Summary
Здесь мы описываем оптимизированный, основанные на Langendorff процедура для изоляции одноклеточных предсердий кардиомиоцитов из крыса модели метаболических связанных с синдром сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранились. Ручного регулирования давления внутрипросветная полостей сердца реализуется, чтобы принести функционально нетронутым миоцитах подходит для возбуждения сужение муфта исследований.
Abstract
В этой статье мы опишем оптимизированный, основанные на Langendorff процедура для изоляции одноклеточных предсердий кардиомиоцитов (мах) от мышиной модели метаболического синдрома (Мец)-связанных с сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранились (HFpEF). Распространенность связанных с Мец HFpEF растет, и предсердий кардиомиопатии, связанные с предсердной ремоделирования и фибрилляция предсердий клинически весьма актуальны, поскольку предсердная ремоделирования является независимым предиктором смертности. Исследования с изолированных cardiomyocytes одноклеточных часто используются для подтверждения и дополнения выводов в естественных условиях . Rarefication кровообращения судна и фиброз интерстициальной ткани создают потенциально ограничивающим фактором для успешного одноклеточных изоляции Мах от животных моделей этого заболевания.
Мы затрагивали этот вопрос, используя устройство, способное вручную регулирования давления внутрипросветная полостей сердца во время процедуры изоляции, существенно увеличивая урожайности морфологически и функционально нетронутым мах. Полученные клетки может использоваться в различных различных экспериментов, например культуры клеток и функциональной кальция томографии (то есть, возбуждения сужение муфта).
Мы предоставляем исследователь с шаг за шагом протокола, список оптимизированных решений, тщательного инструкции подготовить необходимое оборудование и всеобъемлющее руководство по устранению неполадок. Хотя первоначальное осуществление процедуры может быть довольно сложно, успешная адаптация позволит читателю для выполнения изоляции ACM-искусство в мышиной модели связанных с Мец HFpEF для широкого спектра экспериментов.
Introduction
Мец описывает кластер факторов риска для сердечно-сосудистые заболевания и сахарный диабет 2 типа и включает повышение артериального давления, дислипидемия (подняли уровень триглицеридов и снижение холестерина липопротеидов высокой плотности), увеличилось поста глюкоза, а Центральное ожирение1. Во всем мире распространенность Мец оценивается в 25 – 30% и постоянно растущей2. HFpEF представляет собой разнородные клинический синдром, часто ассоциируется с Мец. Сопровождается также Ремоделирование предсердия3сердца ремоделирования ее предыдущих этапах (то есть, гипертоническая болезнь) и HFpEF. Снижение сократительной функции и структурные изменения левого предсердия были связаны с повышенной смертности, фибрилляция предсердий и новым началом сердечной недостаточности4. Предсердий ремоделирования характеризуется изменениями в ионных каналов, Ca2 + гомеостаза, предсердная структуры, активации фибропластов и фиброз тканей5. Оставил предсердий Ремоделирование в связанных с Мец HFpEF и лежащие в его основе патологические механизмы все еще плохо поняты и требуют дальнейшего углубленного расследования. Животные модели оказались ценным инструментом и привести к многие достижения в области предсердий кардиомиопатии6,,78,9.
Исследования с изолированных cardiomyocytes одноклеточных часто используются для подтверждения и дополнения выводов в естественных условиях . Изоляции и потенциальных последующих клетки культуры, позволяют для расследования случаев сигнальные пути, ионного канала токов и возбуждения сужение муфта. В физиологических условиях не размножаются кардиомиоцитов. Слияние между транскрипционный анализ нормативных последовательности atrial natriuretic фактор и Обезьяний вирус 40 больших T антигена в трансгенных мышей привело к созданию первого увековечен мах, названный AT-110. Дальнейшее развитие АТ-1 клеток породило клеток HL-1, которые не только быть пассированной серийно, но также контракта спонтанно11. Они однако, показать структурные и функциональные различия по сравнению с свежевыделенных клеток, таких как менее организованных Ультраструктура, высокая вхождения развивающихся миофибрилл11и активирован гиперполяризации внутрь текущего12. Изоляция кардиомиоцитов желудочков (VCM) у крыс и мышей от различных моделей является хорошо установленным13,14,,1516,17,18 , 19. как правило, крепится к Langendorff аппарат и retrogradely увлажненную с Ca2 +подакцизным сердце-Бесплатная буфер, содержащий пищеварительные ферменты, такие как коллагеназы и протеаз. Кальция затем восстановлена на основе поэтапного в физиологических условиях. Однако даже несмотря на то, что протоколы, посвященный изоляции платежных терминалов, имеющиеся в20,21, благодаря увеличению фиброз и различия, связанные с давлением, их полезность в моделях заболеваний с предсердной ремоделирования является ограниченным.
В этой статье мы реализовали протокол для изоляции предсердий кардиомиоцитов одноклеточных животных, которые показывают предсердий ремоделирования (т.е., в частности для ZFS1 крысы модель для связанных с Мец HFpEF)22. Существующие протоколы изоляции были оптимизированы и дополнены простой, заказной устройства для контроля и изменение давления внутрипросветная полостей сердца, приводит к повышению урожайности морфологически и функционально нетронутым кардиомиоцитов. Следующий протокол обеспечивает исследователь с пошаговое руководство, подробное описание оборудования по индивидуальному заказу, список решений, а также всеобъемлющее руководство по устранению неполадок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были утверждены местным комитетом по этике (TVA T0060/15 и T0003-15) и осуществляется по согласованию с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных (Национальный институт здравоохранения, США).
Примечание: На рисунке 1показана упрощенная схема процедуры.
1. prearrangements
- Подготовьте буферы согласно таблице 1.
| Решение | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Реагент (мм) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| ДКК | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| Na2HPO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Таурин | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0.01 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Очищенный фермент смесь (средний Thermolysin) | 0,195 Wünsch единиц/мл | ||||||||
| подобрать подходящий pH | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| скорректирована на pH | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| скорректирована с pH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Таблица 1: список буферов. PB: перфузии буфер, который может храниться в течение 3 дней при температуре 4 ° C (300 мл на животное). CB: катетеризации буфер, который может храниться в течение 3 дней при температуре 4 ° C (200 мл на животное). DB: пищеварение буфер, который должен быть использован в течение дня (40 мл на животное). SB: остановка буфер, который должен использоваться в течение дня (2 мл на животное). S1: Шаг 1 буфер, который должен быть использован в течение дня (2 мл на животное). S2: Шаг 2 буфер, который должен быть использован в течение дня (2 мл на животное). S3: Шаг 3 буфер, который должен быть использован в течение дня (2 мл на животное). NT: нормальный Tyrode, который должен быть использован в течение дня (50 мл на животное).
-
Подготовьте аппарат Langendorff (рис. 2A).
- Промойте систему с 100 мл 70% этанола, а затем 2 флеши 100 мл дистиллированной воды. Заполните систему с 200 мл перфузии буфера (PB).
- Установите скорость потока перистальтического насоса до 3 мл/мин.
- Калибровка температуры PB, оставляя Langendorff аппарат до 39 ° C.
- Разместите заказ канюля [16 G, 25 мм длиной, острый кончик удалены (Рисунок 3А)] на вершине Langendorff аппарат и запустить поток. Включите Отопление модуль и отрегулируйте значение модуля Отопление для достижения желаемой температуры PB на кончике канюли. После завершения калибровки температуры, переместите на заказ канюля шприц используется для катетеризации (рис. 2B).
- Подготовьте устройство контроля давления (рис. 3 c) рядом с Langendorff системы. Смонтировать Бабочка иглы на зажим штатива и подготовить 3 блокирования узлов.
Примечание: Коллагеназа ферментативной активности зависит от температуры. Мониторинг температуры левого предсердия, а также динамическая корректировка их, требуется позже в процедуре.
- Настройка оборудования для обрезания орган и катетеризации согласно рис. 2B. Заполнить стакан, шприц и Петри с ледяной катетеризации буфером (CB) и подготовить катетеризации узлов.
-
Heparinize Крыса с 500 И.Ю гепарина на 100 г веса тела крыс следующим образом.
- Положите 2 мл 100% изофлюрановая в камере индукции анестезии для грызунов. Передача 21 неделя старый ZFS-1 ожирением крыса от клетки к палате индукции. Разрешить крыса ввести глубокой анестезии, обозначается замедление дыхания до половины своей первоначальной частоты.
- Удаление крысы из камеры для индукции. Inject 500 И.Ю гепарина на 100 г веса тела крыс в брюшине, с помощью шприца гепарина.
- Возвращение в его клетке крыса и позволяют его разбудить.
Примечание: Нет необходимости поддерживать стерильность во время шага 1.4. Подождите 20 минут перед переходом к следующему шагу. Неполные антикоагуляционную может привести к крови свертываясь, ведущих к микро инфарктов, которые могут существенно повлиять на качество и доходность изолированных cardiomyocytes.
2. сердце подготовка
- Положите 2 мл 100% изофлюрановая в камере индукции анестезии для грызунов. Передача 21 неделя старый ZFS-1 ожирением крыса от клетки к палате индукции. Разрешить крыса ввести глубокой анестезии, обозначается замедление дыхания до половины своей первоначальной частоты.
- Усыпить животных путем обезглавливания, с помощью гильотины для грызунов. Фиксировать конечностей крысы на поверхности пенополистирола. Поднимите и извлеките кожи, охватывающих мечевидного отростка с Ножницы хирургические. Откройте брюшины ниже грудной клетки с обеих сторон и разоблачить диафрагмы.
- Откройте диафрагмы, сделав надрез вдоль передней дуги с помощью тонкой ножницы. Вырежьте через ребра с обеих сторон вдоль linea mediaclavicularis ключицы кости, используя Ножницы хирургические, подвергать средостения в situ.
- Удаление легких в дистальные концы Хилы с тонкой ножницами. Вырежьте из тимуса подвергать аорты.
- Сожмите основание сердца с помощью щипцов и осторожно потяните к хвосту животного. Вырезать через аорту, сохраняя при этом тянуть на сердце, оставляя сегмент длиной 5 мм аорты прилагается к сердцу. Быстро перевести сердце в ледяной CB 50 мл на 50 мл стакан (рис. 2B).
Примечание: Во время действия 2,5-3,3, сердце является эффективно в условиях ишемии. Избегайте, превышающий в общей сложности 3 мин для этих шагов, чтобы не повредить кардиомиоцитов.
3. катетеризации
- Подождите приблизительно 10 s для сердца, чтобы остыть и захватить схватки. Перевести сердце в чашку Петри, содержащие 50 мл свежего, ледяной CB. Осторожно выньте жировой ткани вокруг аорты с помощью щипцов и ножницы.
- Вставьте на заказ канюли (же, как на шаге 1.2.3), который прилагается к 10 мл шприц, наполненный ледяной CB, 3 мм в аорту. Фиксировать аорты на канюли, связывая один из двух узлов катетеризации (рис. 3B) в отступ проксимальнее кончик канюли.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить аортального клапана, проникновение с канюли. - Осторожно промойте аорты с 5 мл ледяной CB с помощью шприца, придается канюли, до тех пор, пока кровь не более видимым в коронарных артериях. Мягко массаж левого предсердия, с помощью щипцов и вставляют оставшиеся 5 мл CB, позволяя для любой избыток крови удаляется из полости в чашке Петри.
- Связать второй узел катетеризации (шов: USP 3/0, шелк) в отступ дистальнее кончик канюли. Размонтируйте канюля с прилагаемой сердцем из шприца. Смонтируйте канюля с прилагаемой сердца Langendorff, с помощью соответствующего адаптера.
Примечание: Этот протокол использует повышенное давление в полости желудочков при перфузии на аппарате Langendorff. Для поддержания этого давления, избегая любой антероградная буфера утечки через аорту требуется узел Дополнительные катетеризации.
4. давление манипуляции и пищеварение
- Запустите насос перистальтический Langendorff аппарата для инициирования кровоснабжения сердечной ткани с PB. Галстук двойной зашитый узел (шов: USP 3/0, шелк) вокруг основания сердца, исключая аорты. Повторите этот шаг, пока инфляция правого и левого предсердия, а также заметил коронарного синуса.
- Прокол атриум с Бабочка иглы устройства контроля давления (рис. 3D) и позволяют Атриум выкачать. Манипулировать внутрипросветная давлении предсердия, регулируя высота бабочка шланга. Держите Атриум, слегка завышены в остальной части процедуры; контролировать и корректировать.
Примечание: Этот шаг необходимо выполнить быстро, как длительное инфляции левого предсердия приведет к смерть cardiomyocyte. - Измерьте приблизительный температуры левого предсердия, поместив датчик температуры между левое предсердие и левого желудочка. Отрегулируйте температуру Langendorff Отопление модуль соответственно, ориентации Ориентировочная температура 37 ° C из левого предсердия.
- Perfuse сердце с PB в общей сложности 3 мин.
- Переключитесь пищеварение буфер (дБ) для примерно 14 – 18 мин перфузии.
Примечание: Пищеварение завершается, когда левого предсердий структура разрушается и ткань приобретает молочно текстуру. - Щепотка атриум с помощью щипцов и принять небольшое тянуть. Удаление левого предсердия, тонкой ножницами и передачи атриум в большой массой лодку, содержащий 2 мл остановки буфера (SB), полностью погружаясь в ткани.
- Уничтожить оставшиеся сердечной ткани после руководящими принципами лаборатории, где выполняется процедура.
5. ячейка обработки и повторной адаптации кальция
- Фарш предсердную ткань на мелкие кусочки примерно 2 мм х 2 мм с помощью тонкой ножницы.
- Разогнать ткани мягкий всасывания и выброс куски ткани, с помощью передачи пипетки. Продолжите эту процедуру примерно 5 минут, до тех пор, пока макроскопических диссоциации ткани можно наблюдать.
Примечание: Избежать воздушных пузырей во время этого шага, как разоблачение клетки воздуха приведет к смерть cardiomyocyte. - Передать клетки 15 мл Конические трубки. Разрешить куски ткани соглашаться на 30 s. передачи супернатант в еще 15 мл Конические трубки. Позволяют клеткам соглашаться на 15 мин.
- Снимите и выбросьте супернатант. Добавить 2 мл 1 шаг буфера (см. таблицу 1). Разрешить кардиомиоцитов соглашаться на 10 мин.
Примечание: Удаленные супернатант также включает в себя фибробластов и эндотелиальных клеток. Пожалуйста, обратитесь к другим протоколам, если желательно использовать эти клетки для экспериментов14,23. Пелле будет содержать основном предсердий кардиомиоцитов, который может быть подтвержден световой микроскопии. Микроскопические характеристики предсердий кардиомиоцитов, обсуждаются в шаге 6.1. - Снимите и выбросьте супернатант. Добавьте 2 мл буфера шаг 2. Разрешить кардиомиоцитов соглашаться на 10 мин.
- Снимите и выбросьте супернатант. Добавьте 2 мл буфера шаг 3. Разрешить кардиомиоцитов соглашаться на 10 мин.
- Снимите и выбросьте супернатант. 250 мкл из нормальных Tyrode (NT), содержащие 1 мм Ca2 +.
- Передача 50 мкл нормальной Tyrode, содержащих предсердий кардиомиоцитов на стекло дно блюдо, который был с 25% Ламинин покрытием (и разрешено сухой заранее). Разрешить кардиомиоцитов соглашаться на 10 мин.
- Заполните стекло дно блюдо с 500 мкл NT, содержащие 1 мм2CaCl.
6. Функциональная оценка возбуждения сужение муфта
- Оцените морфологию клеток и жизнеспособности под микроскопом света, с использованием 20 крат (рис. 4A и 4B). Случайным образом выбрать примерно 100 клеток и классифицировать их как жизнеспособной или нежизнеспособными с целью оценить жизнеспособность процедуры изоляции клеток.
Примечание: Жизнеспособные клетки характеризуются симметричный Саркомер структуры, отсутствие шелесту мембраны и форму стержня. -
Тензометрические силоизмерители с Ca2 +-чувствительных Люминесцентную краску в течение 20 минут завершения Шаг 5.9.
- Добавить 10 мкм Fluo4-AM до 500 мкл NT. удалить супернатант из стекло дно блюдо (из шага 5.9). Добавьте NT, содержащие Fluo4-AM на стекло дно блюдо. Инкубируйте смесь для 20 мин при комнатной температуре. Снимите и выбросьте супернатант. Помойте образец 2 x с использованием 500 мкл NT.
-
Визуализировать Ca2 +-возбуждения с Конфокальный микроскоп следующим образом.
- Стекло дно блюдо передать конфокального микроскопа и визуализировать Ca2 +-возбуждения с Конфокальный микроскоп (лазерной интенсивности на 5,8%, возбуждения на 488 нм, выбросы на 515 нм) с использованием 40 кратном.
- Perfuse клетки с NT, подогретой до 37 ° C, с помощью соответствующих superfusion устройства. Кроме того согреться клетки с помощью микроскопа монтируется тепла инкубатора.
- Стимулировать кардиомиоцитов в электрическое поле с коммерчески доступных, Микроскоп монтируется стимулятор электродов на частотой 1 Гц и электрического тока 24 A. ожидания за 1 мин, чтобы позволить клеток для достижения устойчивого состояния Ca2 + обработки.
- Поместите линию сканирования параллельно поперечной оси, на полпути между ядром и краем случайно выбранных, макроскопически Договаривающихся клеток. Приобрести линии сканирования изображения путем повторного сканирования.
- Используйте свободно доступных изображений программное обеспечение для оценки интенсивности сигнала непосредственно перед электрической стимуляции (0F) через всю ячейку. Участок интенсивности сигнала через всю ячейку в течение цикла 1 стимуляции (F). Разделите (F) (F0) для получения соответствующих Ca2 + переходных.
Рисунок 1: упрощенная схема процедуры изоляции. Процедура является весьма критичный по времени до завершения ферментативного пищеварения миоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: подготовка оборудования до изоляции. (A) Эта группа показывает самодельные аппараты Langendorff: (1) с рубашкой реакционный сосуд с PB; (2 с рубашкой реакционный сосуд с CB; (3 3-ходовой кран; (4) шприц; (5 Перистальтический насос; (6 Отопление погружения; (7 с рубашкой Пузырь ловушки; и (8) канюли и сердце. (B) Эта группа показывает настройки для катетеризации и органа обрезания для оптимизированного рабочего потока: (1) 100 мл стакан с 50 мл ледяной CB; (2) 10 мл шприц с ледяной CB; (3) Петри блюдо с ледяной CB; (4) источника света; (5 по заказу канюля с катетеризации узел (см. также Рисунок 3A и 3B); (6) штраф, изогнутый пинцет; (7) ткани щипцами; (8) штраф щипцы, под углом 45°; (9) брюшной Ножницы хирургические; (10) штраф Ножницы хирургические; (11) 4 x 30 G иглы; и (12) 15 G иглы. (C) Эта группа показывает Микроскоп монтируется оборудование для конфокальная томография: (1) электрическим стимулятором электроды; (2) superfusion перо; (3) стекло дно блюдо с платежных терминалов; и (4) Электроды погружены Платиновый электрическим стимулятором. (D) Эта группа показывает set-up микроскоп для конфокальная томография: (1) Конфокальный микроскоп; (2) superfusion перо; (3) superfusion буфера водохранилище; (4 Регулятор superfusion потока; (5 superfusion, Отопление модуль; (6) компьютером; и (7) электрическим стимулятором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: заказное оборудование. (A) Эта панель показывает манипулировать 15 G канюля с замком Luer. Стрелки указывают два углубления для катетеризации узлов. (B) это катетеризации сучки, два двойной knots сверху укладывают поверх друг друга для быстрого затягивания. Стрелки указывают, где и в котором порядок узел необходимо ужесточить. (C) Эта группа показывает устройство управления собраны давления. Бабочка иглой 21 G подключен в зажим штатива. Шланг хранится на той же высоте, как иглы. Открыт завинчивающейся крышкой. Высота шланг бабочки могут быть изменены как указано стрелками для того чтобы изменить давление внутрипросветная левого предсердия. (D) слева Атриум проколов с устройством контроля давления. Эта картина показывает идеально завышенные левого предсердия. Эллипс знаменует размещение зашитый узел. (E) слева Атриум проколов с устройством контроля давления. Эта картина показывает чрезмерно завышенные левого предсердия, которая приведет к снижению урожайности жизнеспособных мах. Эллипс знаменует размещение зашитый узел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В 21 недель возраста 60 – 90% жизнеспособных Мах (оценивается как описано в шаге 6.1), после реадаптации кальция (шаг 5.4 – 5,7), могут быть изолированы от ЗСФ-1 ожирением крыс этим методом (рис. 4A). В организме крыс мах характеризуются различные и более однородным фенотип, по сравнению с VCMs24,25. Рисунок 4B показывает отдельные ACM с сохранившимися мембраны и Саркомер структурой, оба сильные показатели функционально неотъемлемой ячейки.
Приобретенных платежных терминалов могут быть обработаны в различных способами. Как свидетельствует на рисунке 5, клетки могут быть загружены с флуоресцентными красителями, используется для изучения морфологии и/или функции. Например ди-8-ANEPPS был использован для описания трубчатые системы в камеру предсердий крыса (Рисунок 5A). В другой набор экспериментов митохондрии окрашивание далеко красной флуоресцентной краски (например, mitotracker красный-FM) применяется для выявления цитозольной митохондрии (Рисунок 5B) предсердий ремоделирования. Как показано на рис. 5 c, платежных терминалов, изолированные с этот протокол также подходят для клеток Ca2 + изображений и показать нетронутыми возбуждения сокращение муфты с частотой 1 Гц поле стимуляции. Все изображения могут использоваться для дальнейшего анализа с использованием различных алгоритмов, доступных для исследователь6,7 (рис. 5 d).
Рисунок 4: соответствующих доходность жизнеспособные, одноклеточных идёт (A) Эта группа показывает доходность изоляции после реадаптации мах до 1 мм Ca2 + в NT. (B) Эта группа показывает изолированные, одноклеточных предсердий cardiomyocyte. Хорошо видны Саркомер структура, клеточной мембраны и ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Окрашивание крыса мах с флуоресцентными красителями. (A) группа показывает окрашивание мембраны клетки и трубчатых сети с флуоресцентной краской Di8ANNEPS. (B) этой группы показывает, окрашивание митохондрии с Люминесцентная краска mitotracker красный-FM. (C) Эта группа показывает поперечные линии сканирования Ca2 +-возбуждения с Люминесцентную краску Fluo4-AM на одну ячейку. Стрелки указывают электростимуляции, проведенных на 1 Гц. (D) группа показывает longitudenal Ca2 + транзиентов, производных от panel C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы впервые описал протокол для изоляции одноклеточных Мах от мышиной модели связанных с Мец HFpEF, показывающий отмечен предсердий ремоделирования22. Процедура является уникально сложной, как излишней жировой ткани может сделать хирургической подготовки, а также катетеризации аорты, все труднее. Руководство по устранению неполадок приведены в таблице 2 адреса наиболее распространенные вопросы о процедуре изоляции.
| Проблема | Возможная причина | Решение |
| Нет потока через шланг бабочка | Неправильное закрытие аорты с сучками катетеризации | Удаление жировой ткани перед затягиванием |
| Добавить 3 катетеризации узел с соответствующих отступов | ||
| Вытащить узел с рукой для увеличения силы | ||
| Заблокированные игла | Скорректировать позицию в просвет | |
| Разблокировать нежный тянуть с шприц | ||
| Правое предсердие / коронарного синуса не завышены | Неправильное закрытие базы сердца | Блок потока с дополнительных узлов |
| Правое предсердие, поврежденных во время подготовки | Закройте утечки с клипы/узлов | |
| Плохое пищеварение / Атриум не смягчают | Снижение ферментативной активности через неправильно температуры | Отрегулируйте температуру до 37 ° C |
| Неактивный/деградации фермента | Заменить | |
| Старые чрезмерно фиброзных Атриум | Увеличить время пищеварения (с шагом + 50%) | |
| Поврежденные аортального клапана | Неглубокие проникновения при катетеризации | |
| Бедные клеток доходность | Чрезмерно переваривается Атриум | Уменьшить время пищеварения (с шагом + 25%) |
| Уменьшить давление внутрипросветная путем снижения бабочка шланг | ||
| Атриум усваивается | Увеличить время пищеварения (с шагом 25%) | |
| Увеличение давления внутрипросветная путем повышения бабочка шланг | ||
| Клетки дисперсия слишком агрессивным | Быть более нежным |
Таблица 2: руководство по устранению неполадок. Эта таблица показывает общие вопросы процедуры изоляции и их соответствующих решений.
В недавнем исследовании мы показали, что ожирением крысы модель ZFS-1 экспонатов, обширные предсердий ремоделирования с увеличенный размер предсердий22. Увеличение левого предсердий размер был признан важным прогностическим маркера для диастолическая дисфункция26 и вызывает rarefication микрососудистых судов по отношению к ткани. Это приводит к снижению распределению пищеварительной буфера путем ретроградного перфузии аорты во время процедуры изоляции, оказание одной ячейки изоляции в этой модели особенно сложной. Другие отличительной особенности предсердий Ремоделирование, предсердная фиброз и увеличение фиброз было показано для крыс ZDF — крыса модель для метаболических диабета и один из родителей штамм ZFS1 крысы27. Коллаген месторождений ухудшить эффективность пищеварительных ферментов, чтобы освободить кардиомиоцитов из внеклеточного матрикса и, таким образом, требует дополнительных настроек, процедура изоляции клеток28.
Механизм, по которому устройство давления облегчает результаты улучшения изоляции в этой модели предсердий ремоделирования является скорее связанных с локализованной затухания коронарного кровотока левого предсердия. Одним из основных компонентов коронарного кровотока является коронарной перфузии давление, которое определяется как градиент между давлением коронарной артерии и конечного диастолического давления в соответствующих полости29. Во время описанной процедуры блокировки сердце базы приводит к глобальным увеличением коронарной артерии давление и внутрипросветная во всем сердцем. Последующее пункции левого предсердия облегчает местные, селективный капля внутрипросветная давления в полости левого предсердий. Таким образом не только большой коронарной перфузии градиент давления устанавливается, но объем перфузии увеличивается также переадресованные пищеварение раствором из перегруженных левого желудочка в левое предсердие.
Кроме того, выбор ферменты пищеварения имеет решающее значение для изоляции ACM: очищенный смеси фермент коллагеназа, по сравнению с менее целенаправленной и менее чистый ферментов как коллагеназ30показали I и II. Этот фермент не только предусматривают более высокую доходность морфологически и функционально нетронутым кардиомиоцитов, но также сводит к минимуму любые слипания одиночных клеток после их изоляции31. Очищенный фермента смесей коллагеназ с дополнительные высокой dispase или среднего thermolysin содержание наиболее часто используются для изоляции cardiomyocyte крыса. В то время как VCMs, лучше всего изолированы в более высоких концентрациях, лучшие результаты миоцитах предсердий были приобретены с концентрацией 0.195 Wünsch единиц/мл с помощью этого протокола32.
Как растет распространенность связанных с Мец HFpEF2 и предсердий кардиомиопатии, ведущих к предсердий ремоделирования и мерцательной аритмией клинически весьма актуальны, исследования в этой области представляет ключевой интерес. Много новых животных моделей для HFpEF появляются34 33,и предсердий, Ремоделирование соответствует увеличение случаев нарушений ритма предсердий отличительной особенности заболевания. Описан метод позволяет исследователям изолировать жизнеспособных одного кардиомиоцитов из крыса моделей с предсердной реконструкции для дальнейшего изучения с исключительно высокой урожайности и сохранены механических и электрических функций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано DZHK (Немецкий центр исследования сердечно-сосудистой системы, д.б.), EKFS (остальное-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.) и BMBF (Немецкий Министерство образования и научных исследований), а также финансируемые программы клинических ученый Биг-Шарите по Charité - этот Берлин и Берлин институт здравоохранения (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
