Summary
Burada, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu tek hücreli atriyal cardiomyocytes yalıtım için açıklayınız. El ile düzenleme intraluminal basınç kalp boşlukları, işlevsel olarak sağlam miyositler uyarma-kasılma-kaplin çalışmaları için uygun verim için uygulanır.
Abstract
Bu makalede, biz bir en iyi duruma getirilmiş, Langendorff tabanlı tek hücreli atriyal cardiomyocytes (ACMs) bir fare modeli Metabolik sendromu (MetS) yalıtım için açıklayınız-kalp yetmezliği korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile ilgili. MetS ile ilgili HFpEF yaygınlığı artıyor ve atriyal remodeling mortalite bağımsız bir tahmin olarak atriyal kardiyomiyopatiler atriyal remodeling ve atriyal fibrilasyon ile ilgili klinik olarak son derece ilgilidir. Çalışmalar izole tek hücreli cardiomyocytes ile teyit ve in vivo bulgular tamamlayıcı için sık sık kullanılır. Dolaşım gemi rarefication ve interstisyel doku fibrozu ACMs başarılı tek hücreli yalıtım bu hastalığın hayvan modeller için potansiyel olarak kısıtlayıcı bir faktör poz.
Biz bu sorunu bir aygıtı el ile yalıtım işlem sırasında kalp boşlukları intraluminal basınç düzenleyen yetenekli istihdam ederek önemli ölçüde morfolojik ve fonksiyonel olarak sağlam ACMs verimini artırma ele sahip. Alınan hücreler, hücre kültürü ve fonksiyonel kalsiyum görüntüleme (yani, uyarma-kasılma-kaplin) gibi farklı deneyler çeşitli kullanılabilir.
Araştırmacı bir adım adım protokolüyle, listesini en iyi duruma getirilmiş çözümler, gerekli ekipman ve kapsamlı sorun giderme Rehberi hazırlamak için ayrıntılı yönergeler sağlar. Yordamın ilk uygulama oldukça zor olabilir, başarılı bir uyum okuyucu MetS ile ilgili HFpEF deneyler geniş bir yelpazede, fare modeli state-of--art ACM izolasyonların gerçekleştirmek izin verir.
Introduction
MetS tip-2 diyabet ve kalp-damar hastalıkları için risk faktörlerinin bir küme tanımlar ve artan bir arteryel kan basıncı içerir (trigliserid yükseltilmiş ve alçaltılmış yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol) dislipidemi, artan açlık glikoz ve merkezi obezite1. MetS dünya çapında yaygınlık % 25-30 ve sürekli yükselen2olduğu tahmin edilmektedir. HFpEF hànzú bir klinik sendrom genellikle MetS ile ilgili olduğunu. HFpEF ve onun önceki aşamaları (yani, hipertansif kalp hastalığı) sırasında kalp remodeling da kulakçık3/ remodeling tarafından eşlik eder. İndirimli contractile işlevi ve sol atriyum yapısal değişiklikler artmış mortalite, atriyal fibrilasyon ve yeni başlangıçlı kalp yetmezliği4ile ilişkili bulunmuştur. Atriyal remodeling iyon kanal işlevi, Ca2 + homeostazı, atriyal yapısı, fibroblast harekete geçirmek ve doku fibrozu5değişiklikler karakterizedir. Atriyal MetS ile ilgili HFpEF ve onun altında yatan patolojik mekanizmaları hala kötü anlaşılır ve bir daha da derinlemesine araştırma gereken remodeling için yorum yaptı. Hayvan modelleri var olmak a değerli alet ve atriyal kardiyomiyopatiler6,7,8,9alanında birçok gelişmeler yol kanıtlanmıştır.
Çalışmalar izole tek hücreli cardiomyocytes ile teyit ve in vivo bulgular tamamlayıcı için sık sık kullanılır. Bir izolasyon ve potansiyel sonraki hücre kültürü, yollar, iyonik kanal akımları ve uyarma-kasılma-kaplin sinyal soruşturma için izin verir. Fizyolojik koşullar altında cardiomyocytes çoğalırlar değil. Füzyon bir atrial natriuretic faktör transkripsiyon düzenleyici dizisi ve bir simian virüs 40 büyük T antijen transgenik farelerde arasında AT-110adlı ilk ölümsüzleştirdi ACMs yol açtı. AT-1 hücreleri daha da geliştirilmesi sadece seri olarak passaged edemem ama aynı zamanda kendiliğinden sözleşme11HL-1 hücrelere doğuran. Ancak, daha az organize ultrastructure myofibrils11ve bir hyperpolarization harekete geçirmek içe geçerli12geliştirme yüksek bir olay gibi taze izole hücrelere kıyasla yapısal ve işlevsel farklılıklar göstermektedir. Ventrikül cardiomyocytes (VCM) sıçanlar ve fareler modelleri çeşitli yalıtım iyi kurulmuş13,14,15,16,17,18 ' dir , 19. genel olarak eksize kalp Langendorff aparatı monte ve retrogradely bir Ca2 +ile derin-collagenases ve proteaz gibi sindirim enzimleri içeren boş arabellek. Kalsiyum o zaman fizyolojik şartlarda kademeli bir şekilde yeniden ortaya çıkar. Ancak, kullanışlılığı hastalık modelleri atriyal remodeling ile sınırlı olmasına rağmen ACMs yalıtım için adanmış protokolleri kullanılabilir20,21, artan fibrozis ve basınç ilgili farklar nedeniyle.
Bu makalede, bir protokol atriyal remodeling (yani, özellikle ZFS1 fare modeli MetS ile ilgili HFpEF için)22göstermek hayvanlardan atriyal tek hücreli cardiomyocytes yalıtım için hayata geçirdik. Varolan yalıtım protokolleri en iyi duruma getirilmiş ve kontrol ve morfolojik ve fonksiyonel olarak sağlam cardiomyocytes daha yüksek verimleri için önde gelen kardiyak boşluklar, intraluminal basınç değiştirmek için basit, özel yapım bir aygıt tarafından tamamlanmaktadır. Aşağıdaki iletişim kuralı bir adım adım kılavuz ile araştırmacı, özel yapım donanımları, bir liste-in eriyik yanı sıra kapsamlı sorun giderme kılavuzu ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm Deneyleri Yerel Etik Komitesi (TVA T0060/15 ve T0003-15) tarafından onaylanmış ve bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal Sağlık Enstitüsü, U.S.A.) için yönergeleri ile anlaşma yapılır.
Not: Yordam basitleştirilmiş bir akış çizelgesi Şekil 1' de gösterilen.
1. Albuquerque'de
- Arabellekleri Tablo 1 göre hazırlayın.
| Çözüm | TÜRKÇE | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Reaktif (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| Na2HPO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurin | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Glikoz | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDÖ | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0,01 | 0,125 | 0,25 | 0,5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Arıtılmış enzim karışımı (orta Thermolysin) | 0.195 Wünsch adet/mL | ||||||||
| ulaşmak için pH ayarlama | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| pH, ayarlanabilir | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH ayarlamasının yapılacağı | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Tablo 1: arabellek listesi. PB: 4 ° c (hayvan başına 300 mL) 3 gündür depolanan perfüzyon arabellek. CB: 4 ° c (hayvan başına 200 mL) 3 gündür depolanan cannulation arabellek. DB: (hayvan başına 40 mL) gün içinde kullanılacak olan sindirim arabellek. SB: arabellek durdurma, hangi (hayvan başına 2 mL) gün içinde kullanılması gerekir. S1: (hayvan başına 2 mL) gün içinde kullanılacak olan adım 1 bir arabellek. S2: (hayvan başına 2 mL) gün içinde kullanılacak olan adım 2 arabellek. S3: (hayvan başına 2 mL) gün içinde kullanılacak olan adım 3 arabellek. NT: (hayvan başına 50 mL) gün içinde kullanılacak olan normal Tyrode.
-
Langendorff aparatı (Şekil 2A) hazırlayın.
- % 70 etanol, 2 100 mL distile su basması tarafından takip 100 mL ile sistem floş. Sistem perfüzyon arabellek (PB) 200 mL ile doldurulması.
- Peristaltik pompa debisi 3 mL/dk için ayarlayın.
- Langendorff aparatı 39 ° C'ye bırakarak PB sıcaklığını ayarlama
- [16 G, 25 mm uzunluğunda, keskin ucu (Şekil 3A) kaldırıldı] özel yapım kanül Langendorff aparatı üzerine yerleştirin ve akışını başlatmak. Isıtma modülü açmak ve PB kanül ucu, istenen sıcaklığını ulaşmak için ısıtma modülü değerini ayarlayın. Sıcaklık Kalibrasyonu tamamlandığında, özel yapım kanül cannulation (Şekil 2B) için kullanılan şırınga taşıyın.
- Langendorff sistem yanında basınç kontrol cihazı (Şekil 3 c) hazırlayın. Kelebek iğne tripod kelepçe üzerine monte ve 3 engelleme knot hazırlamak.
Not: Collagenase enzim aktivitesi sıcaklık ile değişir. Bir sıcaklık sol atriyum, yanı sıra, dinamik bir ayarlama izleme yordamı daha sonra gereklidir.
- Organ eksizyon ve cannulation göre Şekil 2Biçin donatım ayarlayın. Kabı, şırınga ve Petri kabına bir buz gibi cannulation arabellek (CB) ile doldurmak ve cannulation deniz mili hazırlamak.
-
Heparin sıçan vücut ağırlığı 100 gram başına 500 IU fareyle aşağıdaki gibi heparinize.
- 2 mL % 100 isoflurane bir anestezi indüksiyon odasında kemirgen için uygun koy. 21 haftalık ZFS-1 obez sıçan kafes indüksiyon odasına aktar. Fareyi bir yavaşlama nefes ilk frekansını yarısı simgesiyle derin anestezi girmek izin verir.
- Fareyi indüksiyon odasından kaldırın. Heparin sıçan vücut ağırlığı 100 gram başına 500 IU heparin kullanarak periton enjekte.
- Fareyi onun kafes dönün ve onu uyandırmak için izin.
Not: Kısırlık adımı sırasında 1.4 korumak için gerekli değildir. Bir sonraki adıma devam etmeden önce 20 dakika bekleyin. Eksik bir anticoagulation kan pıhtılaşması, mikro-izole cardiomyocytes verim ve kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir enfarktüsü için önde gelen neden olabilir.
2. kalp hazırlık
- 2 mL % 100 isoflurane bir anestezi indüksiyon odasında kemirgen için uygun koy. 21 haftalık ZFS-1 obez sıçan kafes indüksiyon odasına aktar. Fareyi bir yavaşlama nefes ilk frekansını yarısı simgesiyle derin anestezi girmek izin verir.
- Hayvan kemirgen için uygun bir Giyotin kullanarak işten çıkarma tarafından ötenazi. Polistren köpük yüzey üzerinde fare ekstremitelerin bağlayacaktın. Asansör ve xiphoid süreci ile cerrahi makas kapsayan deri kaldırmak. Her iki tarafta kaburga kafesi altındaki Karın zarını açın ve diyafram bulaşmasına neden.
- Diyafram iyi makas kullanarak ön ark boyunca bir kesi yaparak dosyayı açtı. Mediasten içinde in situortaya çıkarmak için cerrahi makas kullanarak klavikular kemik, linea mediaclavicularis boyunca her iki tarafta kaburga kesilmiş.
- Hila distal ucunda akciğerleri iyi makasla kaldırın. Aort ortaya çıkarmak için timus kesti.
- Forseps kullanarak kalp Bankası pinch ve hayvan kuyruk doğru yavaşça çekin. Aort arasında bir çekme kalp korurken kesim, 5 mm uzun segment aort bırakarak kalbe bağlı. Hızlı bir şekilde kalp 50 ml kabı (Şekil 2B) 50 mL buz gibi CB içine aktarın.
Not: 2.5-3.3, adımları sırasında kalp iskemik koşullarında etkili olur. Adımları sırayla cardiomyocytes zarar vermemesi için 3 dk toplam aşmasını önlemek.
3. cannulation
- Bekle yaklaşık 10 s kalp soğumasını ve kasılmalar ele geçirmek için. Kalp taze, 50 mL içeren bir Petri kabına aktarmak buz gibi CB. Forseps ve makas kullanarak aort çevreleyen yağ dokusunda dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Buz gibi CB, aorta içine 3 mm ile dolu 10 mL şırınga eklendiği özel yapım kanül (aynı 1.2.3 adımda kullanılan), yerleştirin. Aort kanülü üzerine bir iki cannulation deniz mili (Şekil 3B) bağlayarak girintisini kanül içinde için belgili tanımlık uç proksimal bağlayacaktın.
Not: aort kapak kanül ile bir penetrasyon tarafından zarar vermemeye dikkat et. - Yavaşça aort ile buz gibi CB kanül için daha fazla kan koroner arterlerde görünene kadar bağlı Ģırınga kullanarak 5 mL sifonu çek. Yavaşça sol atriyum forseps kullanarak masaj ve Petri kabına boşluğundan kaldırılacak aşırı kan için izin CB, kalan 5 mL enjekte.
- İkinci cannulation düğüm kravat (dikiş: USP 3/0, ipek) kanül girintisini distal ucuna kadar içinde. Ekli kalpli kanül şırıngadan çıkarın. Kanül ile uygun bir adaptör kullanarak Langendorff eklenmiş kalbe bağlayın.
Not: Langendorff aparatı, perfüzyon sırasında ventrikül boşluğunda yüksek basıncı bu protokolü kullanır. Ek cannulation düğüm herhangi bir Anterograd arabellek sızıntı aort yoluyla kaçınarak bu basınç korumak için gereklidir.
4. basınç manipülasyon ve sindirim
- PB ile kalp doku perfüzyon başlatmak için Langendorff aparatı peristaltik pompa başlatın. Çift kişilik bir yukarıdan aşağı düğüm (dikiş: USP 3/0, ipek) aort kalp tabanı etrafında hariç. Sağ ve sol atrium bir enflasyon kadar bu adımı yineleyin, hem de koroner sinüs fark ettim.
- Atrium Hidrofor kontrol cihazı (şekil 3D) kelebek iğneyle delik ve atrium havasını boşaltmak izin verir. Atrium intraluminal basınç kelebek hortum yükselmesine ayarlayarak işlemek. Biraz şişirilmiş yordamın geri kalanında atrium tutun; izlemek ve buna göre ayarlayın.
Not: Bu adım gibi sol atriyum uzun süreli bir enflasyon cardiomyocyte ölümle sonuçlanır hızla, yapılması gerekiyor. - Sol atrium ve sol ventrikül arasında bir sıcaklık probu konumlandırma tarafından sol atriyum yaklaşık sıcaklığını ölçmek. Buna göre modül Isıtma, 37 ° C, sol atriyum yaklaşık bir sıcaklık hedefleme Langendorff sıcaklığı ayarlayın.
- PB ile kalp 3 dk toplam sıvı.
- Perfüzyon yaklaşık 14-18 min için bir sindirim tampon (DB) geçin.
Not: Sindirimi sol atriyal yapısı çöker ve sütlü bir doku doku edinme tamamlanmıştır. - Forseps kullanarak atrium pinch ve hafif bir çekme kararnameler. Ve avluyu tamamen doku batış arabellek (SB), durdurma 2 mL içeren büyük bir tartı tekne transfer iyi makas kullanırken sol atriyum çıkarın.
- Nerede müdahalede laboratuvar yönergeleri izleyerek kalan kalp dokusunun atın.
5. hücre işleme ve kalsiyum yeniden uyum
- Atriyal doku kabaca 2 x 2 iyi makas kullanarak mm küçük parçalar halinde kıyma.
- Doku nazik emiş ve ejeksiyon transfer pipet kullanarak doku parçaları tarafından dağıtmak. Doku makroskopik bir ayrılma gözlenen kadar yaklaşık 5 min için bu işleme devam edin.
Not: herhangi bir kaçının hava hücrelere açığa olarak bu adımı sırasında hava kabarcıkları cardiomyocyte ölümle sonuçlanır. - Hücreleri 15 mL konik tüp aktarın. 30 s. Transfer için süpernatant başka bir 15 mL konik tüp içine yerleşmeye doku parçaları izin. Hücreleri 15dk için yerleşmek için izin verir.
- Kaldırmak ve süpernatant atın. 1. adımda arabellek 2 mL ekleyin (bkz. Tablo 1). Cardiomyocytes 10 dk için yerleşmek izin verir.
Not: Atılan süpernatant Ayrıca fibroblast ve endotel hücreleri içerir. Bu hücreler deneyler14,23için kullanmak için istenirse diğer protokoller için bakınız. Pelet ışık mikroskobu tarafından onaylanabilir çoğunlukla atriyal cardiomyocytes içerir. Atriyal cardiomyocytes mikroskopik özellikleri adım 6.1 ele alınmıştır. - Kaldırmak ve süpernatant atın. 2. adımda arabellek 2 mL ekleyin. Cardiomyocytes 10 dk için yerleşmek izin verir.
- Kaldırmak ve süpernatant atın. Adım 3 arabellek 2 mL ekleyin. Cardiomyocytes 10 dk için yerleşmek izin verir.
- Kaldırmak ve süpernatant atın. 250 µL, normal Tyrode (1 mM Ca2 +içeren NT) ekleyin.
- Atriyal cardiomyocytes göre % 25 laminin ile kaplı (ve önceden kuru izin) cam alt çanak üzerine içeren normal Tyrode 50 µL aktarın. Cardiomyocytes 10 dk için yerleşmek izin verir.
- Cam-alt çanak NT 1 mM CaCl2içeren 500 µL ile doldurun.
6. işlevsel uyarma-kasılma-kaplin değerlendirilmesi
- Hücre morfolojisi ve canlılığı bir 20 X büyütme (Şekil 4A ve 4B) kullanarak ışık mikroskop altında değerlendirmek. Rasgele yaklaşık 100 hücreleri seçin ve onları uygun ya da kamunun olarak hücre izolasyon yordamı canlılığı tahmin etmek için sınıflandırmak.
Not: Hücrelerin simetrik sarcomere yapısı, membran blebs yokluğu ve bir çubuk şekli ile karakterizedir. -
Ca2 +hücrelerle yük-hassas floresan boya tamamlama 20 dakika içinde adım 5,9.
- 10 µM eklemek Fluo4-AM cam alt çanak (Kimden adım 5,9) gelen NT. Kaldır süpernatant 500 µL için. Fluo4-AM cam alt yemek için içeren NT ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Kaldırmak ve süpernatant atın. Örnek 2 x 500 µL NT kullanarak yıkayın.
-
Ca2 +görselleştirmek-uyarma aşağıdaki gibi confocal mikroskop ile.
- Cam-alt çanak confocal mikroskop için aktarmak ve Ca2 +görselleştirmek-uyarma confocal mikroskop ile (lazer % 5.8, uyarma, 488 yoğunlukta nm, 515, emisyon nm) 40 X büyütme kullanarak.
- Uygun bir superfusion aygıtı kullanarak 37 ° C'ye ısıtılmış NT ile hücreler sıvı. Alternatif olarak, hücrelerin mikroskop monte ısı kuluçka makinesi kullanarak sıcak tut.
- Cardiomyocytes bir elektrik alanı ticari olarak mevcut, mikroskop monte uyarıcı elektrotlar 1 Hz frekans ve kararlı bir duruma Ca2 + işleme ulaşmak için hücreleri izin vermek için 1 dk 24 A. bekleyin bir elektrik akımı ile teşvik.
- Tarama satırı Enine ekseni, yarım çekirdek ve rastgele seçilen bir kenarı arasında paralel macroscopically hücre müteahhitlik koyun. Çizgi tarama görüntüleri tekrarlayan tarayarak elde etmek.
- Tüm hücre boyunca sinyal şiddeti hemen önce bir elektrik stimülasyon (F0) tahmin etmek için serbestçe kullanılabilir görüntüleme yazılımı kullanın. Sinyal şiddeti 1 stimülasyon döngüsü (F) boyunca tüm hücre boyunca çizmek. (F) ilgili Ca2 + geçici elde etmek için (F0tarafından) bölün.
Şekil 1: yalıtım yordam Basitleştirilmiş akış çizelgesi. Miyositler enzimatik sindirim tamamlanıncaya kadar çok zaman hassas işlemdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: ekipman izolasyonu önce hazırlanması. (A) Bu panel gösterir kendini yetiştirmiş bir Langendorff Aparatı: (1) bir ceketli reaksiyon teknesi ile PB; (2) bir ceketli reaksiyon teknesi CB ile; (3) bir 3-yönlü stopcock; (4) bir şırınga; (5) bir peristaltik pompa; (6) bir Isıtma daldırma; (7) bir ceketli kabarcık tuzak; ve (8) kanül ve kalp. (B) Bu panel kurulum için bir en iyi duruma getirilmiş iş akışı için cannulation ve organ eksizyon gösterir: (1) ile buz gibi CB; 50 mL 100 mL kabı (2) buz gibi CB bir 10 mL şırınga; (3) buz gibi CB ile Petri kabına; (4) bir ışık kaynağı; (5 bir cannulation ile özel yapım kanül düğüm (Ayrıca bkz: Şekil 3A ve 3B); (6) iyi, kavisli forseps; (7) doku forsepsi; (8) iyi forseps, 45° açılı; (9) abdominal cerrahi makas; (10) iyi cerrahi makas; (11) 4 x 30 G iğneler; ve (12) 15 G iğne. (C) Bu panel gösterir confocal görüntüleme için mikroskop monte donatım: (1) Elektrikli uyarıcı elektrotlar; (2) superfusion bir kalem; (3) bir cam alt çanak ACMs ile; ve (4) batırılır platin elektrikli uyarıcı elektrotlar. (D) Bu panel confocal görüntüleme için mikroskop set-up gösterir: (1) confocal mikroskop; (2) superfusion bir kalem; (3) bir superfusion arabellek rezervuar; (4) bir superfusion akım regülatörü; (5) bir superfusion modülü Isıtma; (6) bir bilgisayar iş istasyonu; ve (7) elektrikli bir uyarıcı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: özel yapım donatımı. (A) Bu panel gösterir işlenmiş 15 G kanül radarı kilit. Oklar cannulation deniz mili için iki girintili yazımları gösterir. (B) bu cannulation deniz mili, iki kişilik yukarıdan aşağı knot birbirinin üstüne hızlı sıkma için yer vardır. Oklar, nerede ve hangi düğüm sıkılır gerekir gösterir. (C) Bu panel montajı basınç kontrol cihazı gösterir. 21 G kelebek iğne bir tripod kelepçe bağladım. Hortum iğne olarak aynı yükseklikte tutulur. Vida üst açılır. Kelebek hortum yükselmesine sol atriyum intraluminal basınç değiştirmek için okları tarafından belirtildiği şekilde değiştirilebilir. (D) sol atriyum basıncı kontrol cihazı ile delinmiş. Bu resim bir ideal olarak şişirilmiş sol atriyum gösteriyor. Elipsin yukarıdan aşağı düğüm yerleşimini işaretler. (E) sol atriyum basıncı kontrol cihazı ile delinmiş. Bu resim uygun ACMs bir alt verim içinde sonuçlanır aşırı şişirilmiş bir sol atriyum gösteriyor. Elipsin yukarıdan aşağı düğüm yerleşimini işaretler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21 haftalıkken 60-90 oranında kalsiyum yeniden uyarlaması (adım 5.4-5,7), (adım 6.1 açıklandığı gibi tahmini) uygun ACMs ZSF-1 obez sıçanlarından emir bu Yöntem (Şekil 4A) tarafından ayrılmış olabilir. Rat, farklı bir ve daha fazla hànzú fenotip VCMs24,25ile karşılaştırıldığında ACMs karakterizedir. Şekil 4B korunmuş membranlar ve sarcomere yapısı, işlevsel olarak ayrılmaz bir hücrenin her iki güçlü göstergeleri ile bireysel bir ACM gösterir.
Edinsel ACMs çeşitli şekillerde işlenebilir. Şekil 5' te olarak, hücreleri floresan boyalar Morfoloji ve/veya işlev çalışırdım yüklü. Örneğin, di-8-ANEPPS bir atriyal sıçan hücre (Şekil 5A) borulu sistemde betimlemek için kullanıldı. Başka bir dizi deney, mitokondri boyama çok kırmızı floresans boya (Örneğin, mitotracker-kırmızı-FM) atriyal remodeling sitozolik mitokondri (Şekil 5B) tespit etmek için istihdam edilmektedir. Şekil 5Ciçinde gösterildiği gibi bu iletişim kuralı ile izole ACMs Ayrıca canlı hücreli Ca2 + görüntüleme için uygun ve sağlam uyarma-kasılma 1 Hz ile kaplin alan stimülasyon göstermektedir. Tüm görüntüleri daha fazla analiz algoritmaları araştırmacı6,7 (Şekil 5 d) kullanılabilir çeşitli kullanarak kullanılabilir.
Şekil 4: uygun, tek hücreli am ilgili verim (A) Bu panel2 + NT. (B) Bu panel gösterir bir izole, tek hücreli atriyal cardiomyocyte bir yalıtım ACMs yeniden uyarlaması 1 mM Ca için verim gösterir. Çekirdek, hücre zarı ve sarcomere yapısını açıkça görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: sıçan ACMs floresan boyalar ile boyama. (A)Bu panel gösterir bir hücre zarı ve floresan boya Di8ANNEPS borulu ağ boyama. (B) Bu panel gösterileri mitokondri floresan boya mitotracker-kırmızı-FM. (C) ile boyama bu panel enine satır tarama bir Ca2 +-uyarma tek bir hücre üzerinde floresan boya Fluo4-AM. Oklar, 1 Hz Bu panel panelinden Ctüretilmiş longitudenal Ca2 + geçişler gösterir. (D) yürütülen elektriksel stimülasyon gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, ilk tek hücreli ACMs atriyal remodeling22işaretlenmiş gösteren MetS ile ilgili HFpEF bir fare modeli yalıtım için bir protokol açıklanan. Aşırı yağ dokusu aort, giderek daha zor cannulation yanı sıra cerrahi hazırlık yapabilir gibi benzersiz olarak zor bir işlemdir. Sorun giderme kılavuzu Tablo 2 adresleri yalıtım yordam en yaygın sorunların sağlanan.
| Sorun | Olası neden | Çözüm |
| Kelebek hortum ile hiçbir akışı | Aort cannulation deniz mili ile yanlış kapatma | Sıkma önce yağlı dokuyu |
| 3 cannulation düğüm ile ilgili girinti ekleme | ||
| Düğüm artan gücü için el ile Çek | ||
| Engellenen iğne | Lümen pozisyona yeniden düzenlemek | |
| Tarafından nazik çekme şırınga ile engelini kaldırmak | ||
| Sağ atrium / koroner sinüs değil şişirilmiş | Kalp Bankası uygunsuz kapatılması | Blok akışı ile ek deniz mili |
| Sağ atrium hazırlık sırasında zarar görmüş | Küçük resimleri/deniz mili ile yakın sızıntı | |
| Zavallı sindirim / atrium yumuşatmak değil | Yanlış sıcaklık aracılığıyla azaltılmış enzim aktivitesi | 37 ° C sıcaklığa ayarlamak |
| Devre dışı/bozulmuş enzim | Değiştir | |
| Eski/aşırı fibrotik atrium | Sindirim süresini artırmak (adımlarla, + %50) | |
| Hasarlı aort kapak | Cannulation sırasında sığ penetrasyon | |
| Zavallı hücre verim | Aşırı sindirilmiş atrium | Sindirim zamanı azaltmak (adımlarla + %25) |
| Kelebek hortum düşürerek intraluminal basınç azaltmak | ||
| Atrium altında sindirmek | Sindirim zaman (% 25 adımda) artış | |
| Kelebek hortum yükselterek intraluminal basınç artışı | ||
| Hücre dağılımı çok agresif | Daha nazik olun |
Tablo 2: sorun giderme kılavuzu. Bu tablo yalıtım yordam ve ilgili çözümleri ortak sorunları gösterir.
Bir son çalışmada, ZFS-1 obez fare modeli ile bir artan atriyal boyutu22geniş atriyal remodeling sergileyen göstermiştir. Sol atriyal boyutunda bir artış diyastolik disfonksiyon26 için önemli bir prognostik marker olarak kabul edilmiştir ve bir rarefication doku göre mikrovasküler gemilerin neden olur. Bu aracılığıyla aortaya retrograd perfüzyon özellikle zorlu bu modelde tek hücreli yalıtım işleme ayırma işlemi sırasında sindirim tamponunun azalmış bir dağıtım yol açar. Atriyal remodeling, atriyal fibrozis ve artan fibrozis diğer hallmark özelliklerini ZDF sıçanlara göstermiştir — bir sıçan model metabolik diyabet ve ZFS1 bir üst suşu sıçanlar27. Kollajen mevduat üzerinden hücre dışı matriks cardiomyocytes kurtarmak ve bu nedenle, daha fazla ayarlamalar hücre izolasyon yordamı28ihtiyacınız için sindirim enzimleri etkinliği zayıflatabilir.
Hangi tarafından geliştirilmiş yalıtım sonuçları atriyal yeniden bu modelde Hidrofor cihazı kolaylaştırır mekanizması için yerelleştirilmiş bir zayıflama sol atriyum koroner kan akımı ile ilgili olabilir. Bir büyük, koroner kan akımı koroner arter basıncı ve end-diastolik basınç ilgili kavite29arasında degrade olarak tanımlanan koroner perfüzyon basıncı bileşenidir. Açıklanan yordamı sırasında kalp Bankası tıkanması koroner arter basıncı ve intraluminal basınç kalp boyunca genel bir artış yol açar. Sol atriyum sonraki delik intraluminal basınç sol atriyal boşluğunda bir yerel, seçici damla kolaylaştırır. Böylece, sadece büyük koroner perfüzyon basıncı degrade kurulur ama perfüzyon birim ayrıca sıkışık sol ventrikül yönlendirilir sindirim çözümden sol atriyum için artırılır.
Ayrıca, seçtiğiniz bir sindirim enzimleri ACM yalıtım için önemlidir: saf collagenase ı ve II gösterilmiştir collagenases30gibi daha az hedeflenen ve daha az saf enzimler için üstün olmak için enzim karışımları. Bu enzim yalnızca morfolojik ve fonksiyonel olarak sağlam cardiomyocytes daha yüksek bir verim için izin vermez ama aynı zamanda herhangi bir tek hücreleri sonra onların yalıtım31topaklanma en aza indirir. Ek bir yüksek dispase ile collagenases, saflaştırılmış enzim karışımları veya orta thermolysin içeriği en sık sıçan cardiomyocyte izolasyonların için kullanılır. VCMs daha yüksek konsantrasyonları en iyi izole olmakla birlikte, atriyal miyositler en iyi sonuçları satın alınan 0.195 bir konsantrasyon ile Wünsch adet/mL istimal bu protokol32.
MetS ile ilgili HFpEF yaygınlığı yükselen2 ve atriyal kardiyomiyopatiler atriyal remodeling için önde gelen ve atriyal fibrilasyon şunlardır klinik olarak son derece alakalı, bu alanda araştırma önemli ilgi olduğunu. HFpEF birçok yeni hayvan modellerinde33,34 ortaya çıkıyor ve hallmark hastalık bir Atriyal ritim bozuklukları olaylarının artması doğrultusunda remodeling atriyal özellikleridir. Açıklanan yöntemi araştırmacılar atriyal remodeling için daha fazla çalışma ile son derece yüksek bir verim ile sıçan modellerinden uygun tek cardiomyocytes izole etmek izin verir ve mekanik ve elektrik işlevi korunmuş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma DZHK (Almanca merkezi kardiyovasküler araştırma, DB), tarafından desteklenmiştir (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), EKFS ve BMBF (Alman Milli Eğitim Bakanlığı ve araştırma), hem de klinik bilim adamı programı finanse BIH Charité tarafından Charité tarafından - Universitätsmedizin Berlin ve Berlin Sağlığı Enstitüsü (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
