Summary
vivo microdialysis में जाग, स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों से मस्तिष्क मध्यवर्ती द्रव (ISF) में मौजूद अणुओं का संग्रह सक्षम है । आदेश में ISF में अपेक्षाकृत बड़े अणुओं का विश्लेषण करने के लिए, वर्तमान लेख विशेष रूप से microdialysis उच्च आणविक वजन काट झिल्ली के साथ जांच का उपयोग प्रोटोकॉल पर केंद्रित है ।
Abstract
विवो microdialysis में एक डायलिसिस सिद्धांत पर आधारित जागर, स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों से ISF इकट्ठा करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । जबकि microdialysis एक स्थापित विधि है कि अमीनो एसिड या न्यूरोट्रांसमीटर सहित अपेक्षाकृत छोटे अणुओं के उपाय है, यह हाल ही में भी उच्च आणविक वजन कट के साथ जांच का उपयोग कर ISF में बड़े अणुओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है झिल्ली. इस तरह की जांच का उपयोग करने पर, microdialysis जांच के अंदर संचित दबाव से बचने के लिए एक पुश-पुल मोड में चलाया जा करने के लिए है । यह लेख stereotaxic सर्जरी सहित चरण दर चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है और कैसे ISF से प्रोटीन इकट्ठा करने के लिए microdialysis लाइनों स्थापित करने के लिए । microdialysis के दौरान, दवाओं या तो प्रणालीबद्ध या ISF में प्रत्यक्ष अर्क द्वारा प्रशासित किया जा सकता है । रिवर्स microdialysis सीधे ISF में यौगिकों को भ्रमित करने के लिए एक तकनीक है । microdialysis छिड़काव बफर में दवाओं का समावेश उंहें जांच के माध्यम से ISF में फैलाना है, जबकि एक साथ ISF इकट्ठा करने की अनुमति देता है । एक उदाहरण के रूप में ताऊ प्रोटीन को मापने के द्वारा, लेखक दिखाता है कि कैसे अपने स्तर picrotoxin के रिवर्स microdialysis द्वारा ंयूरॉंस गतिविधि उत्तेजक पर बदल रहे हैं । लाभ और microdialysis की सीमाएं vivo तरीकों में अंय संयोजन द्वारा विस्तारित आवेदन के साथ वर्णित हैं ।
Introduction
ISF कुल मस्तिष्क की मात्रा का 15-20% शामिल है और संकेत transduction, सब्सट्रेट परिवहन और अपशिष्ट निकासी1के लिए महत्वपूर्ण microenvironment प्रदान करता है । इसलिए, पशुओं के रहने से ISF इकट्ठा करने की क्षमता विभिंन जैविक प्रक्रियाओं के लिए अधिक से अधिक निहितार्थ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग तंत्र प्रदान करेगा । vivo microdialysis में कुछ तरीकों में से एक है कि नमूना और जाग से ISF से extracellular अणुओं यों तो, स्वतंत्र रूप से पशुओं को ले जाने और इस तरह तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान क्षेत्र2,3में एक उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य करता है । इस विधि में, semipermeable झिल्ली के साथ microdialysis जांच मस्तिष्क में डाला जाता है और अपेक्षाकृत धीमी प्रवाह दर पर छिड़काव बफर के साथ perfused (0.1-5 µ l/ इस छिड़काव के दौरान, ISF में extracellular अणुओं निष्क्रिय एकाग्रता ढाल के अनुसार जांच में फैलाना और एक अपोहित के रूप में इकट्ठा । हालांकि यह लेख मस्तिष्क में ISF नमूना करने के लिए विधि पर केंद्रित है, दोनों सिद्धांत और विधि यदि आवश्यक हो तो उचित संशोधन के द्वारा अन्य अंगों के लिए लागू किया जा सकता है ।
Microdialysis पहले 1960 के दशक में कार्यरत था, और तब से यह बड़े पैमाने पर किया गया है एमिनो एसिड या न्यूरोट्रांसमीटर मस्तिष्क में सहित छोटे अणुओं को इकट्ठा करने के लिए. हालांकि, उच्च आणविक वजन कट ऑफ झिल्ली (१०० केडीए-3 एमडीए) के साथ microdialysis जांच की हाल ही में वाणिज्यिक उपलब्धता के रूप में अच्छी तरह से ISF में अपेक्षाकृत बड़ा प्रोटीन के लिए अपने आवेदन बढ़ाया है4,5,6 ,7. इन जांचों का उपयोग कर अध्ययन खोज करने के लिए नेतृत्व किया है कि ऐसे ताऊ या α-synuclein कि लंबे समय के लिए अनंय cytoplasmic होने के लिए सोचा था के रूप में प्रोटीन भी शारीरिक ISF4,5,8में मौजूद हैं ।
एक बड़ी (आमतौर पर १,००० केडीए से अधिक कट) झिल्ली के साथ microdialysis जांच का उपयोग कठिनाइयों का है कि वे और अधिक ultrafiltration द्रव जांच में संचित दबाव के कारण नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । Microdialysis जांच यहां इस्तेमाल एक अद्वितीय संरचना इस मुद्दे से बचने के लिए है । दबाव इस संरचना के कारण नहीं बनाया जाएगा, इस प्रकार इन जांचों के साथ microdialysis एक "पुश में संचालित किया जाना चाहिए पुल" एक सिरिंज पंप का उपयोग करने के लिए जांच perfuse (पुश =) और एक रोलर/सिकुड़नेवाला पंप जांच आउटलेट से आ रही अपोहित इकट्ठा करने के लिए (= खींचो) 9 (हालांकि यह दोनों धक्का और पुल पंपों की जरूरत है, जांच में मौजूद वेंट छेद रद्द दबाव के कारण, प्रणाली तकनीकी रूप से केवल पुल पंप द्वारा संचालित है) । यह लेख एक गाइड प्रवेशनी आरोपण के stereotaxic सर्जरी के साथ शुरू होता है और १,००० केडीए कट-ऑफ झिल्ली के साथ microdialysis जांच के माध्यम से ISF इकट्ठा करने के क्रम में microdialysis लाइनों स्थापित करने के लिए कैसे का वर्णन करता है.
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Protocol
सभी जानवरों के अध्ययन की समीक्षा की और संस्थागत पशु देखभाल और चिकित्सा के स्नातक स्कूल के टोक्यो विश्वविद्यालय में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. पूर्व शल्य प्रक्रिया
- सर्जरी शुरू करने से पहले, ७०% इथेनॉल के साथ सब कुछ पोंछ बाँझ शर्तों को बनाए रखने के लिए । थर्मल एक हीटिंग पैड का उपयोग कर समर्थन की सिफारिश की है ।
- चूहों को Anesthetize के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा chloral हाइड्रेट (४०० मिलीग्राम/ एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करके anesthetization की पुष्टि करें । प्रेरण और buprenorphine पर meloxicam SR का उपयोग कम से कम 24 ज के लिए वसूली बोली पर सिफारिश की है ।
- एक शल्य क्लिपर के साथ बाल दाढ़ी । माउस और नवजात चूहे अनुकूलक कान सलाखों और एक नाक दबाना का उपयोग में एक माउस को ठीक करें ।
नोट: यह सुनिश्चित करें कि माउस सिर इस स्तर पर सुरक्षित है और साथ-साथ स्थानांतरित नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है । - संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें ।
2. गाइड प्रवेशनी आरोपण के लिए Stereotaxic सर्जरी
- stereotaxic तंत्र पर माउस और नवजात चूहे अनुकूलक सेट करें । एक स्केलपेल का उपयोग खोपड़ी पर त्वचा पर एक चीरा sagittally बनाओ । एक नम कपास झाड़ू का उपयोग कर खोपड़ी पर रक्त और संयोजी ऊतक पोंछ ।
- मस्तिष्क एटलस का उपयोग कर ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र के लिए समंवय का निर्धारण । माप शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि midline सीधे इतना है कि ड्रिल बिट ए-पी ले जाया जा सकता है और पूरे समय midline टांका पर रहते हैं ।
नोट: इस आलेख का उपयोग करता है निर्देशांक (A/P:-३.१ mm, M/L:-२.५ mm, D/V:-१.२ mm, 12 डिग्री) पीछे हिप्पोकैम्पस लक्ष्य करने के लिए । - स्तर खोपड़ी A-P
- stereotaxic फ्रेम के एक जोड़तोड़ पर एक ड्रिल संलग्न । ड्रिल कम जब तक यह धीरे लैंब्डा छू और उसके ventral समंवय रिकॉर्ड । इस कार्यविधि को bregma के लिए दोहराएं ।
नोट: जब खोपड़ी स्तरित है, bregma के ऊर्ध्वाधर माप लैंब्डा के बराबर है । यदि नहीं, तो नाक दबाना तदनुसार की ऊंचाई समायोजित करें । खोपड़ी स्तरित हो जाता है के बाद, पूर्वकाल bregma का समन्वय/
- stereotaxic फ्रेम के एक जोड़तोड़ पर एक ड्रिल संलग्न । ड्रिल कम जब तक यह धीरे लैंब्डा छू और उसके ventral समंवय रिकॉर्ड । इस कार्यविधि को bregma के लिए दोहराएं ।
- स्तर खोपड़ी बाएं-दाएं
- ड्रिल bregma से समंवय करने के लिए ले जाएं (A/P:-३.१ mm, M/L: + २.० mm), खोपड़ी के लिए ड्रिल कम और ऊर्ध्वाधर समंवय रिकॉर्ड । फिर निर्देशांक (A/P:-३.१ mm, M/L:-२.० mm) के लिए इस कार्यविधि को दोहराएं ।
नोट: यदि खोपड़ी स्तरित है, midline से दो equidistant अंक के इन ऊर्ध्वाधर माप बराबर हैं । यदि नहीं, तो कान सलाखों की ऊंचाई समायोजित करें ।
- ड्रिल bregma से समंवय करने के लिए ले जाएं (A/P:-३.१ mm, M/L: + २.० mm), खोपड़ी के लिए ड्रिल कम और ऊर्ध्वाधर समंवय रिकॉर्ड । फिर निर्देशांक (A/P:-३.१ mm, M/L:-२.० mm) के लिए इस कार्यविधि को दोहराएं ।
- एक गड़गड़ाहट छेद ड्रिल ध्यान लक्ष्य पर समंवय (a/P:-३.१ mm, M/L:-२.५ mm) एक गाइड प्रवेशनी प्रत्यारोपण करने के लिए । यदि एक गड़गड़ाहट छेद के व्यास एक गाइड प्रवेशनी आरोपण के लिए पर्याप्त नहीं है, एक और छेद है कि पहले से एक के साथ ओवरलैप ड्रिल । सही पर एक और छेद ड्रिल (contralateral पक्ष) पार्श्विका हड्डी और एक हड्डी पेंच डालें, जो १.१० में दंत चिकित्सा सीमेंट सुरक्षित करने में मदद करता है ( चित्र 1bदेखें) ।
- एक उस्तरा ब्लेड से एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब के ढक्कन के पीछे की ओर से एक परिपत्र लॉकिंग टुकड़ा काट कर एक ' ' मुकुट ' ' । इस क्राउन को स्किन में फैलने से रोकने के लिए डेंटल सीमेंट का इस्तेमाल किया जाता है. यह खोपड़ी पर रखें ताकि गड़गड़ाहट छेद चरण २.५ में बने सर्कल के भीतर रहने ( 1 चित्रादेखें) ।
- एक stereotaxic अनुकूलक के छोटे हाथ पर एक गाइड प्रवेशनी डाल द्वारा एक stereotaxic विधानसभा की स्थापना की और यह एक टोपी अखरोट का उपयोग कर जकड़ना । इलेक्ट्रोड दबाना पर stereotaxic एडेप्टर की लंबी बांह सेट करें । यह stereotaxic तंत्र के जोड़तोड़ पर संलग्न ( चित्र 1aदेखें) ।
- 12 डिग्री ( चित्र 1bदेखें) द्वारा जोड़तोड़ बांह पर डी-V stereotax विधानसभा घुमाएं । १.६ में बना गड़गड़ाहट छेद करने के लिए गाइड प्रवेशनी हटो । गाइड प्रवेशनी धीरे मस्तिष्क में डालें १.२ mm से कम करके ।
नोट: जांच के कोण हिप्पोकैम्पस के लिए विशिष्ट है; अंय क्षेत्रों अंय कोण या बिल्कुल नहीं कोण की आवश्यकता हो सकती है । सटीक निर्देशांक के लिए एक ब्रेन एटलस से परामर्श करें । खोपड़ी की सतह सूखी, क्योंकि अगर नहीं सीमेंट छड़ी नहीं होगा और सीमेंट टोपी उखाड़ फेंकना बन सकता है - मुकुट के भीतर दंत सीमेंट जोड़ें गाइड प्रवेशनी के दोनों धातु भाग को पूरी तरह से कवर करने के लिए और हड्डी काफी पेंच उन्हें सुरक्षित करने के लिए । अगर वहाँ खोपड़ी का एक हिस्सा उजागर अतिरिक्त दंत सीमेंट लागू होते हैं ।
- दंत सीमेंट पूरी तरह से सूख गया है जब तक रुको (~ 12-20 मिनट) । stereotaxic एडेप्टर इलेक्ट्रोड दबाना से निकालें । टोपी अखरोट निकालें और एक डमी जांच के साथ stereotaxic अनुकूलक की जगह और टोपी अखरोट जकड़ना ।
- stereotaxic तंत्र से माउस को रिलीज करने और एक व्यक्ति के पिंजरे में अकेले चूहा घर ।
नोट: माउस को उपेक्षित छोड़ दिया नहीं जाना चाहिए जब तक यह पर्याप्त चेतना को फिर से प्राप्त किया है स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए । microdialysis के दिन तक प्रतिदिन माउस की जांच करें । चूहे अगर दर्द में दिखे तो carprofen जैसे एनएसएआईडी प्राप्त करता है । 2 सप्ताह प्रतीक्षा नींद-जागो अध्ययन के लिए आवश्यक है तो माउस habituates नए पर्यावरण के लिए10, लेकिन अध्ययन के अंय प्रकार के छोटे वसूली अवधि (जैसे, 1-2 दिन) की आवश्यकता हो सकती है ।
3. Microdialysis सेटअप
- गुणवत्ता जांच की जांच: आसुत waterand के साथ एक डिस्पोजेबल 1ml सिरिंज भरें यह आउटलेट (एक byton ट्यूब का उपयोग कर एक जांच के छोटे बंदरगाह) के लिए कनेक्ट । उंगलियों के साथ वेंट छेद कवर और दबाना सिरिंज गोताख़ोर धीरे जांच करने के लिए पानी को भ्रमित करने के लिए । जांच करें कि पानी जांच प्रवेश से प्रतीत होता है और वहां एक microdialysis झिल्ली की सतह पर कोई रिसाव है ।
- जांच के सक्रियकरण: इथेनॉल में एक जांच की झिल्ली जलमग्न (दो सेकंड के लिए 70-100%) । फिर, जांच में आसुत पानी फिर से एक सिरिंज के साथ फिर से ।
- छिड़काव बफर की तैयारी: आदेश में टयूबिंग करने के लिए लक्ष्य अणुओं के आसंजन से बचने के लिए, कमजोर 30% BSA समाधान द्वारा BSA जोड़ने के लिए 4% के साथ कृत्रिम सीएसएफ (१.३ मिमी CaCl2, १.२ मिमी MgSO4, 3 मिमी KCl, ०.४ मिमी KH2पीओ4, 25 मिमी NaHCO3 , १२२ मिमी NaCl, पीएच = 7.35), जो बारीकी से सीएसएफ में इलेक्ट्रोलाइट एकाग्रता मैच, तुरंत उपयोग करने से पहले. ०.१ µm ताकना आकार के साथ एक सिरिंज फिल्टर इकाई के माध्यम से छिड़काव बफर फ़िल्टर ।
नोट: 4% BSA प्रोटीन चिपके के लिए वसूली में सुधार करता है, लेकिन गंभीर रूप से यौगिकों कि उच्च BSA-बाध्यकारी है यौगिकों के वितरण की सीमा कर सकते हैं । यह BSA के कम एकाग्रता का उपयोग करने का एक लाभ है (जैसे ०.१५%) कुछ उदाहरणों में3। ध्यान दें कि BSA समग्र बहुत आसानी से जब भंवर या थाली हलचल द्वारा उत्तेजित कर सकते हैं । इन समुच्चय जांच या झिल्ली pores रोकना कर सकते हैं । इस एग्रीगेट को सीमित करने के लिए BSA समाधान तैयार करते समय सावधानी बरतें - प्रवेश और आउटलेट के लिए दो अलग लाइनों तैयार ( चित्रा 1Cदेखें) और एक कनेक्शन सुई के साथ दोनों लाइनों से कनेक्ट । एक डिस्पोजेबल 3 मिलीलीटर छिड़काव बफर से भरा सिरिंज भरें और यह एक कुंद अंत सुई का उपयोग कर टयूबिंग के प्रवेश अंत के साथ कनेक्ट । सिरिंज पंप चलाकर छिड़काव बफर के साथ पूरे टयूबिंग भरें ।
- सिरिंज पंप बंद करो और प्रवेश लाइन और एक कदम ३.३ से सक्रिय microdialysis जांच के साथ आउटलेट लाइन के बीच कनेक्शन सुई की जगह ( चित्रा 1Cदेखें) । इस प्रतिस्थापन से पहले, जांच पर टोपी अखरोट डाल दिया ।
- रोलर पंप पर आउटलेट टयूबिंग में रोलर ट्यूब माउंट । 10 µ l/मिनट पर सिरिंज पंप शुरू और फिर थोड़ा धीमी प्रवाह दर पर रोलर पंप (9.5-9.8 µ l/ पूरे टयूबिंग, जो वसूली प्रभावित जब वे जांच में प्रवेश कर सकते है में सभी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें ।
- चरण १.२ में के रूप में उसी तरह से १.१२ से माउस Anesthetize । इसके गर्दन के आसपास माउस कॉलर रखो । कैप नट और डमी जांच निकालें और धीरे गाइड प्रवेशनी के माध्यम से ३.४ से एक microdialysis जांच डालने और टोपी अखरोट जकड़ना ।
- एक मुक्त चलती प्रणाली और तार कॉलर के साथ माउस से जुड़े पिंजरे में माउस प्लेस । दोनों सिरिंज पंप और रोलर पंप के लिए कदम ३.५ में संकेत दिया प्रवाह दर पर चल रहा रखने के ंयूनतम 1 ज ।
नोट: जाग जानवरों से ISF संग्रह को प्राप्त करने के लिए, इस अनुच्छेद एक मुक्त चलती प्रणाली का उपयोग करता है, जहां पिंजरे में ही एक जानवर आंदोलन को घुमा से टयूबिंग रखने के लिए जवाब । वैकल्पिक रूप से, तरल विभिन्न कंपनियों से उपलब्ध कुंडा भी इस्तेमाल किया जा सकता है । - पहले रोलर पंप बंद करो और फिर सिरिंज पंप । इच्छित प्रवाह दर सेट करें । सिरिंज पंप रोलर पंप से 20% तेजी से चलाते हैं ।
नोट: उदाहरण के लिए, यदि आप 1 µ l/मिनट पर चलाने के लिए, १.२ µ l/इष्टतम प्रवाह दर पर सिरिंज पंप संचालित प्रत्येक अणु के लिए empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । - ISF नमूनों का संग्रह: प्रशीतित अंश कलेक्टर पर आउटलेट टयूबिंग के मुक्त अंत प्लेस ।
नोट: उपयुक्त नमूना मात्रा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया परख के आधार पर बदलता है । - प्रयोग पूरा होने के बाद ही जांच को निकालें । (माउस को आवश्यकतानुसार Anesthetize.) माउस पुनर्प्राप्ति हैंडल उसी तरह चरण २.११ में के रूप में । HPLC या एलिसा जैसे तरीकों से एकत्र ISF का विश्लेषण करें ।
- microdialysis के बाद पूरे टयूबिंग धोने के लिए, प्रवेश और आउटलेट टयूबिंग फिर से कनेक्शन सुई के साथ जांच की जगह और पूरे ट्यूबिंग में पतला ब्लीच चलाने और फिर इसे पानी से फ्लश से कनेक्ट । सूखी और दोहराया उपयोग के लिए यह दुकान ।
नोट: टयूबिंग के अंय प्रकार के स्वीकार्य हैं, तथापि, छिड़काव बफर में BSA छोटे व्यास के साथ टयूबिंग रोकना कर सकते हैं, इस प्रकार इन टयूबिंग एकल उपयोग के रूप में माना जाता है । टयूबिंग नीचे पहना जा सकता है या एकाधिक का उपयोग करता है के बाद भरा है, तो सुनिश्चित करें कि प्रवाह की दर का उपयोग करने से पहले हर समय संगत है ।
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Representative Results
उत्तेजित या रिवर्स microdialysis11,12,13, picrotoxin, गाबाएक रिसेप्टर प्रतिपक्षी या tetrodotoxin, एनए+ चैनल ब्लॉकर इस्तेमाल किया गया है में न्यूरॉन गतिविधि को बाधित. यह दिखाया गया है कि ताऊ रिलीज न्यूरॉन गतिविधि13,14की वृद्धि से प्रेरित है । इन पिछले टिप्पणियों के साथ संगत, जब ५० µ एम picrotoxin (PTX) रिवर्स microdialysis के माध्यम से प्रशासित किया गया था (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें) में जाग C57B6/जे चूहों में वृद्धि हुई ISF अंतर्जात ताऊ स्तर की तुलना में एलिसा द्वारा मापा वाहन नियंत्रण (DMSO) ( चित्रा 2) ।
चित्रा 1: सर्जरी सेटअप और microdialysis सर्किट के निर्माण । (क) एक टोपी अखरोट, एक stereotaxic अनुकूलक और एक गाइड प्रवेशनी का उपयोग कर एक गाइड आरोपण के लिए एक stereotaxic विधानसभा की स्थापना की । (ख) एक गाइड प्रवेशनी प्रत्यारोपण करने के लिए Stereotaxic सर्जरी । गाइड प्रवेशनी कार्यक्षेत्र के संबंध में 12 डिग्री पर मस्तिष्क में डाला जाता है । (ग) एक प्रवेश टयूबिंग और एक दुकान टयूबिंग के निर्माण । प्रवेश लाइन ७० सेमी FEP टयूबिंग (JF-७०) और आउटलेट लाइन के होते है JF-७० और रोलर ट्यूब और FEP टयूबिंग के 1/2 के होते हैं । कनेक्शन सुई प्रत्येक कनेक्शन के लिए उपयोग किया जाता है । (घ) एक बार पूरे टयूबिंग छिड़काव बफर से भर जाता है, पंप बंद करो और प्रवेश लाइन और एक सक्रिय microdialysis जांच के साथ आउटलेट लाइन के बीच कनेक्शन सुई की जगह । करने के लिए प्रवेश टयूबिंग के अंत में एक जांच (अब बंदरगाह) के प्रवेश बंदरगाह से कनेक्ट सुनिश्चित करें और एक जांच (छोटे बंदरगाह) के आउटलेट बंदरगाह के साथ आउटलेट ट्यूबिंग के अंत से कनेक्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: picrotoxin रिवर्स microdialysis पर ISF ताऊ परिवर्तन दिखा प्रतिनिधि डेटा. Picrotoxin (PTX, ५० µ मीटर) या DMSO रिवर्स हिप्पोकैम्पस के माध्यम से C57B6/जे चूहों के microdialysis में दिया गया । Picrotoxin तेजी से अपने बेसल स्तर (यानी, PTX प्रशासन से पहले 3 एच के दौरान औसत ताऊ सांद्रता) DMSO उपचार की तुलना में ISF अंतर्जात ताऊ के स्तर में वृद्धि हुई है । डेटा के रूप में मतलब ± SEM दिखाया गया है, n = 3 DMSO के लिए, n = 4 PTX के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
उच्च आणविक वजन कट बंद झिल्ली के साथ Microdialysis एक पुश-पुल मोड द्वारा संचालित किया जाना है, इस प्रकार यह महत्वपूर्ण है कि प्रवाह की दर सही है और लगातार है । प्रवाह दरों में अशुद्धि हवा बुलबुला पीढ़ी और नमूना एकाग्रता में विसंगति का कारण हो सकता है । यदि प्रवाह असंगत है, तो रिसाव के लिए सभी कनेक्शंस की जांच करें । यदि समस्या अभी भी बनी रहती है, यह नई जांच और टयूबिंग के साथ फिर से शुरू करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
Microdilaysis जांच छिड़काव बफर द्वारा लगातार perfused हैं । इसलिए, वहां extracellular अणुओं छिड़काव बफर में एक पूर्ण संतुलन तक पहुंचने के लिए पर्याप्त समय नहीं है । एक परिणाम के रूप में, अपोहित में एकाग्रता ISF में अपनी वास्तविक एकाग्रता की तुलना में बहुत कम है । आदेश में ISF में अणुओं की सही एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए, एक शूंय प्रवाह विधि अक्सर3,5,15का प्रयोग किया जाता है । इस विधि के प्रवाह की दर में फेरबदल करके एकाग्रता उपाय । एकाग्रता और प्रवाह की दर के बीच एक व्युत्क्रम संबंध है । इसलिए, लक्ष्य अणुओं की एकाग्रता extrapolating घातीय वक्र वापस सैद्धांतिक शूंय प्रवाह है, जो अणुओं की सही वसूली का प्रतिनिधित्व करता है द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । हालांकि, इस वसूली झिल्ली या अणुओं या अंय प्रोटीन के साथ बातचीत की hydrophobicity के साथ बातचीत के रूप में विभिंन कारकों से प्रभावित किया जा सकता है, और एक मन में रखना चाहिए कि सैद्धांतिक शूंय पर एकाग्रता जरूरी नहीं हो सकता है ISF में अपनी असली एकाग्रता के बराबर ।
एक जांच प्रविष्टि मस्तिष्क में तीव्र स्थानीय चोट का कारण बनता है । इस कारण से, पहले कई भागों आम तौर पर आगे विश्लेषण से बाहर रखा जाता है । वास्तव में, हिप्पोकैम्पस में ISF ताऊ प्रोटीन के स्तर की संभावना पहले 9-15 घंटे में स्थिर नहीं हैं, क्योंकि तीव्र चोट ISF (लेखक के अप्रकाशित अवलोकन) में ताऊ के गैर विशिष्ट रिहाई का कारण बनता है । जांच के बाद वसूली प्रविष्टि चोट लक्ष्य से लक्ष्य को बदलता है । प्रायोगिक अध्ययन जब प्रत्येक लक्ष्य एक स्थिर राज्य स्तर तक पहुंचने के लिए निर्धारित जब नमूनों का विश्लेषण किया जाना चाहिए निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । यह microdialysis नमूना के लिए "प्रारंभ बिंदु" निर्धारित करता है । नमूना के लिए एक समापन बिंदु है जब लक्ष्य अब स्थिर स्थिति में है (आमतौर पर 3-5 दिन के बाद microdialysis जांच आरोपण; नहीं गाइड आरोपण) । प्रत्येक लक्ष्य के लिए प्रारंभ और अंत प्रत्येक लक्षित के लिए प्रत्येक प्रयोगशाला द्वारा empirically निर्धारित किया जाना चाहिए ।
Microdialysis विशेष रूप से उपयोगी है जब दवा उपचार के साथ संयुक्त । दवाओं प्रणालीबद्ध या सीधे ISF में संचार प्रशासित किया जा सकता है । रिवर्स microdialysis एक तरीका है कि सीधे जांच के माध्यम से छोटे यौगिकों संचार है । डायलिसिस द्वि-दिशाहीन होता है. इसलिए, छिड़काव बफर में दवाओं का समावेश इसके प्रसार हालांकि आसपास के ऊतकों को microdialysis जांच की अनुमति देता है । इस विधि छोटे यौगिक और ISF के एक साथ संग्रह के स्थानीय प्रशासन सक्षम है । रिवर्स microdialysis प्रवेशनी के माध्यम से एक दबाव इंजेक्शन की तुलना में कम इनवेसिव है और लक्ष्य क्षेत्र में दवाओं की अधिक निरंतर एकाग्रता बनाए रख सकते हैं ।
रिवर्स microdialysis शुरू करने से पहले, पूरे टयूबिंग के आंतरिक मात्रा में उपचार और नमूना संग्रह के समय की गणना करने के लिए खाते में लिया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, पूरे इस लेख में इस्तेमाल टयूबिंग की आंतरिक मात्रा ९१.५ µ एल (प्रत्येक टयूबिंग की आंतरिक मात्रा के लिए सामग्री की तालिका को देखें) है । इसलिए, जब प्रवाह दर है १.० µ l/मिनट, यह छिड़काव बफ़र के लिए ९१.५ मिनट लेता है अंश संग्राहक तक पहुंचने के लिए दवाओं युक्त । दूसरी ओर, जब दवाओं प्रणालीबद्ध वितरित कर रहे हैं, आउटलेट ट्यूबिंग के भीतर की मात्रा (इस मामले में ५६.५ µ एल) पर विचार किया जाना चाहिए ।
vivo microdialysis में विधि अन्य तकनीकों पर कई लाभ प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, जबकि मस्तिष्क homogenates की संभावना दोनों extracellular और intracellular प्रोटीन से मिलकर बनता है, microdialysis विशेष रूप से extracellular से ISF प्रोटीन इकट्ठा । दूसरा, एक एकल microdialysis जांच एक ही जानवर से अलग समय बिंदुओं पर ISF जमा कर सकते हैं । प्रत्येक नमूने में लक्ष्य एकाग्रता एक% आधार रेखा के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है । यह तो सापेक्ष मतभेद की तुलना में किया जा सकता है जानवरों के बीच निरपेक्ष एकाग्रता को सामान्य । यह एक अध्ययन की शक्ति बढ़ जाती है और आम तौर पर एक प्रयोग के लिए आवश्यक जानवर संख्या कम कर देता है जब प्रोटीन के स्तर में सापेक्ष अंतर की तुलना दवा प्रशासन/ दूसरी ओर, microdialysis के प्रमुख सीमा लक्ष्य अणु के आकार के प्रतिबंध है ।
Microdialysis vivo तकनीक में अंय के साथ संयुक्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विनियमित ट्रांसजेनिक चूहों में प्रदर्शन microdialysis लक्ष्य प्रोटीन16के वीवो कारोबार में अनुमान कर सकते हैं । ईईजी के साथ संयोजन, माप रिवर्स microdialysis11के दौरान बिजली की गतिविधियों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । और optogenetics मस्तिष्क में न्यूरॉन गतिविधि के हेरफेर सक्षम है, जबकि एक साथ17ISF इकट्ठा ।
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Disclosures
लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था ' ' अनुदान में अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (मस्तिष्क प्रोटीन एजिंग और मनोभ्रंश नियंत्रण) (15H01552) से MEXT और अनुदान में सहायता के लिए युवा वैज्ञानिकों (ख) (16K20969). लेखक धंयवाद डॉ डेविड एम Holtzman और डॉ जॉन आर Cirrito इस पद्धति के विकास के दौरान तकनीकी सलाह के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
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- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
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- Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
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- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
