Summary
細胞内 ROS は、細胞老化の誘導に重要な役割を果たすに示されています。ここでは、細胞の老化にともなう ROS レベルを定量化するための敏感な試金について述べる。伝えられる様々 な加齢に伴う機能不全に貢献する老化関連分泌形質を評価するためのプロトコルをいたします。
Abstract
細胞の老化は、増殖能力や様々 なストレスへの暴露の枯渇に不可逆的な増殖停止の状態を考えられています。最近の研究では、開発、創傷治癒、免疫監視、加齢に伴う組織の機能不全など、様々 な生理的過程に細胞の老化の役割を拡張しています。細胞周期の停止は、細胞の老化の重要な特徴は、増加の細胞内活性酸素種 (ROS) 生産は、細胞老化の誘導に重要な役割を果たすことも実証されています。さらに、最近の研究では、老化細胞が隣接細胞と老化関連の分泌形質 (SASP) を通じて組織に強力な傍分泌活動を示すこと明らかにしました。細胞の老化に対する治療戦略に関する関心の急激な増加は、細胞内 ROS および、SASP など老化メカニズムの正確な理解の必要性を強調しています。ここでは、活性酸素感受性蛍光色素とフローサイトメトリーを使用して H Ras 誘導性細胞老化にともなう細胞内 ROS レベルを定量的に評価するためのプロトコルについて述べる。さらに、mRNA の発現の誘導と SASP 因子の分泌の解析のための高感度技術を紹介します。これらのプロトコルは、さまざまな細胞の老化モデルに適用できます。
Introduction
50 年以上も前、ヘイフリック、ムーアヘッドは、正常な細胞が細胞分裂1数後の増殖能の枯渇に不可逆的な増殖停止を入力することを明らかにしました。この現象は、複製老化として今知られているし、個体老化2と強く相関すると考えられています。DNA の損傷、発癌活性化、酸化ストレスなど、さまざまな細胞のストレスを別の種類の細胞の老化を誘導するために報告されているテロメアの進歩的な侵食は複製老化の主な原因と考えられるが、「老化」や「ストレス老化」と呼ばれます。興味深いことに、時期尚早の老化は、H-ras など BRAF 遺伝子の活性化に強力な腫瘍抑制の役割を果たしています。マウス モデルと人間の組織の研究は細胞老化バイオ マーカーは前癌病変、発癌の Ras および BRAF がアクティブになりますがから開発された悪性の癌では減少した主に存在した強力な証拠を作り出した。これら病変3,4,の5。その高齢化と腫瘍抑制における役割を超えて細胞の老化は、創傷治癒、組織修復、免疫監視および萌芽期の開発6などを含む様々 な生理的プロセスで役割を果たす以前の研究で示されています。
増殖停止は、細胞の老化が7の特徴として広く研究されているが証拠の重要なボディは、その細胞内の活性酸素種 (ROS) は、細胞の老化の8にも貢献して示唆しています。ROS レベルの標高複製老化遺伝子が誘導する老化 (OIS) など、細胞の老化の様々 なタイプの中にもともと数十年前は報告された9,10。もっと直接、H2O2の致死線量と外因性治療は老化11,12誘導します。SOD1 などの活性酸素消去酵素の阻害は早期老化13も発生します。対照的に、周囲の酸素条件を低いし、ROS 清掃遅延老化10,14,15の発症の増加します。これらの結果は間違いなく ROS が重要なメディエーターまたは細胞の老化誘導の決定要因であることを示します。ただし、ROS は細胞の老化や細胞の老化中 ROS レベルを昇格する方法の誘導に貢献方法必要さらに調査。
最近の研究では、老化細胞が隣接細胞や SASP16,17を通じて組織の強力なパラクリン活動あるが明らかにしました。高齢者組織老化細胞組織の加齢に伴う機能障害を介して増殖細胞の自律的枯渇に加えて多くの経路 SASP を通じて推進します。様々 な炎症性要因、組織アーキテクチャの破壊組織恒常性が損なわれ、組織の加齢に伴う機能障害を引き起こす IL-8、TGFβ、およびマトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp)、老化の細胞によって分泌されるが IL-6 など隣接するセル、および無菌性炎症18,19の老化。しかし、SASPs は、生物学的文脈によって有益な効果を持つことができます。さらに、SASPs の担体の性質は、老化細胞型と19のさらなる研究の必要性を強調し、細胞の段階に依存します。
ここでは、OIS の中に細胞内 ROS レベルを評価するため迅速・高感度のフローサイトメトリーを用いた手法について述べる。さらに、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) や ELISA を用いた SASP 因子の分析方法を紹介しています。
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Protocol
1. 癌遺伝子が誘導する老化を誘導します。
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H の準備-RasV12 レトロ ウイルス
- 0.001% ポリ-L-リジン/リン酸 2 mL を追加することにより 100 mm ディッシュのコートは、室温で 5 分の生理食塩水 (PBS) をバッファーしました。
- 真空に接続されているガラス ピペットを使用してポリ L リジン ソリューションを削除し、2 mL の 1x PBS を追加することによって培養皿を洗ってください。
- プレート 3 x 106マウス白血病ウイルスエンベ ボスク 23 包装細胞被覆文化皿でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むと CO2組織培養で 37 ° C でそれらを文化1 d のためのインキュベーター。
- 次の日、transfect レトロ包装 DNA (pGAG/ポルの 2 μ g と pVSVG の 0.25 μ g) と共に pBabe puro H RasV12 DNA の 2 μ g 製造元の指示に従って 8 h のトランスフェクション試薬を使ってします。
- トランスフェクション メディアを取り出し、新鮮なメディア 8 mL を加えます。
- 48 時間後ウイルス粒子を含むメディアを収集し、5 分間 500 × gで遠心分離によって細胞残骸を削除します。
- 0.45 μ m のシリンジ フィルター フィルター H-ras ウイルスを含んでいるメディア。
注: 任意の凍結と効率的なウイルス感染のウイルス上清の融解を避けるため。最高の効率を得るためには、感染症と同じ日に採取したウイルスを使用します。
-
WI 38 H RasV12 レトロ ウイルスの培養細胞への感染
- H RasV12 レトロ ウイルスを収穫する前に 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン 1 d を含む DMEM に 60 mm ディッシュに 5 × 104 WI 38 細胞をプレートし、37 ° C で 1 日それらを文化
- 次の日の成長培地を取り外し、H RasV12 レトロ ウイルスのメディアの 1 つの mL を追加します。Polybrene 原液 (蒸留水で 8 mg/mL) の 2 μ L を含んでいる成長媒体の追加 1 mL を追加します。サンプル 1 日加湿 37 ° C、5% CO2培養孵卵器で孵化させなさい。
- H RasV12 レトロ ウイルス混合後 24 h を取り外して洗浄セル 2 x 1x PBS で。成長培地を追加し、加湿 37 ° C、5% CO2培養インキュベーター 2 日間ピューロマイシン 2 μ g/mL で細胞を治療します。
- ピューロマイシンを選択の 2 d の後成長培地を取り除き、洗浄セル 2 x 1x PBS で。成長培地を加えて加湿 37 ° C、5% CO2インキュベーターまで指定された時間 (模式図、図 1 aを参照) の細胞の培養します。
2. 老化による老化関連 β ガラクトシダーゼの汚損の監視
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次の貯蔵液を準備します。
- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-ガラクトピラノシド (x-gal) ジメチルホルムアミド (DMF) に 20 mg/mL を準備します。-20 ° C でソリューションを格納します。
- (126 mM) の Na2HPO4.7H2O 3.377 g 溶解クエン酸/ナトリウム リン酸バッファーを準備および蒸留水 100 mL にクエン酸 (36.8 mM) の 0.708 g。必要な場合は、6.0、pH を調整します。
- フェロシアン化カリウム 0.5 M を準備します。4 ° C で暗闇の中でソリューションを格納します。
- フェリシアン化カリウム 0.5 M を準備します。4 ° C で暗闇の中でソリューションを格納します。
注: 老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β gal) の染色液の pH は、正確な結果を得るのため重要です。
- 150 mM の NaCl、2 mM MgCl2、5 mM フェロシアン化カリウム、フェリシアン化カリウム 5 mM、20% (v/v) クエン酸/ナトリウム リン酸バッファー、および X gal の 1 mg/mL を含む原液を希釈することによって新鮮な SA β gal 染色液を作る。
- 文化メディアを取り出し、洗浄セル 1 1x PBS で x。室温で 5 分間 3% ホルムアルデヒドとセルを修正します。
注: は、レトロ ウイルスに感染していない細胞は、陰性対照として使用ください。感染制御の細胞はその増殖状態を維持するために継代するしてください。 - セルから固定の解決を削除し、1 × PBS で洗浄します。作りたての 1 x SA β gal 染色液 (60 mm ディッシュに 1.5 mL) を追加します。乾燥を防ぎ、37 ° C で 24 時間インキュベート パラフィン フィルムが付いている皿をシールします。また、湿度チャンバー内で一緒に料理を孵化させなさい。
注: 3% のホルムアルデヒドを含む固定液は有害廃棄物として破棄する必要があります。CO2インキュベーターが望ましい、培養中に pH の変化を防ぐために。 - 次の日に顕微鏡下で細胞の染色の状態を確認します。SA β gal 陽性細胞は核領域で青く表示されます。
注: コントロール細胞増殖は、SA β gal 陽性細胞の低周波を表示します。染色が軽すぎる、少し長い期間潜伏を続行 (代表的な例は図 1 bを参照)。 - 10 X または大きい対物レンズを使用して CCD カメラで SA β gal の染色像を取得します。染色のパーセンテージを計算するための十分な枚数をキャプチャ (> 200 セル)。
- セルの合計数に対する SA β gal 陽性細胞数を定量化することで SA β gal 染色性細胞の割合を計算します。
注: SA β gal 染色繰り返す必要がありますいない独立して少なくとも 3 倍、そして平均値必要がありますに基づいて計算されます複製実験 (図 1 C)。適切な細胞密度は、SA β gal の染色実験のため重要です。高密度は、老化関連の形態への変更と干渉でき、コントロール細胞における偽陽性信号を誘発します。
3. H Ras 誘導する老化の中に活性酸素種誘導の定量化
- プレート 2 x 105 WI-38 セル 60 mm 文化料理し、手順 1 で説明した H Ras 誘導する老化を引き起こします。
注: このプロトコルは、他の種類の細胞の老化モデルに適用できます。 - 示された時点 (2、4、または 6 日) で成長培地を外し、1 × PBS のセルを洗浄します。0.05%/トリプシン EDTA 溶液 1 mL とそれらを扱うことによって細胞を分離し、10% を含んでいる成長媒体の 1 つの mL を追加することによって、トリプシンを不活化政府短期証券。細胞数を決定します。
- 15 mL の円錐管に 1 x 10 の5セルを転送し、5 分間 500 × gで遠心分離によって細胞を収集します。
- 新鮮な 2', 7'-dichlorofluorescin (DCF DA の使用濃度は 50 μ M) 培養培地 10 mL に 10 mM DCF DA の 50 μ L を追加することによって染色メディアをジアセテート (DCF DA) を準備します。
注: DCF DA は光に敏感です。光照射は避けるべきであります。DCF DA と染色時間の濃度は、細胞の種類に応じて調整できます。 - 15 mL コニカル チューブから成長培地を慎重に削除し、作りたての DCF DA 染色中の 1 mL を追加します。慎重に細胞ペレットを再懸濁します、暗闇の中で 30 分の 37 ° C でそれを孵化させなさい。ネガティブ染色コントロールとして非染色サンプルが含まれます。
注: DCF DA と汚れていない細胞の増殖は、ネガティブ コントロールとして準備されるべき。 - 5 分 500 × gで遠心分離によって細胞を収集し、それらを洗浄 2 mL の 1x PBS で 1 x。1 mL の 1x PBS で細胞を再懸濁し、サンプルを適切な蛍光活性化セル (FACS) チューブを並べ替えに転送します。
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2 ', 7 ' Dichlorodihydrofluorescein ジアセテート (DCF DA) 蛍光信号の流れの cytometer 適切な光源を装備を使用して測定します。青色レーザーとサンプルをエキサイト (488 nm) と対数スケールを使用して 530 ± 30 nm 検出器 (FITC) 放出される蛍光を検出します。
- まず非染色陰性対照セルを分析します。前方散乱 (FSC)対側方散乱 (SSC) のドット プロットでゲーティング ツールを使用してライブのセルを選択し、死んだ細胞と細胞残屑を除去します。
注: セルのサイズ変更は、注意深く FSC対SSC のドット プロットで監視する必要があります。老化細胞のサイズが大幅に増加された場合、FSC対SSC のドット プロットのゲーティング後同じサイズのセル人口の DCF DA 強度を比較する必要があります。 - DCF ダを表示する単一パラメーターのヒストグラム (488 nm) xの対数目盛に蛍光-軸とyの線形スケールのイベント (セル数) 数-軸、488 nm レーザーからピークを配置する電圧を調整します。左端に非染め色細胞。
- DCF-DA ステンド サンプル、サンプルごとに少なくとも 10,000 イベントの記録を分析します。流れの cytometer に固有解析ソフトウェアを使用して各サンプルの平均蛍光値を取得します。
注: ROS 測定繰り返す必要がありますいない独立して少なくとも 3 倍、そして平均値は、これらの結果から計算するように。代表 H Ras 誘導する老化の結果は図 2のとおりです。
- まず非染色陰性対照セルを分析します。前方散乱 (FSC)対側方散乱 (SSC) のドット プロットでゲーティング ツールを使用してライブのセルを選択し、死んだ細胞と細胞残屑を除去します。
4. 定量 il-6, il-8 mRNA 老化関連分泌表現型解析を使用してリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応の式
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総 RNA の準備
- 100 mm 文化プレート 3 × 105 WI-38 細胞は、10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む DMEM で皿し、組織文化のインキュベーターで 37 ° C で 1 日それらを文化します。各時点の重複する文化を準備します。
- 手順 1 で説明した H RasV12 レトロ ウイルスによる細胞を感染させることによって、老化を誘発します。
- 2 セルを洗浄して、収穫前に 1 日で、1 × pbs x FBS なし DMEM の 3 mL を加えると。
注: この手順は、ELISA の手順 5 で説明したように使用される馴化培地を生成する行われます。血清飢餓は、いくつかの敏感な細胞における IL 6 と IL-8 の Mrna の発現を引き起こす可能性があります。したがって、il-6 および il-8 mRNA 式と血清飢餓培養した細胞では当初比較する必要があります。血清飢餓が IL 6 や il-8 mRNA の発現の重要な変化を引き起こす場合 qPCR の総 RNA と ELISA の馴化培地別途用意する必要があります。 - 後で各サンプル 24 h から馴化培地を収集して、ELISA の-80 ° C で媒体を保存します。
- 0.05%/トリプシン EDTA 溶液 1 mL とそれらを扱うことによって細胞を分離し、10% を含んでいる成長媒体の 1 つの mL を追加することによって、トリプシンを不活化政府短期証券。手順 5 で説明したように ELISA 結果の正規化の細胞数を決定します。5 分 500 × gで遠心分離によって 1.5 mL 遠心チューブに細胞を収穫します。
- 穏やかな吸引によってメディアを削除し、RNA 抽出溶液の 1 mL を追加します。渦 15 精力的に遠心チューブ、s。その後、クロロホルムと精力的に渦追加 15 を再度混合物の 200 μ L を追加 s。
- 4 ° C で 10 分間 17,000 x gでサンプル チューブを遠心分離します。その後、新しい 1.5 mL 遠心チューブに慎重に上部の段階を転送します。
注: 中間期およびより低い有機相邪魔されることを新しいチューブ上部の段階の転送中に。 - RNA を沈殿させ、穏やかな反転してもそれらを混合しイソプロパノールの 400 μ L を追加します。その後、10 分間室温でチューブを孵化させなさい。
- 4 ° C で 10 分間 17,000 x gでチューブを遠心分離します。その後、RNA の餌を保持する世話、上澄みを廃棄します。75% エタノール 1 mL を追加することによって、RNA を洗浄し、2-3 x チューブを反転します。4 ° C で 17,000 × gで 5 分間チューブを遠心し、上澄みを廃棄します。
- 室温で RNA のペレットを乾燥し、ピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) の 50 μ L の RNA を分解-蒸留水を扱われます。1 μ L の RNA 溶液を用いた分光光度計と RNA 濃度を定量化します。
注: オーバードライ; RNA の溶解度が低下します。したがって、RNA のオーバードライを避けます。
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cDNA の調製
- 薄肉 PCR チューブに次を追加して各サンプルの逆転写反応混合物の準備: 総 RNA の 2 μ g (RNase フリー水 10 μ L にボリュームを調整)、RT バッファー、1 μ L の任意プライマー (50 pmol) 0.8 μ 25 x dNTP ミックス (100 x 10 の 2 μ L mM)、MMLV 逆転写酵素 (50 U/μ L) の 1 μ L と RNase フリー 5.2 μ L の水します。
- 以下の条件でサーマルサイクラーの逆転写反応プログラムを設定: 42 ° C 60 分、95 ° C、5 分位 PCR チューブ熱 cycler でプログラムを起動します。
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リアルタイムのポリメラーゼ チェーン反応
- すべての反応をリアルタイム PCR マスター ミックスを準備します。各サンプルの反応混合物は、次のように: リアルタイム PCR マスター ミックス、IL-6 または IL-8、前方および逆のプライマーの 1 μ および超純粋な蒸留水 (DNase、RNase-フリー) 21 μ × 2 を 25 μ l 添加します。表 1を参照してください。
注: 内部統制としてアクチン RNA プライマーを含んでいる各サンプルのリアルタイム PCR の反応混合物を準備します。GAPDH は、正規化の内部コントロールとしても使用できます。 - 96 ウェル光 qPCR プレートの各ウェルにマスター ミックスの 48 μ L と 2 μ L の水で 3 倍希釈 cDNA 製品を追加します。3 通の各反応を実行します。PCR コントロールとして cDNA テンプレートが含まれていないコントロールも準備します。
- 以下の条件でサーマルサイクラーにリアルタイム PCR 反応プログラムを設定: 95 ° C、95 ° c (変性)、40 回 of15 秒、60 の ° C (アニーリングをおよび拡張) で 1 分で 10 分。
- リアルタイム PCR を行い、PCR のサイクルの完了後しきい値サイクル (CT) を記録します。IL-6 または IL-8 2- ΔΔCΤ法20を使用してのための mRNA のレベルを計算します。
注: 式で相対的なフォールドの変更は、次の数式を使用してによって決まりますアクチン レベルを正規化した後。
変更を隠す = 2-Δ (ΔCT)
ここは
ΔCT = CT IL-6 または IL-8-CT、アクチン;そして
Δ (ΔCT) = ΔCT、刺激ΔCT、コントロール。 - 重複する各サンプルの平均値を計算します。
注: qPCR 繰り返す必要がありますいない独立して少なくとも 3 倍、そして平均値必要がありますに基づいて計算されますこれらの結果。代表 H Ras 誘導する老化の結果は、図 3のとおりです。血清飢餓は、いくつかの重要な細胞の IL-6 と IL-8 の Mrna の発現を引き起こす可能性があります。したがって、il-6 および il-8 mRNA 式と血清飢餓培養した細胞では当初比較する必要があります。血清飢餓が IL 6 や il-8 mRNA の発現の重要な変化を引き起こす場合 qPCR の総 RNA と ELISA の馴化培地別途用意する必要があります。
- すべての反応をリアルタイム PCR マスター ミックスを準備します。各サンプルの反応混合物は、次のように: リアルタイム PCR マスター ミックス、IL-6 または IL-8、前方および逆のプライマーの 1 μ および超純粋な蒸留水 (DNase、RNase-フリー) 21 μ × 2 を 25 μ l 添加します。表 1を参照してください。
5. ELISA を用いた老化関連分泌表現型解析から分泌される IL 6 と IL-8 タンパク質のレベルを定量化
- 雪解けの馴化培地 3 mL は、手順 4 で説明した老化の WI-38 細胞から収穫されます。5 分 500 × gで遠心分離によって細胞の残骸を削除します。
- 馴化培地を 10 倍集中遠心ろ過ユニットを使用して 20 分間 3,000 × gで遠心分離によって。
注: 馴化培地の濃度が必ずしも型に依存、サンプル。 -
適切な IL-6 と IL-8 ELISA キットと馴化培地の各濃度サンプルの 50 μ L を用いた elisa 法を実行します。
注: は、2 つの ELISA 井戸で各サンプルをテストします。手順 4 では、時間の各ポイントが重複しているので、この分析を ELISA の試金およびサンプル調製技術の変化を監視することが出来ます。- ELISA プレート コーティング、IL-8 の IL-6 または 0.125 μ G/ml の IL-6 または IL-8 抗体濃度 0.5 μ g/mL の 1x PBS を薄くしなさい。Elisa 用プレートの各ウェルに 100 μ L の希釈した抗体を追加します。フィルム シール elisa 用プレートとプレートを密封し、室温で一晩振盪せず孵化させなさい。
- 吸引により抗体溶液を削除します。洗浄バッファー x 1 の 300 μ L でも 4 x を洗う (0.05 %pbs でトゥイーン 20)。各ウェルにブロック バッファー (PBS で 1 %bsa) の 300 μ L を追加します。1 時間室温で孵化させなさい。
- 吸引によりブロック ソリューションを削除します。洗浄バッファー x 1 の 300 μ L でも 4 x を洗います。標準的な曲線を生成する希釈した ELISA 希釈バッファー (PBS で 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa) の基準を準備します。
注: IL - 6 シリアル希釈は 31.25、62.5、125、250、500、1,000、2,000 pg/mL。IL-8 のシリアル希釈は 2.34、4.69、9.38、18.75、37.5、75、150 pg/mL。 - 各ウェルに 100 μ L 標準液のまたは 100 μ L 試料溶液 (50 μ L 高濃度培地の希釈バッファーの 50 μ L) を追加します。2 時間室温で井戸を孵化させなさい。
- 吸引により標準またはサンプル ソリューションを削除します。洗浄バッファー x 1 の 300 μ L でも 4 x を洗います。IL-8 の IL-6 または 0.25 μ g/mL の 0.1 μ G/ml の濃度に希釈バッファーと検出の抗体を希釈します。100 μ L/ウェル希釈を追加します。2 時間室温で井戸を孵化させなさい。
- 吸引により抗体溶液を削除します。洗浄バッファー x 1 の 300 μ L でも 4 x を洗います。ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) を 0.05 μ G/ml の濃度に希釈バッファーで希釈します。ウェルあたりストレプトアビジン-HRP 溶液 100 μ L を追加します。30 分間室温で井戸を孵化させなさい。
- 吸引により抗体溶液を削除します。洗浄バッファー x 1 の 300 μ L でも 4 x を洗います。3, 3 ', 5, 5 '-テトラメチルベンチジン (TMB) 基板ソリューション各ウェルに 100 μ L を追加します。発色を可能にするために 20 分間室温で井戸を孵化させなさい。1 M HCl 停止液を 100 μ L の追加によって反作用を停止します。
- 450 で ELISA リーダーと各ウェルの吸光度を読み取り nm。
- 生成された規格の標準曲線をプロットします。IL 6 と IL-8 標準曲線によると馴化培地の濃度を計算します。細胞数を正規化後結果をプロットします。重複したサンプルの平均値を計算します。
注: Elisa 繰り返す必要がありますいない独立して少なくとも 3 倍、そして平均値必要がありますに基づいて計算されますこれらの結果 (図 4)。
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Representative Results
H Ras 誘導する老化の例は、図 1に示します。WI 38 H RasV12 レトロ ウイルスの培養細胞への感染には、劇的な形態学的変化 (図 1 b) が誘導されます。さらに、図 1のように、SA β gal 染色活動著しく H RasV12 式に増加しました。細胞の 70% 以上を示した SA β gal H RasV12 レトロ ウイルス感染後 6 d の活動を染色、私たちや他のグループを以前報告した21 H RasV12 の式が正常に WI 38 細胞で細胞老化を誘導することを示す、22。
図 2は、DCF DA 染色解析 H Ras 誘導性細胞老化にともなう ROS レベルを監視するための代表的な結果を示しています。増加された細胞内 ROS レベルは、H-ras 式の後の 2 日には早くも観察される、6 日時点まで維持されます。一方、SASP の誘導は、異なる速度を示しています。Il-6 mrna と IL-8、代表の SASP 要因の増加は、H-ras 式、8 日時点 (図 3) にピーク後 4 日から見られています。図 4に示すように、分泌された IL 6 と IL-8 レベルは同様の増加、リアルタイム PCR の結果と一致を表示します。これらの結果は、細胞老化の誘導に活性酸素と SASP のさまざまな役割をお勧めします。
図 1:形態変化と SA β gal H Ras による老化にともなう染色増加します。(A) このパネル WI 38 細胞における H Ras 誘導する老化の誘導実験の手順を示しています。(B) SA β gal 染色を行った示された時点で WI 38 H RasV12 レトロ ウイルスの細胞感染後ここでは、SA β gal 染色の代表的な画像が表示されます。(C) SA β gal 陽性細胞は 3 つの独立した実験で数えられました。結果は、平均値として表示し、誤差範囲を表す標準偏差 (SD)。P < 0.01、スチューデントのt-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: H Ras 誘導性の老化にともなう細胞内 ROS レベルの増加します。(A) WI 38 細胞 H-ras レトロ ウイルスに感染している, DCF da ステンド グラス (50 μ M) 示された時点で。DCF DA 蛍光強度は、流れの cytometer を用いて定量化されました。0-6 d の時点で DCF DA の蛍光強度の代表的なヒストグラムが表示されます。(B) DCF DA 蛍光強度 0、6 日時点での代表的なヒストグラムは比較のため一緒にプロットされます。(C) DCF-DA H Ras による老化にともなう蛍光強度を指定の時刻に測定したポイント 3 倍です。結果は、平均値として表示し、誤差範囲を表す標準偏差 (SD)。P < 0.05 と * * P < 0.01、スチューデントのt-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:H Ras による老化にともなう SASP 定量化関連 Mrna 。RNA は、H RasV12 レトロ ウイルス感染後示された時点で WI 38 細胞から調製しました。これらのパネルは、qPCRの表 1に記載されている特定のプライマーを用いて用いて IL-6 (A) および (B) IL-8 式の誘導を示します。アクチン mRNA のレベルは、正規化を使用しました。正規化された IL-6 または 0 日のサンプルで測定される il-8 mRNA レベルが 1 に設定された、相対的なフォールドの変更を求めた。実験が独立して繰り返し 3 x。結果は、平均値として表示し、誤差範囲を示す標準偏差 (SD)。P < 0.05 と * * P < 0.01、スチューデントのt-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:分泌 SASP の定量化要因 H Ras 誘導する老化中です。これらのパネルは、IL-6 (A) と IL-8 (C) の標準生成標準曲線を示します。調節されたメディアは、H RasV12 レトロ ウイルス感染後示された時点で WI 38 細胞から収穫されました。分泌された IL-6 (B) およびイリノイ 8 レベル (D)」はそれぞれ IL 6 と IL-8 ELISA キット、分析しました。実験が独立して繰り返し 3 x。結果は、平均値として表示し、誤差範囲を示す標準偏差 (SD)。P < 0.05 と * * P < 0.01、スチューデントのt-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 遺伝子名 | 前方のプライマー | 逆プライマー |
| IL-6 | 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' | 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3' |
| IL-8 | 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' | 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3' |
| アクチン | 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' | 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3' |
SASP の要因の表 1: リアルタイム PCR のプライマー。
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Discussion
ここでは、我々 は H Ras 誘導する老化は WI 38 正常ひと線維芽細胞の中に細胞内 ROS レベルを監視する方法を提案しました。生細胞における細胞内 ROS レベル DCF DA の細胞膜透過性の試薬を用いて測定することができ、フローサイトメトリーします。細胞内取り込みに DCF DA 細胞内エステラーゼによってされたきちん、その後、高い蛍光 2', 7'-ジクロルフルオレッセン (DCF) を形成する活性酸素による酸化。FL1 検出器 (蛍光グリーン) を用いたフローサイトメトリーによる DCF 蛍光を検出できます。DCF DA 染色法を使用して、正常を検出した増加 ROS レベル WI 38 正常ひと線維芽細胞の細胞老化の H Ras 誘導中。このメソッドは、ROS レベルの変更を監視する細胞老化の様々 なモデルで使用できます。DCF DA ROS 誘導を測定するために使用されている染色、その他の方法ほか、酸化傷害タンパク質23と共焦点顕微鏡による活性酸素依存性蛍光染料24のレベルを監視します。したがって、さらに追加のメソッドを使用して、ROS レベルの変化の確認が望ましいです。
最近では、p53 誘導する老化として H Ras 誘導する老化は21の中にがん細胞が ROS レベルが増加を示した.増加された細胞内 ROS レベルが SA β gal 活性染色、細胞老化の誘導に活性酸素の原因となる役割を示唆しているの増加前に観測可能なオブジェクト。興味深いことに、ROS レベルの増加は、p2121による細胞周期の停止中 Akt NF-κB NOX4 経路によって個別に制御します。Akt はロス増加もを調節する、細胞の老化の他の種類かどうか探るは興味深いでしょう。
また mRNA を解析するためのメソッドを導入して H Ras 誘導する老化の中に IL 6 と IL-8 SASP 因子の蛋白を分泌します。QPCR を使用して、il-6 および老化の WI-38 細胞の il-8 mRNA の誘導を定量化しました。正規化、内部統制としてアクチン mRNA レベルを調べたが、GAPDH mRNA は内部のコントロールとしても使用できます。18S リボソーム RNA (rRNA) は、qPCR 実験における内部統制として頻繁に使用される別のハウスキーピング遺伝子です。ただし、rRNA の転写やリボソーム成熟、細胞周期を停止し細胞老化25,26中に規制されている、ために、18S rRNA は細胞老化研究の良い内部統制できません。ELISA、類似を示した老化の WI-38 細胞から馴化培地を使用して分泌された IL-6 と IL-8 レベルで増加します。SASP は開発の概念と一貫性のある「成熟」老化段階19, il-6, il-8 分泌の増加は検出 ROS レベルの増加よりも後の時点で。特に、SASP 要因は細胞の種類や老化誘導条件27によって異なります。したがって、細胞の老化モデルによると適切な SASP 要因を選択する必要があります。
含め、その他の老化特性を監視することによって細胞の老化が SA β gal 染色活性の誘導と形態学的変化を監視することによって H Ras 誘導する老化を確認、さらに検証する、増殖の可能性、老化関連ヘテロクロマチン巣 (SAHF)、SASP 要因、腫瘍のサプレッサー p53 および p16INK4a, などの活性化不可逆的な損失が強化された DNA 損傷シグナルと DNA セグメントとして定義されて、永続的な核の巣老化 (DNA 跡) 強化クロマチンの変化。ただし、異なる老化の種類の老化特性の不均一性があることを覚えておく重要です。特定老化バイオ マーカーは、細胞老化のいくつかの特定の種類でのみ観測をすることができます。たとえば、SAHF は OIS28,29通常明白であります。
細胞の老化は当初人工培養条件によって引き起こされる自律増殖停止を表すと考えられました。ただし、過去半世紀の研究は、老化とがんを含む様々 な病態生理学的条件下での細胞の老化の重要性を示しています。細胞の老化と加齢に伴う組織の変質と因果は以前 BubR1 早老マウス モデル30,31で実証されています。したがって、老化細胞の除去のいずれかまたは、SASP の変調による細胞老化の制御は現在として加齢に伴う病気のため有望な戦略。確かに、最近の研究は、老化細胞の除去は幹細胞の枯渇、骨の損失、毛損失、変形性関節症32,33,など加齢に伴う病理のための有望な治療法になること実証34,,3536。老化の表現型、SASPs を含むと老化誘導の分子機構の理解は可能な欠点を削減し、選択的に劇物をターゲットのみによって老化を対象化する改良された戦略を提供します。老化細胞の機能。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は (若い淵金) に韓国の国立研究財団 (2015R1D1A1A01060839) からの助成金によって、韓国政府 (MSIT) によって資金を供給された国立研究財団の韓国 (NRF) の助成金によって支えられた (いいえ 2016R1A2B2008887 号2016R1A5A2007009) (に Jeanho ゆん)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/mL |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/mL |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2x mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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