Summary
Para probar los efectos inhibitorios de agentes farmacológicos en la fosfolipasa C (PLC) en las diferentes regiones del cerebro de la abeja, presentamos un ensayo bioquímico para medir la actividad de la PLC en esas regiones. Este análisis podrían ser útil para comparar la actividad de la PLC entre los tejidos, así como entre las abejas exhibe diferentes comportamientos.
Abstract
La abeja es un organismo modelo para la evaluación de conductas complejas y funciones cerebrales superiores, como el aprendizaje, la memoria y la división del trabajo. El cuerpo de la seta (MB) es un centro mayor de cerebro propuesto para ser el sustrato neural de los comportamientos complejos de la abeja. Aunque estudios previos identificaron genes y proteínas que se expresan diferencialmente en los MBs y otras regiones cerebrales, las actividades de las proteínas en cada región no son entiende todavía completamente. Para descubrir las funciones de estas proteínas en el cerebro, análisis farmacológico es un método factible, pero es necesario para confirmar que las manipulaciones farmacológicas de hecho alteran la actividad de la proteína en estas regiones del cerebro.
Había identificado previamente una mayor expresión de genes que codifican la fosfolipasa C (PLC) en los MBs que en otras regiones del cerebro y evaluar farmacológicamente la participación del PLC en el comportamiento de las abejas. En ese estudio bioquímico había probado a dos agentes farmacológicos y confirmó que disminuyeron actividad PLC en el MBs y otras regiones del cerebro. Aquí, presentamos una descripción detallada de cómo detectar actividad PLC en homogeneizado de cerebro de la abeja. En este sistema de ensayo, homogenados derivados de regiones diferentes del cerebro se reaccionaron con un substrato sintético fluorógenos y fluorescencia resultantes de la actividad de la PLC es cuantificada y comparada entre regiones del cerebro. También Describimos nuestra evaluación de los efectos inhibitorios de ciertos fármacos sobre la actividad PLC utilizando el mismo sistema. Aunque este sistema probablemente afectados por otros compuestos endógenos de la fluorescencia o la absorbancia de los componentes del ensayo y los tejidos, la medición de la actividad de la PLC utilizando este sistema es más seguro y más fácil que eso usando el análisis tradicional, que requiere sustratos radiactivos. El procedimiento simple y manipulaciones nos permiten examinar la actividad PLC en el cerebro y otros tejidos de las abejas participan en diversas tareas sociales.
Introduction
La abeja europea (Apis mellifera L.) es un insecto eusocial, y las abejas hembra reproducción de castas dependientes y dependientes de la edad de división del trabajo. Por ejemplo, en la casta estéril de las abejas conocido como 'trabajadores', individuos más jóvenes alimentan las crías mientras que los más viejos de forraje néctar y polen fuera de la colmena1. Aprendizaje y la memoria de capacidad es de vital importancia en la vida de la abeja, porque forrajeros deben ir repetidamente hacia adelante y hacia atrás entre las fuentes de alimento y su nido y luego comunicar la ubicación de fuentes de comida a su similar a través del baile comunicación1. Estudios previos demostraron que los MB, un centro cerebral mayor en insectos, está implicado en la capacidad de aprendizaje y la memoria de la abeja2,3,4. Genes diferencialmente expresados y las proteínas se han identificado en varias regiones del cerebro de la abeja5,6,7,8,9,10 ,11, sugiriendo que están relacionados con las funciones únicas de cada región del cerebro. Aunque la inhibición farmacológica o activación de una proteína de interés es un método usado para revelar la función de la proteína en el comportamiento de las abejas12,13,14, no se sabe si todos los medicamentos tener efectos funcionales en diferentes regiones del cerebro de la abeja. La validación de las funciones de tales drogas fortalecerá conclusiones en estudios de farmacología conductual.
Aquí, nos centramos en PLC, una de las enzimas implicadas en el ratón cognición15,16,17,18. PLC activa calcio por degradación de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) en inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG)19,20,21. IP3 abre IP3 los receptores en el retículo endoplásmico (ER), conduce a la liberación de iones calcio de la ER. El calcio liberado activa dependiente de calcio/calmodulina quinasa II (CaMKII) calmodulina y proteína cinasa C (PKC) en presencia de DAG. Ambas proteínas quinasas están implicadas en el aprendizaje y la memoria22,23, coherente con la participación del PLC en este proceso. PLC ' s se dividen en subtipos, incluyendo PLCβ PLCγ y PLCε, basado en sus estructuras20. Cada subtipo PLC se activa en un contexto diferente de20, y los genes que codifican esos subtipos se expresan diferencialmente en diversos tejidos. Previamente demostramos que la abeja MBs expresarán genes que codifican los subtipos PLCβ y PLCε en niveles más altos que el resto de regiones cerebro24, y que dos inhibidores de la pan-PLC (edelfosine y neomicina sulfato [neomicina]) disminuyen la actividad PLC en diferentes regiones del cerebro y, de hecho, afectan la capacidad de aprendizaje y la memoria de la abeja24.
Tradicionalmente, se ha medido la actividad enzimática de PLC utilizando radiactivos PIP225, que requiere instalaciones, equipos y formación adecuada. Recientemente, un substrato sintético fluorógenos de PLC ha sido establecido26, haciéndolo fácil evaluar actividad de la PLC en el laboratorio estándar. Aquí, presentamos un protocolo detallado para detectar actividad de PLC en regiones diferentes del cerebro de la abeja con el sustrato fluorógenos y posteriormente probar los efectos inhibitorios de edelfosine y neomicina en PLC en estos tejidos. Debido a que el protocolo requiere solamente manipulaciones básicas, pueden ser aplicable a los estudios de actividad de la PLC en otros tejidos o áreas del cerebro en las abejas asignadas a diversas tareas sociales.
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Protocol
1. la captura de forrajeo de las abejas
- Compra de colonias de abejas de un distribuidor local.
- Utilizando una red de insectos, atrapar las abejas del forager que vuelven a la colmena con las bolsas de polen en sus patas traseras. Transferencia de las abejas a un tubo cónico plástico estándar de 50 mL y la tapa del tubo (figura 1). Poner el tubo en hielo para anestesiar las abejas.
Nota: Usar las chaquetas designadas para la apicultura evitar las picaduras de abeja. Enfermería las abejas también pueden recoger según el experimento. Para atrapar las abejas de la enfermera, observar el comportamiento de la abeja en el peine de cera y atrapar las abejas de la enfermera, que asoman sus cabezas en celdas de cría para alimentar las larvas, por el ala o el tórax con unas pinzas. Luego, coloque las abejas en un tubo de plástico de 50 mL, tapa el tubo y ponerlo sobre hielo como se menciona en el paso 1.2. - Captura al azar 12 forrajeros.
Nota: Este protocolo usa dos abejas por lote, resultando en seis lotes. Múltiples las abejas pueden quedar atrapadas en un tubo, y el número de las abejas en un solo tubo no es importante, como las abejas en cada lote se combinación más adelante (ver paso 3.1.1). Enfriar el tubo en el verano, como la alta temperatura en el tubo lesiona las abejas.
2. disección del cerebro de la abeja
- En el laboratorio, coloque el tubo de 50 mL en hielo durante al menos 30 min6 anestesiar las abejas.
- Para preparar la fase de disección, doblar un trozo de cera dental en medio (el tamaño resultante es de unos 3.5 x 7.5 cm) e introdúzcalo en un plato de plástico (60 x 15 mm).
Nota: La cera doblada sostiene firmemente los pernos de insectos. - Microscopio binocular, separar la cabeza de la abeja de su cuerpo con pinzas y fijar en la cera dental mediante la inserción de insectos pasadores en la base de cada antena para sujetar la parte anterior de la cabeza en una posición hacia arriba (figura 2A).
Nota: Lave las pinzas antes de su uso, utilizando etanol o agua esterilizada. - Vierta suficiente solución salina (0,13 mol/L NaCl, 5 mmol/L de KCl y 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) en la cabeza para cubrirla. Perfore la cabeza otra vez con los pernos si la cabeza flota en la solución. Use una solución salina helada, si es necesario.
Nota: Sin embargo, este protocolo funciona sin la solución salina fría. - Retire las antenas con unas pinzas (figura 2B).
- Hacer un corte horizontal cerca de las bases de las antenas y longitudinalmente en la frontera de los ojos compuestos, usando un bisturí. Luego, realizar un corte horizontal en la parte superior de la cabeza. Retirar la cutícula para abrir una ventana sobre el cerebro (figura 2C).
Nota: Si es necesario, lave el bisturí con etanol o agua esterilizada antes de su uso. - Retire las retinas de los ocelos y las tráqueas en la superficie anterior del cerebro, con unas pinzas (figura 2D).
- Ampliar el corte en la frontera de los ojos compuestos dorsalmente y ventralmente, con el bisturí (figura 2E). A continuación, quite el tejido conectivo entre la cutícula de los ojos compuestos y las retinas insertando las pinzas directamente debajo de la cutícula del ojo (figura 2F).
- Deseche la cutícula de los ojos compuestos. Recoger las puntas dorsales de las retinas de los ojos compuestos con unas pinzas y las pinzas se mueven en la dirección ventral de pelar cuidadosamente las retinas (figura 2G).
- Retire con cuidado las tráqueas restantes en la superficie anterior del cerebro, con unas pinzas (figura 2H).
- Cortar el tejido conectivo entre el cerebro y alrededor de los tejidos, uso de pinzas y diseccionar el cerebro de la cápsula de la cabeza (figura 2H).
- Pele las tráqueas en la superficie posterior del cerebro, usando las pinzas (figura 2).
- Utilizando un bisturí, cortar la conexión entre el MBs y otras regiones del cerebro al lado de los lóbulos verticales, que forman parte de los MBs (figura 2J).
- Lugar las MBs disecadas y los restantes tejidos de cerebro en tubos de 1,5 mL y rápidamente les congelan con hielo seco o nitrógeno líquido (figura 2K). Almacenar los tejidos congelados a-80 ° C hasta su uso.
Nota: Manipular nitrógeno líquido con el designado guantes y ventilación para evitar la asfixia y quemaduras frío. Hielo seco deben ser manejado cuidadosamente con guantes. El protocolo puede hacer una pausa aquí. La disección y el almacenamiento del cerebro los tejidos deben ser realizan una abeja a la vez para evitar la degradación de las proteínas.
3. preparación de homogenados de cerebro
- Añadir 10 μl de buffer de homogeneización que consta de 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7.2), 70 mmol/L de KCl y 1,0 mmol/L CaCl2 a las congeladas del tejido del cerebro y homogeneizar el tejido en el tubo de 1,5 mL, manualmente aplicando presión con un mortero plástico. Movimiento del tejido por lo menos 200 x.
Nota: Realice las manipulaciones descritas en la sección 3 sobre el hielo. Utilizar un mortero de montaje justo en el tubo para aplastar lo suficiente a los tejidos que flotan fácilmente en el buffer de homogeneización.- Transferir la solución del tejido homogeneizado al siguiente tejido en el lote y homogeneizar el tejido de la misma manera.
Nota: Las abejas en cada lote se combinan en este paso. Este protocolo utiliza seis lotes.
- Transferir la solución del tejido homogeneizado al siguiente tejido en el lote y homogeneizar el tejido de la misma manera.
- Añadir 30 μL del buffer de homogeneización.
- Centrifugar la muestra de tejido homogenizado durante 10 minutos a aproximadamente 900 x g27 y 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL y centrifugar nuevamente por 20 min a aproximadamente 9.500 x g27 y 4 ° C.
- Colocar el sobrenadante en un tubo nuevo de 1,5 mL. Almacenar el homogeneizado a-20 ° C hasta su uso.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Determinar la concentración de proteína usando el análisis de (BCA) ácido bicinchoninic.
- Diluir 2,5 μl del homogeneizado con 17.5 μl de agua estéril (por lo tanto diluir el homogeneizado eightfold) y usar todo el homogeneizado diluido.
Nota: Homogeneizado de muestreo utilizando una micropipeta debe realizarse cuidadosamente debido a su alta viscosidad. - Realizar el ensayo BCA en 0, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 y 2.0 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) 20 μl como normas.
Nota: Cambiar la escala del ensayo BCA según sea necesario, basado en el volumen de las muestras estándar y homogeneizado. El protocolo puede hacer una pausa aquí.
- Diluir 2,5 μl del homogeneizado con 17.5 μl de agua estéril (por lo tanto diluir el homogeneizado eightfold) y usar todo el homogeneizado diluido.
4. el PLC reacción en homogenados de cerebro
- Prepare la solución de la fluorógenos sustrato WH-1526 disuelto en agua estéril a 50 μmol/L y almacenar a-80 ° C.
Nota: Cubre las soluciones que contienen el sustrato con papel aluminio para evitar la decoloración. - Preparar la premezcla en el volumen requerido para alcanzar la siguiente composición en 10 μl de mezcla de reacción de reacción: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7.2), 70 mmol/L de KCl, 1,0 mmol/L de CaCl2, 2.0 mmol/L de Ditiotreitol, 50 mg/L BSA y 12.5 WH μmol/L-15.
- Diluir el homogeneizado con buffer de homogeneización, si es necesario.
- Mezclar la premezcla de reacción y homogeneizado que contiene 1,3 μg de proteínas en un tubo de reacción en cadena (PCR) de polimerasa para alcanzar un volumen final de 10 μl de mezcla de reacción.
- Preparar dos tipos de mezclas de control para el análisis estadístico: poner el homogeneizado pero no WH-15 en la mezcla (mezcla de control 1) y viceversa (mezcla de control 2).
Nota: Preparar las mezclas de reacción y control de mezclas en hielo para evitar la degradación de las proteínas y reacción del PLC. Control las mezclas 1 y 2 se utilizan para detectar la fluorescencia del homogeneizado y substrato libre, respectivamente.
- Preparar dos tipos de mezclas de control para el análisis estadístico: poner el homogeneizado pero no WH-15 en la mezcla (mezcla de control 1) y viceversa (mezcla de control 2).
- Enjuagar el tubo e incubar en un termociclador durante 30 min a 25 ° C.
- Detener la reacción agregando 2 μl del bis de glicol de etileno de 25 mmol/L (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilendiaminotetraacético.
Nota: Cantidad de proteína adecuada y tiempos de reacción varían entre experimentos. Así, para optimizar las condiciones de reacción, puede ser necesario repetir los procedimientos descritos en los pasos 4.1 5.3 en los experimentos preliminares cambiando la proteína cantidad e incubación tiempo hasta que la fluorescencia aumenta linealmente. Para la referencia, cuando se utiliza el homogenado derivado de las otras regiones del cerebro, la reacción generalmente funciona linealmente con 1,3 μg o menos de proteínas dentro de 30 min, pero la linealidad disminuye con al menos 2,7 μg de proteínas o con un tiempo de incubación de 90 min o lo dedo.
5. detección de la fluorescencia que resulta de la actividad de la PLC
- Centrifugar la mezcla de reacción y control mezclas durante 5 minutos a aproximadamente 310 x g28 y transferir 10 μl del sobrenadante a diferentes pozos en un microplacas de 384 pozos aplicable para la detección de fluorescencia.
Nota: Para evitar la decoloración y una contaminación con polvo, cubra la placa con papel de aluminio. - Ras la microplaca utilizando una centrífuga de la microplaca.
- Coloque la placa en un lector de microplacas y detectar la fluorescencia con una técnica por triplicado.
Nota: Las longitudes de onda de excitación y emisión son 344 nm y 530 nm, respectivamente. Caso (dependiendo del lector de microplacas), mezcla de las mezclas de muestra 5 s antes de cada detección. El protocolo se puede detener aquí.
6. prueba de la acción inhibitoria de agentes farmacológicos
- Preparar las soluciones madre de edelfosine y neomicina en las concentraciones apropiadas y almacenar hasta su uso: edelfosine en 5.0 mmol/L y -20 ° C; neomicina en 550 mmol/L y 4 ° C.
- Durante la preparación de la premezcla de reacción según se describe en el paso 4.2., añadir inhibidores a la premezcla para lograr las adecuadas concentraciones finales: edelfosine, 1,0 mmol/L; neomicina, 0.55 mmol/L.
- Añadir el homogeneizado a las mezclas de premezcla y adecuado control de la reacción como en el paso 4.4.
- Preparar tres tipos de mezclas control: poner el homogeneizado e inhibidor, pero no el sustrato a mezcla de control 1; Añadir el sustrato y el inhibidor pero no el homogeneizado en la mezcla de control 2; y el inhibidor, pero no el homogeneizado o sustrato a mezcla de control 3.
- Realizar la reacción del PLC y la detección de fluorescencia como se describe en pasos 4.5-5.3.
7. estadístico análisis
- Para la detección de actividad de la PLC mediante las mezclas que se describe en la sección 4, calcular la fluorescencia derivada de la reacción entre el PLC y el sustrato restando la fluorescencia emitida por el homogeneizado o sustrato libre como sigue.
FL (actividad de la PLC) = Fl (mezcla de reacción) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
Nota: Fl (actividad de la PLC), Fl (mezcla de reacción), Fl (ctrl 1) y Fl (ctrl 2) denotan bona fide fluorescencia derivada de la actividad de la PLC, la fluorescencia detectada en la mezcla de reacción y control mezclas 1 y 2, respectivamente.- Después de la medición de la fluorescencia en las mezclas como se describe en los pasos 4.1 5.3, calcular Fl (actividad de la PLC) según la ecuación en el paso 7.1 y luego la media Fl (actividad de la PLC) de la técnica por triplicado para cada homogenado.
- Con la Fl media (actividad de la PLC) de la técnica triplicado obtenida en el paso 7.1.1, calcular otra vez el Fl media (actividad de la PLC) de réplicas biológicas de los MBs y otras regiones cerebrales y comparar los valores entre los tejidos del cerebro.
- Para el examen de la actividad de la PLC en presencia de inhibidores de uso de las mezclas descritas en el apartado 6, calcular la fluorescencia derivada de la reacción entre el homogeneizado, el sustrato y el inhibidor de la siguiente manera.
FL (actividad PLC con inhibidor) = Fl (mezcla de reacción) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)
Nota: Aquí, Fl (actividad PLC con inhibidor) es bona fide fluorescencia resultantes de la actividad de la PLC en presencia del inhibidor. FL (mezcla de reacción), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) y Fl (ctrl 3) son las señales de fluorescencia detectadas en la mezcla de reacción, la mezcla de control 1, controlan de mezcla 2 y la mezcla de control 3, respectivamente.- Después de la medición de la fluorescencia en las mezclas como se describe en pasos 6.1-6.4 calcular Fl (actividad PLC con inhibidor) según la ecuación en el paso 7.2. A continuación, obtener la media Fl (actividad PLC con inhibidor) de la técnica por triplicado para cada homogenado.
- El valor promedio calculado en el paso 7.2.1, calcular la media Fl (actividad PLC con inhibidor) de réplicas biológicas derivadas de cada tejido fino del cerebro. Comparar el Fl (actividad PLC con inhibidor) y Fl (actividad de la PLC) obtenido en el paso 7.1.2 en cada tejido fino del cerebro.
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Representative Results
Concentraciones de proteína en homogenados de cerebro:
Preparamos homogenados usando las abejas del forager. Las concentraciones de proteína calculada en homogenados original se muestran en la figura 3. Las concentraciones de proteína aproximada en el homogeneizado original fueron las siguientes: 1,5 mg/mL en el MBs y 2,3 mg/mL en otras regiones del cerebro. Hemos utilizado dos abejas por lote y se analizaron seis lotes.
Detección de actividad de la PLC en los homogenados de cerebro:
En el experimento piloto, detectamos mayor fluorescencia en otras regiones del cerebro que en los MBs. Por ello, repitió los experimentos preliminares usando el homogeneizado de las otras regiones del cerebro y determinar el tiempo de reacción (es decir, 30 min) y la cantidad de proteína (es decir, 1,3 μg). El resultado de la reacción en estas condiciones se muestra en la figura 4A. Las mezclas de reacción conteniendo tejido homogeneizado y los sustratos fluorógenos exhibieron > 4.2-fold fluorescencia más alta que las mezclas de control que contiene el homogeneizado de tejido o sustrato fluorógenos, sugiriendo que era actividad PLC detectados en las mezclas de reacción. Fluorescencia relativa fue aproximadamente 3.4-fold mayor en otras regiones del cerebro que los MBs (figura 4B).
Análisis de los efectos inhibitorios de agentes farmacológicos en la actividad PLC:
Para examinar los efectos de los inhibidores de la edelfosine de pan-PLC y neomicina en actividad PLC, se realizó la reacción en presencia de 1,0 mmol/L edelfosine o 0.55 neomicina mmol/L, usando el mismo homogeneizado como analizado anteriormente. En presencia de edelfosine, el nivel de fluorescencia disminuyó a aproximadamente 6.0% y 5.4% en el MBs y otras regiones del cerebro, respectivamente, en comparación con los controles sin edelfosine (figura 4C). Tratamiento neomicina reduce el nivel de fluorescencia a 44% y el 20% que controla en el MBs y otras regiones del cerebro, respectivamente (figura 4D).
Figura 1 : Capturar una abeja forrajera. Un cazador que regresa a su colmena fue capturado en una red de insectos, y ella fue confinada en un tubo cónico plástico de 50 mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Representación esquemática del procedimiento de disección de. Se muestran los ejes (A) del cerebro de la abeja mencionado en el protocolo. La abeja de la cabeza al tórax anterior es vista desde el lado lateral. (B - K) Se muestran fotos e ilustraciones de los procedimientos de disección. Véase el texto principal para los detalles. Se presenta sólo la cabeza de la abeja. Una ilustración de las tráqueas se omite. MBs = cuerpos setas. Las barras de escala corresponden a 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Las concentraciones de proteína en homogenados de tejido cerebral. Las concentraciones de proteína en los homogenados original fueron medidas por análisis BCA y calculadas. Se muestran las concentraciones promedios con desviaciones estándar. Dos abejas del forager fueron utilizadas para cada lote, y se analizaron seis lotes. MBs = cuerpos setas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : La fluorescencia detectada en reacciones de. (A) este panel muestra fluorescencia en cada tejido con o sin el fluorógenos sustrato. La reacción se realizó por 30 min con 1,3 μg de proteína. La fluorescencia fue medida por el lector de microplacas. Los valores de los pozos de muestra fueron corregidos por pozos vacíos y en unidades arbitrarias (AUs). (B) este panel muestra una comparación de fluorescencia entre los tejidos del cerebro. Los datos en el panel A se corrigió para mezclas de control por sustracción y normalizados por la fluorescencia calculada en MBs. * P < 0.005, test U de Mann-Whitney. Los paneles C y D muestran relativa de la fluorescencia en presencia de edelfosine de 1,0 mmol/L (C) y (D) 0.55 mmol/L neomicina. Se analizaron los homogenados mismo utilizados en los paneles A y B . Los valores de fluorescencia se normalizaron los resultados del experimento de control sin tratamiento farmacológico para cada tejido. Los datos de las reacciones de control en el panel C son los mismos que en el panel B. En el panel D, homogenados todos fueron analizados otra vez en un experimento diferente. Se muestran los valores de fluorescencia promedio con desviaciones estándar. Dos abejas fueron utilizadas para cada lote, y se analizaron seis lotes. P < 0.05, Wilcoxon firmar-alinea la prueba. No Hg = mezcla de control no contiene homogeneizado; MBs = cuerpos setas. Paneles B - D fueron modificados desde los pantanos et al. 24 con el permiso del editor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El examen bioquímico de la actividad de la proteína es profundamente importante para comprender la señalización molecular en el cerebro, porque la actividad de una enzima se ve afectada por varias moléculas, tales como sustratos e inhibidores y por lo tanto, puede cambiar a lo largo de con comportamiento animal (p. ej., aprendizaje y memoria)5. En los estudios de la abeja, enzimas tales como kinase de proteína dependiente de AMP cíclico A, proteína quinasa dependiente del GMP cíclico, PKC, CaMKII fosforilada y adenilato ciclasa se divulgan diferencialmente expresados en varias regiones del cerebro basadas en Immunohistochemistry5,10,29,30,31. Diferencias en la actividad enzimática entre regiones del cerebro, sin embargo, son sólo parcialmente reportado6. Aquí, hemos descrito un protocolo detallado para detectar actividad PLC y la evaluación de los efectos inhibitorios de agentes farmacológicos en el MBs y otras regiones del cerebro.
Hay algunos factores posible interferir con la detección de fluorescencia. En primer lugar, es importante proteger la proteína de la degradación al realizar ensayos bioquímicos. En el protocolo descrito aquí, se requiere una disección rápida y congelación del cerebro. Se recomienda que las muestras de tejido son congeladas y almacenadas pronto después de cada ciclo de la disección. Una minimización del ciclo de descongelación y congelación del homogeneizado también es crucial para prevenir el deterioro de la proteína.
Además de la degradación de las proteínas, fluorescencia del fondo y la absorbancia de la mezcla de reacción pueden afectar los resultados en este sistema de ensayo, ya que se detectó actividad de la PLC por una señal de fluorescencia. Por ejemplo, neomicina disuelto en agua tiene un color amarillo que afecta a la detección de fluorescencia. Aunque hemos utilizado neomicina 0.55 mmol/L, una 1000-fold dilución de la solución madre, podrían necesitar una mayor optimización de la concentración. Además, la contaminación por otros tejidos también puede influir en el resultado. La retina, que detecta estímulos visuales y contiene pigmentos, comprende un tipo de tejido que potencialmente interfiere con el ensayo.
Con el presente Protocolo, detectamos una mayor actividad de la PLC en otras regiones del cerebro que en el MBs24. Esto era incompatible con el resultado del análisis PCR cuantitativo reverso-transcripción, que reveló que el MBs expresan niveles más altos de los genes PLC que otros tejidos de cerebro24. Esta contradicción puede deberse a WH-15, que es un sustrato flotante26y el hecho de que no distinguimos las fracciones citosólicas de los homogenados de cerebro y membrana. Teniendo en cuenta que PLCβ y PLCε son enzimas asociadas a membrana32 y que pueden interactuar con el sustrato endógeno de2 PIP, la cantidad de la fracción de membrana en el homogeneizado probablemente afecta la reacción entre el PLC y WH-15. Otra posible explicación es que la concentración del PLC puede ser mayor en las otras regiones del cerebro que en el MBs debido a diferencias en las tasas de producción y degradación de proteínas. Por lo tanto, debe precisarse en bona fide PLC actividad en el cerebro más de experimentos adicionales, tales como mediante el uso de un nuevo substrato reciente incorporado en la membrana33, analizando la actividad asociada a la membrana y citosólicas PLC por separado, o cuantificar el contenido de PLCs o PIP2 en cada tejido fino del cerebro.
Habida cuenta de los puntos anteriores, el sistema de ensayo PLC descrito aquí puede ser ampliado para medir la actividad de la PLC en diferentes tejidos no evaluado aquí, como el tubo digestivo, músculo y órgano reproductor. También es posible comparar la actividad de la PLC entre los cerebros de forrajera y las abejas de la enfermera a evaluar la implicación de la actividad de la PLC en diferentes roles sociales.
En general, el sistema de análisis presentado aquí es una opción factible para detectar actividad PLC en homogenados de tejido, ya que puede realizarse con equipos de laboratorio estándar, aunque requiere de un enfoque tradicional con radiactivos PIP2 especializada instalaciones, capacitación y equipamiento para radioisótopos. Aprovechando el sistema con más modificaciones se profundizará nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de comportamiento complejo de la abeja.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Figura 4B - 4D fue modificado de los pantanos et al. 24 con el permiso de Biología abierta. Los autores agradecemos a la editorial por el permiso. Este trabajo fue apoyado por el programa humano de ciencia frontera (RGY0077/2016) Shota Suenami y Ryo Miyazaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
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