Summary
Burada, insan taze ve donmuş bağırsak biyopsisi sitoplazmik ve nükleer proteinlerin hücre altı ayrılması için basit bir hücresel ayırma gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Bu iletişim kuralının amacı insan bağırsak dokusu tarafından endoskopi yerelleştirme analizi için nükleer ve sitoplazmik bölmeleri spesifik proteinlerin veya protein kompleksleri (Yani, sağlıklı farklı doku Birleşik Devletleri içine elde edilen fractionate etmektir hastalığı) vs . Bu yöntem her iki taze ve donmuş bağırsak doku örneği ayırma için yararlıdır; Tüm laboratuarlar için kolayca erişilebilir ve zaman alıcı.
Introduction
Bir hücre içinde hemen hemen tüm biyolojik fonksiyonları proteinler katılmak ve herhangi bir varyasyon kendi yapısı, miktar veya konumu patojenik bir senaryo için neden olabilir. Doku örneği ayırma yöntemleri çoğu hastalık karmaşıklığını azaltmak için yararlı bir yaklaşım ile ilgili protein analizleri. Bazı çalışmalarda protein yerelleştirme bilgileri kullanın veya belirli bir hücresel bölme bir protein olduğu gibi proteinlerin tekrarlanabilir ayırma için bir protokol biyolojik bazı soruları cevaplamak yararlı bu yüzden zenginleştirmek. Proteinlerin hücre altı yerelleştirme belirleme ve kendi compartmental yeniden dağıtım veya etkileşimler, bazal izleme ve hastalık koşulları hastalığı tanımlamak yardımcı olacak ilgili işlevsel farklılıklar1,2. Bu nedenle, bu yöntem tekrarlanarak bağırsak doku biyopsisi, taze ve donmuş, sitoplazmik ve nükleer hücre altı bölmeleri içine fractionate amaçlamaktadır.
Bağırsak biyopsisi örnekleri rutin olarak endoskopi işlemleri3 sırasında (Şekil 1) elde edilen ve etkin bir şekilde protein miktar veya immunoprecipitation çalışmalar için kullanılabilir. Epitel doku örnekleri bağırsak üzerinden doğrudan hastalık patogenezinde4' te tutulabilir proteinler içerdiğinden, bağırsak biyopsisi bağırsak hastalığa özgü başarılı tanımlanması için çok değerli bir kaynak olduğu proteinler. Saklı donmuş, hasta doku örnekleri klinik bilgilerinin yanı sıra protein analizi için yararlı kaynak vardır ve bir basit ve tekrarlanabilir numune hazırlama sınırlayıcı miktarda kullanarak hücre compartmental bilgileri sağlamak için önemli bir konudur dondurulmuş doku5.
Hücresel kesirler ayrılması için birkaç piyasada kitleri vardır, ama bunlar daha pahalı ve genellikle daha fazla zaman alıcı burada sunulan protokolü daha. Birden fazla adımlı degrade Santrifüjü protokolleri temel ve sürekli degradeler da daha önce farklı dokuların6,7farklı hücresel kompartmanlarda ayırma için kullanılmıştır. Ancak, sürekli degradeler tutarlılığını sağlamak kez zor bir iştir. Membranlar sıralı lizis üzerinde dayalı benzer iletişim kuralları daha önce tarif var ama onlar genellikle ikiden fazla arabellekleri ve gerekir zaman ellerde uzun8 .
Doku örnekleri parçalanması zaman, o doku protein ayıklama için devam zaman kültürlü hücreleri mevcut hem önemli örnekleri mevcut hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri unutmayın. Hücreleri ve hücre dışı matriks protein kalitesini etkilemeden arasında uygun arıza bağırsak dokusu protein yalıtım9kritik bir etken olacaktır. Bu protokol için hücre-hücre ve hücre-matris kişiler ilk kırık, hücreleri serbest ve tek tek hücreler ulaşmak için tampon izin vardır. Protein-yuvası ayırma önce karıştırma önlemek için kişileri dökümünü hücreleri veya nükleer membran bütünlüğü değiştirmeden bulunması gerekir.
Bağırsak mukoza10çeşitli proteaz zenginleştirme nedeniyle, protein yıkımı ayıklama sırasında kontrol etmek önemlidir. Potansiyel protein yıkımı en aza indirmek için birden çok proteaz inhibitörü protein ayıklama arabellekleri içinde dahil edilmesi gerekir. Ayrıca, özleri fonksiyonel deneyleri için kullanılmak üzere kullanacaksanız, bu protein etkinliği11kaybına neden olur gibi proteinler veya proteolizis denatürasyon önlemek önemlidir. Bu amaçla, protokol 4 ° C'de gerçekleştirilir ve taze phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) 0.1 mM daha fazla proteolizis etkisizleştirmek için kullanmak için sadece önceki son bir konsantrasyon, arabellekleri eklenir.
İlk hücre ayırma doku bozulması ve hücre lizis adımıdır. Daha önce de belirtildiği gibi hücreler ve onları en az hasar ile açık kırıldığını disaggregate hedefidir. Bağırsak doku örnekleri homojenize gerekir ve hücreleri hücre zarı maksimum kırılma elde etmek için lysed. Bu protokol için saniye içinde yüksek hızlı vortexing eylem yoluyla homojenize bağırsak dokusu kırmak için bir motorlu havaneli karıştırıcı kullanın. Homojenizasyon sonra doku hücreleri hücre zarı patlama olacak ama çekirdeklerin olduğu gibi bir sigara denaturing deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ve çekirdekleri ayırmak için kısa bir girdap eklenmesi tarafından takip devam edecek hipotonik, arabellek içinde inkübe sitoplazmik kesir. Sitoplazma kaldırıldıktan sonra sallayarak ile hipertonik bir arabellek içine hücre çekirdek zarı patladı.
Burada sunulan yöntemi endoskopik yordamlar ve Aralık içinde ağırlık 2 ve 10 mg arasında sırasında elde edilen taze ve donmuş bağırsak biyopsisi hücre altı ayırma için uygun bir yöntemdir. İletişim kuralı kolay ve tekrarlanabilir ve temel laboratuvar donatım ve bir saat içinde reaktifler kullanarak gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada Cruces Üniversitesi Hastane etik kurulu tarafından kabul edildi ve aydınlatılmış onam tüm konular ya da aileleri elde sonra analizleri gerçekleştirilmiştir.
1. biyopsi koleksiyonu
Not: Biyopsi örnekleri hastaların distal duodenum dan bu aralıktaki arasında 2 ve 10 mg kilo biyopsi yönetme rutin tanı endoskopi sırasında elde edilir. Biyopsi doku, bağışıklık epitel ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre türleri oluşan karmaşık bir dokudur. Klinik gastroenterologlar endoskopi gerçekleştirmek aşağıdaki kurulan klinik yönergeleri.
- Biyopsi endoskopi sonra steril bir filtre kağıdı yerleştirin.
- Forseps biyopsi 1,5 mL tüpler transfer için PBS ile ıslatın ve bir cryotube koyun kullanın.
- Laboratuarda gelene tüpler buz üzerinde tutun.
- Taze biyopsileri hemen işleme başlayın.
- Donmuş biyopsileri, flaş tüpler içeren biyopsi donma ve sıvı azot kadar kullanmak saklarız.
Not: Soğuk desteklenmiştir arabellek 1 eklenene kadar donmuş örnek tutmak önemlidir.
2. arabellek hazırlık
Not: başlamadan önce arabellekleri aşağıdaki gibi ek.
- 1 mM DTT (son konsantrasyonu) ekleyin ve proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl (1 son konsantrasyonu x) 1 ve hipertonik hipotonik tampon tampon 2 (Tablo 1).
- Arabellek 1 ve 150 µL arabelleğinin 2 örnek başına 1,5 mL hazırlayın. DTT örnekleri oksidasyonunu engeller.
- Çekirdeklerin yıkama arabellek % 1 deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ekleyerek zaten desteklenmiştir arabelleğine %1 0.1 son bir konsantrasyon için hazır olun. 1 mL örnek başına çekirdek yıkama tamponunun hazırlayın.
3. biyopsi homojenizasyon
-
Taze biyopsi
- Tek kullanımlık havaneli motorlu Mikser yerleştirin. Havaneli tüp alt ulaştığından emin olmak.
- Biyopsi cryotube çıkar ve bir pipet ucu ile 1,5 mL tüp yerleştirebilirsiniz.
- 200 µL desteklenmiştir arabelleği 1 1,5 mL tüp ekleyin.
- Doku tamamen bozulur kadar biyopsi havaneli ile homojenize ve buz üzerinde tutun.
- Bir kez tüm biyopsiler homojenize adım 4 ile devam edin.
Not: Tek kullanımlık dibekler biyopsi arasında değiştirilmesi gerekir.
-
Donmuş biyopsi
Dikkat: sıvı azot dikkatle ele; sıvı azot ile cilt veya gözlerle temas ciddi donma yaralanmalara neden olabilir. Eller ve gözler her zaman sıvı azot ile çalışırken korumak.- Bazı sıvı azot azot tankından alındı cryotubes depolamak için bir kutu almak.
- Biyopsi azot depoda bulun ve sıvı azot ile kutusunda cryotube takın. Biyopsi için bu adımı yineleyin.
- Biyopsi cryotube 1.5 mL tüp aktarın.
Not: Biyopsi için dondurulmuş Tüp bağlı olacak. Tüm tüpünden ayırarak biyopsiyi steril pipet ucu ile itmek. - 200 µL desteklenmiştir arabelleği 1 ekleyin.
- Doku havaneli ve harç doku tamamen bozulur kadar kullanarak, tüm prosedürü boyunca 4 ° C sıcaklıkta muhafaza lunaparkçı.
Not: arabellek eklemeden önce çözülme biyopsi izin vermeyin.
4. sitoplazma yalıtım
- 10 dakika buzda homojenize biyopsi kuluçkaya.
- Her örnek % 0.05 son bir konsantrasyon için 10 µL % 1 deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ekleyin.
Not: Hücreleri şişmeye ve hafif deterjan hücre zarı bozabilir olacaktır gibi ozmotik lizis tarafından patladı. - Buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya.
- Kısaca girdap ve 2 min için 4 ˚C'de 400 x g, santrifüj.
- Vortexing sonra süpernatant kaldırmak ve yeni bir temiz 1.5 mL tüp transferi; Bu sitoplazmik kesir olacak. Pelet atmayın.
5. nükleer yalıtım
- Pelet 200 µL çekirdeği yıkama arabelleği ile önceki adımdaki resuspend.
- Tüp 400 x g ve 4 ° c de 2 dk santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atın ve iki kez daha çamaşır yordamı yineleyin.
Not: Yıkar nükleer kesir sitoplazmik kirlenme kaldırmak olacaktır. - Sonra üçüncü yıkama, Pelet arabellek 2 100 µL içinde resuspend.
- Örnek 4 ˚C 30 dakika süreyle, alternatif olarak shake şiddetle, örnek buz ve girdap her 5 dk üzerinde kuluçkaya.
- Sallayarak sonra örnek üst hızda 10 dk santrifüj kapasitesi (> 12.000 x g) ve 4 ° c
- Vortexing sonra yeni bir temiz 1.5 süpernatant aktarın. mL tüp. Bu nükleer kesir olacak.
6. protein miktar
Not: bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil kiti ile proteinler ölçmek. Kesirler proteinlerin konsantrasyonu 0.5 ve 5 µg/µL, nükleer kesir daha düşük olma arasındaki aralığı olacaktır (bkz. protein konsantrasyonları 2 mg biyopsi sonuç için Tablo 2 ).
- Aşağıdaki Sığır serum albumin (BSA) tutarların (µg)12ile standart bir eğri hazırlamak: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- Son BCA Mix örnek başına 100 µL kullanmak için gerekli reaktifler hazırlayın.
- Her protein fraksiyonu 96 iyi plaka 2 µL pipet, BCA karışımı ekleyin ve okumak için üreticinin yönergelerini izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 bir hematoksilen eozin boyama sağlam villus ve mezar yapıları ile bir bağırsak biyopsisi bölümünün gösterir.
Bu iletişim kuralını kullanan nükleer ve sitoplazmik ayırma temsilcisi sonuçları rakamlar 2 ve 3' te gösterilmiştir. Şekil 2, bir taze (Fh) ve dondurulmuş (Fz) gösterilen deneyinde biyopsi aynı anda şeker burada sunulan protokol sonrası ve western blot her örneğinin 20 μg kullanılarak gerçekleştirildi. Protein konsantrasyonları her kesir ve biyopsi Tablo 2' de gösterilen ve protein konsantrasyonları taze ve donmuş doku arasında çok farklı değildir. 2 mg biyopsileri çıkarılan protein verimini civarındadır 3-4 µg/µL sitoplazmik kesir ve yaklaşık 1,5 µg/µL nükleer kesir. Kesirler saflığı kontrol etmek için HSP90 ve tübülin sitoplazmik denetimleri kullanıldı ve HDAC1 ve H3 olarak nükleer denetimler13. HSP90 ve tübülin sitoplazma içinde bulunan birincil ve çok az iki kesirler arasında karıştırma ile çekirdeği HDAC1 ve H3 bulunan görülebilmektedir. Protokol hücre ölümü etkiler değerlendirmek için aynı zamanda caspase 3 varlığı için deyimiyle. Şekil 2' den, bir çok az boyama prosedürü bile biyopsileri dondurma patlamadan sonra hücre ölüm yolu etkilemez caspase 3 teyit için her iki örnekleri mevcut. Proteinler aşağı akım fonksiyonel deneyleri için kullanılacak şekilde işlemden sonra protein değişiklikler korunur eğer Ayrıca analiz edildi. PhosphoSTAT1 bağırsak bir inflamatuar durumu ile bir birey bu ayırma kullanılan dondurulmuş biyopsi geldiği gibi boyama için kullanılan; Bu taze biyopsi doğru değildir. Beklendiği gibi phosphoSTAT1 protein değişiklikler ayırma sonra sürdürülür teyit donmuş biyopsisi, sitoplazma içinde yer alır.
Donmuş biyopsi kullanarak yöntemi tekrarlanabilirlik Şekil 3' te gösterilmiştir. Bir western blot üç bağımsız biyopsi donmuş ayırma sonra gerçekleştirilmiş ve kesirler (Şekil 3A) karıştırma en az yuvası protein ile temiz: HSP90 bulunan sitoplazmik kesir ve HDCA1 nükleer kesir. Ayrıca, her iki nükleer ve sitoplazmik kesirler14 ' te mevcut XPO1 protein Ayrıca deyimiyle. ImageJ tarafından sayısal XPO1 düzeyde tekrarlanabilirlik kullanarak farklı biyopsi sonuçlarının onaylayan her fraksiyonu içinde (3B rakam), istikrarlı görülebilmektedir.
Resim 1 : Işık test bölümünün endoskopik yordam tarafından alınan biyopsi üzerinden hematoksilen eozin ile lekeli bir bağırsak epitel,. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Temsilcisi Western blot bir hücre altı ayırma, gerçekleştirilen bir taze (Fh) ve dondurulmuş (Fz) biyopsi. HSP90 ve tübülin sitoplazmik denetimleri ve HDAC1 ve H3 nükleer denetimler olarak kullanılmıştır. CASP3 ve phosphoSTAT3 varlığı da tespit.
Şekil 3 : Üç bağımsız donmuş biyopsi sonuçlarını ayırma. (A) temsilcisi Western blot bir hücre altı ayırma, gerçekleştirilen üç donmuş biyopsiler (1, 2 ve 3). HSP90 sitoplazmik denetim ve HDAC1 olarak nükleer bir denetim olarak kullanılmıştır. XPO1 lokalizasyonu da değerlendirildi. (B) göreli miktar XPO1, her fraksiyonunun ImageJ yazılımı kullanılarak yapılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Arabellek | Bileşenleri | Notlar |
| Hipotonik tampon 1 | 10 mM HEPES pH 7,9 | 1.5 ml arabellek/örnek |
| 10 mM KCl | ||
| 0.1 nmM EDTA | ||
| Hipertonik tampon 2 | 20 mM HEPES pH 7,9 | 150 µl arabellek/örnek |
| 400 mM NaCl | ||
| 0,1 mM EDTA | ||
| * Not: Arabellekleri 4ºC bir ay boyunca saklanır. | ||
| ** Not: İndinavir ve fosfataz inhibitörleri ve DTT ile kullanmadan önce takıma girecek arabellekleri temizlemesini sağlamak | ||
Tablo 1: Arabellek oluşturma.
| Taze | Donmuş | |
| Sitoplazma | 2.975 | 4.612 |
| Çekirdeği | 1.516 | 1.385 |
Tablo 2: Protein konsantrasyonu her Şekil 2' de kullandığınız taze ve donmuş 2 mg biyopsi kesirler; konsantrasyon μg/μL içinde sunulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokolü bağırsak biyopsisi nükleer ve sitoplazmik ayırma için kullanılır. Saf protein denatüre değil ve sadece Şekil 2 ve 3 ' te ama aynı zamanda immunoprecipitation, elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan) gibi yerli katlanmış proteinlerin gerektiren deneyleri içinde gösterildiği gibi Batı leke analiz kullanılabilir veya yerli polyacrylamide jel elektroforez (sayfa).
Açıklanan yöntemi ile birlikte nükleer membran etkilemeden hücre zarı patlamaya ozmotik lizis dokusunun mekanik homojenizasyon kullanır. Proteinlerin aşağı akım analizleri için kullanılmak üzere her iki sitoplazmik ve nükleer bir temiz ayırma sonucudur. Protein yıkımı işlemi sırasında protein ve fosfataz inhibitörleri eklenmesi tarafından kontrol etmek önemlidir. Aşağı akım fonksiyonel deneyleri için kullanılmak üzere ayıklanan proteinler vardır, Ayrıca, aynı zamanda denatürasyon ve proteolizis örneklerin önlemek önemlidir. Belgili tanımlık oluşum-meli var olmak kılınmak 4 ° C'de ve PMSF da arabellekleri için eklenmelidir.
Bu protokol için açıklanan yordamı basit ve uygun fiyatlı ve örnek işlem süresi en az düzeydedir. İşlem süreleri uzun ve pahalı ayırma kitleri kullanımı gibi sorunlar bu protokol kısıtlamaları değildir.
Taze ve donmuş biyopsi her ikisi de Şekil 2 ve 3' te görüldüğü gibi oldukça temiz ve tekrarlanabilir ayırma sonuçlarını veriyor donmuş biyopsi ile bu protokol için kullanılabilir. Bölme kirlenme ise, hücre lizis zaman sitoplazma nükleer sürüme önlemek için azaltılmış olabilir ve adımları yıkama nükleer yerde sitoplazmik kirlenmesini önlemek için eklenebilir.
Nükleer ve sitoplazmik protein kesirler için bağımsız analizi için dondurulmuş doku kullanma imkanı donmuş biyopsi saklandığı bağırsak inflamatuar hastalıklar hakkında bilgi artırabilirsiniz. Ayrıca, bu teknik insan doku biyopsisi tarafından alınan diğer tür adapte olabilir. Kullanılan arabellekleri hacmi biyopsi boyutuna bağlı olarak değiştirilmesi gerekir.
Burada açıklanan protokol tekrarlanabilir doku kesirler oluşturmak için tasarlanmıştır; Ancak, bazı içsel değişkenliğine örnek içinde belgili tanımlık büyüklük ve doku durumunu da dahil olmak üzere protein miktarı ve her kesir yönetilen dağıtım sapmalar yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Ander Lopez ve Miren Telletxea yardım video kayıt ve düzenleme için kabul. ACR Ikerbasque arkadaş grubu ve bir araştırma projesi Asociación de Celiacos Madrid (ACM) tarafından finanse edilmektedir. JRB proje ISCIII-PI16/00258 tarafından finanse edilen ve Avrupa Birliği ERDF/ESF tarafından "Avrupa nın yolunu" ortak finanse. Bu bir araştırma projesi hibe Bask Sağlık Bakanlığı tarafından 2015111068 finanse edilmektedir. IRG ve AJM HGUGM bursu hibe UPV/EHU ve Bask Department of Education, sırasıyla destekler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
