccionamiento costosos no son las limitaciones en el presente Protocolo.
Biopsias frescas y congeladas pueden tanto ser utilizadas en este protocolo, con biopsias congeladas dando resultados bastante limpio y reproducible fraccionamiento como se ve en la figura 2 y 3. Si hay contaminación de compartimiento, puede reducirse el tiempo de lisis de la célula para evitar la liberación de nuclear al citoplasma y pasos de lavado puede agregarse para evitar la contaminación citoplasmática en el compartimento nuclear.
La posibilidad de utilizar los tejidos congelados para el análisis independiente para las fracciones de proteínas citoplasmáticas y nucleares puede aumentar nuestro conocimiento sobre las enfermedades inflamatorias intestinales en el que se almacenan las biopsias congeladas. Por otra parte, esta técnica podría ser adaptada a otros tipos de tejidos humanos adquiridos por biopsias. El volumen de búferes utilizados debe modificarse dependiendo del tamaño de la biopsia.
El protocolo descrito aquí está diseñado para generar fracciones de tejido reproductivo; sin embargo, cierta variabilidad intrínseca dentro de la muestra, incluyendo el tamaño y el estado del tejido puede llevar a desviaciones en la cantidad de proteína y la distribución en cada fracción.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen la asistencia de Ander Lopez y Miren Telletxea para video grabación y edición. ACR es financiado por una beca de Ikerbasque y un proyecto de investigación de Asociación de Celiacos de Madrid (ACM). OCR es financiado por el proyecto ISCIII-PI16/00258 y cofinanciado por el Unión Europea FEDER/FSE "Una manera de hacer Europa". ES financiado por una subvención de proyecto de investigación 2015111068 del Departamento vasco de sanidad. IRG y AJM son apoyados por becas de beca predoctoral de la UPV/EHU y el Departamento vasco de educación, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
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