Summary
For at teste de hæmmende virkninger af farmakologiske stoffer på fosfolipase C (PLC) i forskellige regioner af hjernen, honningbien, præsenterer vi en biokemisk analyse for at måle PLC aktivitet i disse regioner. Denne analyse kan være nyttigt for sammenligne PLC aktivitet blandt væv, og blandt bier udstiller forskellige funktionsmåder.
Abstract
Honningbien er en model organisme til evaluering af komplekse adfærd og højere hjernefunktion, såsom indlæring, hukommelse og arbejdsdeling. Champignon kroppen (MB) er en højere hjernen center foreslået at være neurale underlaget af komplekse honningbien adfærd. Selv om tidligere undersøgelser identificeret gener og proteiner, der angives varierende i MBs og andre områder af hjernen, er aktiviteter af proteiner i hver region endnu ikke fuldt forstået. For at afsløre funktionerne af disse proteiner i hjernen, farmakologiske analyse er en realistisk tilgang, men det er nødvendigt først at bekræfte, at farmakologiske manipulationer faktisk ændre protein aktivitet i disse områder af hjernen.
Vi tidligere identificerede et højere udtryk af gener kodning fosfolipase C (PLC) i MBs end i andre områder af hjernen, og vurderet farmakologisk inddragelse af PLC i honningbien adfærd. I denne undersøgelse, vi biokemisk testet to farmakologiske agenter og bekræftet, at de faldt PLC aktivitet i MBs og andre områder af hjernen. Vi præsenterer her, en detaljeret beskrivelse af hvordan man kan opdage PLC aktivitet i honningbien hjernen homogenatet. I denne analyse system, homogeniseret stammer fra forskellige hjerneregioner er reageret med et syntetisk fluorogenic substrat, og fluorescens som følge af PLC aktivitet er kvantificeret og sammenlignet mellem hjerneregioner. Vi har også beskrive vores vurdering af de hæmmende virkninger af visse stoffer på PLC aktivitet ved hjælp af det samme system. Selv om dette system er sandsynligvis påvirket af andre endogene fluorescens forbindelser og/eller absorptionen af assay komponenter og væv, måling af PLC aktivitet ved hjælp af dette system er sikrere og lettere end at bruge den traditionelle analyse, som kræver radiolabeled substrater. Enkel procedure og manipulationer tillade os at undersøge PLC aktivitet i hjernen og andre væv af honningbier involveret i forskellige sociale opgaver.
Introduction
Den europæiske honningbi (Apis mellifera L.) er en eusocial insekt, og kvindelige bier Vis kaste-afhængige reproduktion og alder afhængige arbejdsdeling. For eksempel, i den sterile kaste af bier omtales som «arbejdstagere», feed yngre individer yngel mens ældre fouragere nektar og pollen udenfor hive1. Indlæring og hukommelse evne er kritisk vigtigt i livet af honningbi, fordi foragers skal gentagne gange går frem og tilbage mellem fødekilder og deres rede og derefter kommunikere placeringen af gode mad kilder til deres nestmates gennem dans meddelelse1. Tidligere undersøgelser viste, at MB, en højere hjernen center i insekter, er involveret i indlæring og hukommelse evne til honningbien2,3,4. Varierende udtrykte gener og proteiner er blevet identificeret i forskellige områder af hjernen af honningbi5,6,7,8,9,10 ,11, tyder på, at de er relateret til de unikke funktioner i hvert område af hjernen. Selv om farmakologisk hæmning eller aktivering af et protein af interesse er en godt brugt tilgang til at afsløre funktionen af protein i honningbien adfærd12,13,14, er det uvist, om alle narkotika har funktionelle virkninger i forskellige regioner af hjernen, honningbien. Validering af funktioner af sådanne lægemidler vil styrke konklusioner i undersøgelser af adfærdsmæssige farmakologi.
Her fokuserer vi på PLC, en af de enzymer, der er impliceret i mus kognition15,16,17,18. PLC udløser calcium signalering af nedværdigende phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) til inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 åbner IP3 receptorer på det endoplasmatiske reticulum (ER), fører til frigivelse af calciumioner fra Skadestuen. Den frigivne calcium aktiverer både calcium/calmodulin-afhængige protein kinase II (CaMKII) med calmodulin og protein kinase C (PKC) i DAG. Begge protein kinaser er involveret i indlæring og hukommelse22,23, overensstemmelse med PLC inddrages i denne proces. PLC'er er kategoriseret i undertyper, herunder PLCβ, PLCγ og PLCε, baseret på deres strukturer20. Hver PLC subtype er aktiveret i en anden sammenhæng20, og gener kodning disse undertyper angives varierende i forskellige væv. Vi tidligere har vist, at honningbien MBs express gener kodning PLCβ og PLCε undertyper på højere niveauer end de resterende hjerne regioner24, og at to pan-PLC hæmmere (edelfosine og neomycin sulfat [neomycin]) fald PLC aktivitet i forskellige hjernen regioner og faktisk påvirke indlæring og hukommelse evne til honningbien24.
Traditionelt, er den enzymatiske aktivitet af PLC blevet målt ved hjælp af radiolabeled PIP225, der kræver passende uddannelse, udstyr og faciliteter. For nylig, et syntetisk fluorogenic substrat af PLC har været etableret26, hvilket gør det nemt at vurdere PLC aktivitet i standard laboratoriet. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol til at registrere PLC aktivitet i forskellige hjerneregioner af honningbien ved hjælp af fluorogenic substrat og efterfølgende afprøve de hæmmende virkninger af edelfosine og neomycin på PLC i disse væv. Da protokollen kræver kun grundlæggende manipulationer, kan det anvendes til undersøgelser af PLC aktivitet i andre væv eller områder i hjernen i bier tildeles forskellige sociale opgaver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fange fouragering honningbier
- Køb honningbi kolonier fra en lokal forhandler.
- Ved hjælp af et insekt net, fange forager bier, som vender tilbage til bikuben med pollen tasker på deres bagben. Overføre bierne til en standard 50 mL konisk plastikrør og cap røret (figur 1). Lægge røret på is til bedøver bierne.
Bemærk: Bære de udpegede for biavl at undgå bistik. Sygepleje bier kan også afhentes afhængigt af eksperimentet. At fange den sygeplejerske bier, observere biens adfærd på voks kam og fange sygeplejerske bier, som stikker hovedet ind i yngel celler til at fodre larverne af wing eller brystkasse med pincet. Derefter placere bierne i en 50 mL plastikrør, cap røret og sætte det på isen som nævnt i trin 1.2. - Fange 12 foragers tilfældigt.
Bemærk: Denne protokol bruger to bier pr. parti, hvilket resulterer i seks masser. Flere bier kan blive fanget i et rør, og antallet af bier i et enkelt rør er ikke vigtigt, som bierne i hvert parti er kombineret senere (Se trin 3.1.1). Holde rør cool om sommeren, som den høje temperatur i røret skader bierne.
2. dissektion af honningbi hjernen
- I laboratoriet, 50 mL røret anbringes i isbad i mindst 30 min.6 til bedøver bierne.
- For at forberede dissektion fase, fold et stykke af dental voks i halvdelen (den resulterende størrelse er ca. 3,5 x 7,5 cm) og skubbe det ind i en plastik skål (60 x 15 mm).
Bemærk: Den foldede voks fast holder de insekt pins. - Under en kikkert mikroskop, adskille biens hoved fra sin krop med en pincet og ordne det på dental voks ved at indsætte insekt pins i bunden af hver antenne for at holde det forreste af hovedet i en opadgående position (figur 2A).
Bemærk: Vask pincet før brug, ved hjælp af ethanol eller steriliseret vand. - Hæld nok saltopløsning (0,13 mol/L NaCl, 5 mmol/L KCl og 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) på hovedet for at dække det. Gennembore hovedet igen med benene, hvis hovedet flyder i løsningen. Brug en iskold saltopløsning, hvis nødvendigt.
Bemærk: Dog denne protokol fungerer uden den kolde saltopløsning. - Fjerne antenner med pincet (figur 2B).
- Gøre et vandret snit i nærheden af baserne af antenner, og på langs på grænsen af de sammensatte øjne, ved hjælp af en skalpel. Gør derefter et vandret snit i toppen af hovedet. Fjerne neglebånd for at åbne et vindue over hjernen (figur 2C).
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, vaske skalpel med ethanol eller steriliseret vand før brug. - Fjerne retinae fra ocelli og tracheae på den forreste overflade af hjerne, ved hjælp af pincet (figur 2D).
- Udvid snit på grænsen af de sammensatte øjne dorsalt og ventrally, ved hjælp af skalpel (figur 2E). Dernæst skal fjerne bindevæv mellem neglebånd af sammensatte øjne og retinae ved at indsætte pincet direkte under øjet neglebånd (figur 2F).
- Kassér neglebånd af sammensatte øjne. Vælge de dorsale tips af retinae af sammensatte øjne med en pincet og flytte pincet i den ventrale retning til omhyggeligt skrælle retinae (fig. 2G).
- Fjern forsigtigt de resterende tracheae på den forreste overflade af hjerne, ved hjælp af pincet (figur 2H).
- Skære bindevæv mellem hjernen og omkring væv, ved hjælp af pincet, og dissekere hjernen fra hoved kapslen (figur 2H).
- Skrælle tracheae på posterior overfladen af hjernen, ved hjælp af pincet (figur 2jeg).
- Ved hjælp af en skalpel skæres forbindelsen mellem MBs og andre områder af hjernen ved siden af de lodrette fliger, som er en del af MBs (figur 2J).
- Sted dissekeret MBs og resterende hjernen væv i 1,5 mL rør og hurtigt fryse dem med tøris eller flydende nitrogen (figur 2K). Gemme de frosne væv ved-80 ° C indtil brug.
Bemærk: Håndtere flydende kvælstof med udpegede handsker og ventilation til at undgå kold brænde og kvælning. Tøris bør også håndteres omhyggeligt med handsker. Protokollen kan være midlertidigt her. Dissektion og opbevaring af hjernen væv skal være udført én bee ad gangen for at undgå protein nedbrydning.
3. forberedelse af hjernen homogeniseret
- Tilsæt 10 µL homogenisering buffer bestående af 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, og 1,0 mmol/L CaCl2 til den frosne hjernen væv og homogeniseres væv i 1,5 mL tube af manuelt anvende pres med en plastik pistil. Slagtilfælde væv mindst 200 x.
Bemærk: Udføre manipulationer beskrevet i afsnit 3 på is. Bruge en pistil passer lige i røret til tilstrækkeligt smadre væv, som let flyde i homogenisering buffer.- Oploesningen homogeniseret væv bruges til den næste væv i partiet og homogeniseres vævet på samme måde.
Bemærk: Honningbier i hvert parti er kombineret på dette trin. Denne protokol bruger seks masser.
- Oploesningen homogeniseret væv bruges til den næste væv i partiet og homogeniseres vævet på samme måde.
- Tilføj 30 µL af homogenisering buffer.
- Centrifugeres homogeniseret væv prøven for 10 min. ved ca 900 x g27 og 4 ° C.
- Overføre supernatanten til en ny 1,5 mL tube og centrifugeres det igen i 20 min ved ca 9.500 x g27 og 4 ° C.
- Placer supernatanten i en ny 1,5 mL tube. Gemme homogenatet på-20 ° C indtil brug.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Bestemme proteinkoncentration ved hjælp af bicinchoninic syre (BCA) assay.
- Fortynd 2,5 µL af homogenatet med 17,5 µL steriliseret vand (dermed fortynding af homogenatet otte) og bruge alle den fortyndede homogenatet.
Bemærk: Prøvetagning homogenatet ved hjælp af en mikropipette skal udføres omhyggeligt på grund af sin høje viskositet. - Udføre BCA analysen bruger 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 og 2,0 mg/mL af bovint serumalbumin (BSA) i 20 µL som standarder.
Bemærk: Ændre omfanget af BCA assay som nødvendigt, baseret på mængden af homogenatet og standardprøverne. Protokollen kan være midlertidigt her.
- Fortynd 2,5 µL af homogenatet med 17,5 µL steriliseret vand (dermed fortynding af homogenatet otte) og bruge alle den fortyndede homogenatet.
4. PLC reaktion i hjernen homogeniseret
- Forberede stamopløsningen af fluorogenic substrat WH-1526 opløst i steriliseret vand ved 50 µmol/L og opbevar den ved-80 ° C.
Bemærk: Dække opløsninger indeholdende substrat med folie for at forhindre falmning. - Forberede reaktion forblandingen i den krævede mængde at opnå følgende sammensætning i 10 µL af reaktionsblandingen: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, 1,0 mmol/L CaCl2, 2,0 mmol/L dithiothreitol, 50 mg/L BSA og 12,5 µmol/L WH-15.
- Fortynd homogenatet med homogenisering buffer, hvis det kræves.
- Bland reaktion forblandingen og homogenatet indeholder 1,3 µg af proteiner i en polymerase kædereaktion (PCR) rør til at opnå en endelige mængden af 10 µL af reaktionsblandingen.
- Forberede den statistiske analyse to typer af kontrol blandinger: sætte den homogenatet men ikke WH-15 i blandingen (kontrol blanding 1), og vice versa (kontrol blanding 2).
Bemærk: Forberede reaktion blandinger og kontrol blandinger på isen for at forhindre protein nedbrydnings- og reaktionsprodukter af PLC. Kontrol blandinger 1 og 2 anvendes til at opdage fluorescens fra homogenatet og gratis substrat, henholdsvis.
- Forberede den statistiske analyse to typer af kontrol blandinger: sætte den homogenatet men ikke WH-15 i blandingen (kontrol blanding 1), og vice versa (kontrol blanding 2).
- Skyl glasset og inkuberes i en termisk cycler i 30 min. ved 25 ° C.
- Reaktionen standses ved at tilføje 2 µL af 25 mmol/L ethylenglycol bis (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic syre.
Bemærk: Passende protein beløb og reaktionstider varierer blandt eksperimenter. Således, for at optimere reaktion tilstand, kan det være nødvendigt at gentage procedurerne i trin 4.1-5,3 i de indledende forsøg ved at ændre protein beløb og inkubering tid indtil fluorescens stiger lineært. For reference, når homogenatet stammer fra de andre områder af hjernen er brugt, reaktionen virker som regel lineært med 1,3 µg eller mindre af proteiner i 30 min, men lineariteten falder med mindst 2,7 µg af proteiner eller med en inkubationstiden 90 min. eller lo nger.
5. afsløring af fluorescens som følge af PLC aktivitet
- Der centrifugeres reaktionsblandingen og kontrol blandinger i 5 min på cirka 310 x g28 og overføre 10 µL af supernatanten til forskellige brønde på en 384-godt mikrotiterplade anvendes til påvisning af fluorescens.
Bemærk: For at forhindre falmning og en forurening med støv, dække pladen med folie. - Skyl mikrotiterplade ved hjælp af en centrifuge for mikrotiterplade.
- Sæt pladen i en mikrotiterplade læser og opdage fluorescens med en teknisk tre eksemplarer.
Bemærk: Excitations- og bølgelængder er 344 nm og 530 nm, henholdsvis. Hvis det er relevant (afhængigt af mikrotiterplade læseren), bland prøven blandinger for 5 s før hver registrering. Protokollen kan blive stoppet her.
6. test af den hæmmende virkning af farmakologiske stoffer
- Forberede stamopløsninger af edelfosine og neomycin ved de relevante koncentrationer og gemme dem indtil brug: edelfosine på 5,0 mmol/L og -20 ° C; neomycin på 550 mmol/L og 4 ° C.
- Når du forbereder reaktion forblandingen som beskrevet i trin 4.2., tilføje hæmmere til forblandingen at opnå de relevante endelige koncentrationer: edelfosine, 1,0 mmol/L; neomycin, 0,55 mmol/L.
- Tilføje en homogenatet til reaktion forblandingen og passende kontrol blandinger som i trin 4.4.
- Forberede tre typer af kontrol blandinger: sætte homogenatet og hæmmer, men ikke underlaget i kontrol blandingen 1; Tilføj substrat og inhibitor men ikke homogenatet i kontrol blandingen 2; og sætte inhibitoren, men ikke homogenatet eller substrat i kontrol blanding 3.
- Udføre PLC reaktion og afsløring af fluorescens som beskrevet i trin 4.5-5.3.
7. statistisk analyse
- Til påvisning af PLC aktivitet ved hjælp af de blandinger, der er beskrevet i afsnit 4, beregne fluorescens stammer fra reaktion mellem PLC og underlaget ved at trække fluorescens udledes fra homogenatet eller gratis substrat som følger.
Fl (PLC aktivitet) = Fl (reaktionen mix) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
Bemærk: Fl (PLC aktivitet), Fl (mastermix), Fl (ctrl 1) og Fl (ctrl 2) betegne Bonafide fluorescens stammer fra PLC aktivitet, fluorescens opdaget i reaktionsblandingen og kontrol blandinger 1 og 2, henholdsvis.- Efter måling af fluorescens i blandinger som beskrevet i trin 4.1-5.3, beregne Fl (PLC aktivitet) efter ligningen i trin 7.1, og derefter gennemsnitlige Fl (PLC aktivitet) af den tekniske tre eksemplarer for hver homogenatet.
- Ved hjælp af den gennemsnitlige Fl (PLC aktivitet) af den tekniske tre eksemplarer fremstillet i trin 7.1.1, beregne igen den gennemsnitlige Fl (PLC aktivitet) af biologiske replikater af MBs og andre områder af hjernen og sammenligne værdier mellem hjernens væv.
- Undersøgelse af PLC aktivitet i nærværelse af inhibitorer ved hjælp af de blandinger, der er beskrevet i afsnit 6, beregne fluorescens stammer fra reaktion mellem homogenatet, substrat og inhibitor som følger.
Fl (PLC aktivitet med hæmmer) = Fl (reaktionen mix) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)
Bemærk: Her, Fl (PLC aktivitet med hæmmer) er Bonafide fluorescens som følge af PLC aktivitet i nærværelse af inhibitoren. Fl (mastermix), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) og Fl (ctrl 3) er fluorescens signaler registreret i reaktionsblandingen, kontrol blanding 1, styre blanding 2 og kontrol blanding 3, henholdsvis.- Efter måling af fluorescens i blandinger som beskrevet i trin 6.1-6.4, beregne Fl (PLC aktivitet med hæmmer) efter ligning i trin 7.2. Derefter få den gennemsnitlige Fl (PLC aktivitet med hæmmer) af den tekniske tre eksemplarer for hver homogenatet.
- Ved hjælp af den gennemsnitlige værdi beregnet i trin 7.2.1, beregne den gennemsnitlige Fl (PLC aktivitet med hæmmer) af biologiske replikater stammer fra hver hjernevæv. Sammenlign Fl (PLC aktivitet med hæmmer) og Fl (PLC aktivitet) opnåede i trin 7.1.2 i hver hjernevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein koncentrationer i hjernen homogeniseret:
Vi forberedt homogeniseret ved hjælp af forager bier. De beregnede protein koncentrationer i den oprindelige homogenater er vist i figur 3. De omtrentlige protein koncentrationer i de oprindelige homogenatet blev som følger: 1,5 mg/mL i MBs og 2,3 mg/mL i andre områder af hjernen. Vi brugte to bier pr. parti og seks partier blev analyseret.
Påvisning af PLC aktivitet i hjernen homogeniseret:
I pilotprojekt opdaget vi højere fluorescens i andre områder af hjernen end i MBs. Derfor, vi gentog de foreløbige eksperimenter ved hjælp af homogenatet af de andre områder af hjernen og beslutsom reaktion tid (dvs., 30 min) og protein beløb (dvs., 1,3 µg). Resultatet af reaktionen på disse betingelser er vist i figur 4A. Reaktion blandinger indeholdende både væv homogenatet og fluorogenic substrat udstillet > 4.2-fold højere fluorescens end kontrol blandinger indeholdende enten væv homogenatet eller fluorogenic substrat, tyder på, at PLC aktivitet var opdaget i reaktion blandinger. Relative fluorescens var ca 3.4-fold højere i andre områder af hjernen end i MBs (fig. 4B).
Analyse af de hæmmende virkninger af farmakologiske stoffer på PLC aktivitet:
For at undersøge virkningerne af den pan-PLC-hæmmere edelfosine og neomycin på PLC aktivitet, udført vi reaktion 1,0 mmol/L edelfosine eller 0,55 mmol/L neomycin, ved hjælp af den samme homogenatet, som analyseres over. I overværelse af edelfosine, Fluorescens er faldet til omkring 6,0% og 5,4% i MBs og andre områder af hjernen, henholdsvis i forhold til kontrol uden edelfosine (fig. 4C). Neomycin behandling reduceret fluorescens niveau til 44% og 20%, der af ubehandlet styrer i MBs og andre områder af hjernen, henholdsvis (figur 4D).
Figur 1 : Fanger en forager honningbien. En forager, vender tilbage til hendes hive blev fanget i et insekt net, og hun var begrænset til en 50 mL konisk plastikrør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skematisk fremstilling af proceduren dissektion. (A) akser af honningbi hjernen nævnt i protokollen er vist. Bee fra hovedet til den forreste thorax er set fra lateral siden. (B - K) Fotos og illustrationer af dissektion procedurer er vist. Se hovedteksten for detaljer. Kun hovedet af honningbien præsenteres. En illustration af tracheae er udeladt. MBs = champignon organer. Skala barer svarer til 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Protein koncentrationer i hjernen væv homogenater. Protein koncentrationer i de oprindelige homogenater blev målt af BCA assay og beregnet. De gennemsnitlige koncentrationer med standardafvigelser er vist. To forager bier blev brugt for hvert parti, og seks partier blev analyseret. MBs = champignon organer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Fluorescens opdaget i reaktioner. (A) dette panel viser fluorescens i hver enkelt væv med eller uden fluorogenic substrat. Reaktionen var udført i 30 min. ved hjælp af 1,3 µg af protein. Fluorescens blev målt af mikrotiterplade læseren. Værdierne for de prøve wells blev korrigeret af Tom brønde og vist i arbitrære enheder (AUs). (B) dette panel viser en sammenligning af fluorescens mellem hjernens væv. Data i panelet A blev korrigeret for kontrol blandinger af subtraktion og normaliseret af den beregnede fluorescens i MBs. * P < 0,005, Mann-Whitney U test. Paneler C og D viser relative fluorescens (C) 1,0 mmol/L edelfosine og (D) 0,55 mmol/L neomycin. De samme homogenater anvendes i paneler A og B blev analyseret. Fluorescens værdier var normaliseret af resultaterne af det kontrol eksperimentet uden narkotikabehandling for hver væv. Data kontrol reaktioner i panelet C er den samme som i panelet B. I panelet D, blev alle homogenater analyseret igen i et andet eksperiment. De gennemsnitlige fluorescens værdier med standardafvigelser er vist. To bier blev brugt for hvert parti, og seks partier blev analyseret. P < 0,05, Wilcoxon underskrevet rækker test. Ingen Hg = kontrol blanding ikke indeholder homogenatet; MBs = champignon organer. Paneler B - D blev ændret fra Suenami et al. 24 med udgiverens tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den biokemiske undersøgelse af protein aktivitet er dybt vigtigt for forståelsen af molekylære signalering i hjernen, fordi aktiviteten af et enzym, der påvirkes af forskellige molekyler, som substrater og hæmmere, og kan således ændre langs med dyrs adfærd (f.eks., indlæring og hukommelse)5. I honningbien undersøgelser, er enzymer som cyklisk AMP-afhængige protein kinase A, cyklisk GMP-afhængige protein kinase, PKC, fosforyleres CaMKII og adenylate cyclase rapporteret angives varierende i forskellige områder af hjernen baseret på Immunhistokemi5,10,29,30,31. Forskelle i enzymatisk aktivitet blandt områder af hjernen, er dog kun delvist rapporteret6. Her, beskrev vi en detaljeret protokol til påvisning af PLC aktivitet og vurdere de hæmmende virkninger af farmakologiske stoffer i MBs og andre områder af hjernen.
Der er nogle mulige faktorer forstyrrer fluorescens påvisning. For det første er det vigtigt at beskytte proteinet fra nedbrydning, når der udføres biokemiske assays. I protokollen beskrevet her, er en hurtig dissektion og indefrysning af hjernen påkrævet. Det anbefales at vævsprøver er frosset og gemt snart efter hver cyklus af dissektion. En minimering af den tø/fryse cyklus af homogenatet er også afgørende for at undgå forringelsen af proteinet.
Ud over protein nedbrydning, baggrund fluorescens og absorbans i reaktionsblandingen kan påvirke resultaterne i denne analyse system, fordi PLC aktivitet registreres af et fluorescens signal. For eksempel, har neomycin opløst i vand en gul farve, der påvirker fluorescens påvisning. Selv om vi brugte 0,55 mmol/L neomycin, en 1000-fold fortynding af stamopløsningen, kan en yderligere optimering af koncentrationen være påkrævet. Derudover kan kontaminering af andre væv også påvirke resultatet. Nethinden, som registrerer visuelle stimuli og indeholder pigmenter, består af en vævstype, der potentielt forstyrrer analysen.
Med denne protokol opdaget vi højere PLC aktivitet i andre områder af hjernen end i MBs24. Dette var i strid med resultatet af kvantitative reverse-transskription PCR analyse, som afslørede, at MBs express højere niveauer af PLC gener end andre hjernen væv24. Denne modsætning kan skyldes WH-15, som er en frit svævende substrat26, og det faktum, at vi ikke adskille membran og cytosole brøkdele af hjernen homogeniseret. I betragtning af at PLCβ og PLCε er membran-associerede enzymer32 og kan interagere med endogene PIP2 substrat, påvirker mængden af membran-fraktionen i homogenatet sandsynligvis reaktionen mellem PLC og WH-15. En anden mulig forklaring er, at PLC koncentration kan være højere i de andre hjerneregioner end i MBs på grund af forskelle i protein produktion og/eller nedbrydnings priser. Derfor, Bonafide PLC aktivitet i hjernen skal afklares yderligere af yderligere forsøg, som ved hjælp af en nylig rapporteret nye substrat indarbejdet i membranen33, analysere aktiviteten af membran-associerede og cytosole PLC'er separat, eller kvantificere indholdet af PLC'er eller PIP2 i hver hjernevæv.
Hensyntagen til ovenstående punkter, kan PLC assay systemet beskrevet her udvides til at måle PLC aktivitet i forskellige væv ikke vurderes her, såsom fordøjelseskanalen, muskel og reproduktionsorganer. Det er også muligt at sammenligne PLC aktivitet mellem hjerner af snittere og sygeplejerske bier til at evaluere inddragelse af PLC aktivitet i forskellige sociale roller.
Samlet set er assay systemet præsenteres her en mulighed for påvisning af PLC aktivitet i væv homogeniseret, fordi det kan udføres med almindeligt laboratorieudstyr, mens en traditionel tilgang ved hjælp af radiolabeled PIP2 kræver specialiseret faciliteter, uddannelse og udstyr til radioisotoper. At drage fordel af ordningen med yderligere ændringer vil uddybe vores forståelse af de molekylære mekanismer bag det honningbien komplekse adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Figur 4B - 4 D blev ændret fra Suenami et al. 24 med tilladelsen af biologi Open. Forfatterne er taknemmelig for, at udgiveren for tilladelsen. Dette arbejde blev støttet af Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) til Shota Suenami og Ryo Miyazaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
