Summary
Hier, hanteren wij een drukkend warm water (PHWE) extractiemethode, die gebruik maakt van een ongewijzigde huishoudelijke espressomachine om studenten kennismaken met natuurproducten chemie in het laboratorium. Twee experimenten worden gepresenteerd: PHWE van eugenol en acetyleugenol van kruidnagel en PHWE van seselin en (+)-epoxysuberosin van de Australische plant Correa reflexa.
Abstract
Een onlangs ontwikkelde drukkend warm water (PHWE) extractiemethode die gebruik maakt van een ongewijzigde huishoudelijke espressomachine om natuurproducten onderzoek gebleken ook toepassingen als een effectieve pedagogisch instrument. Deze techniek is in het bijzonder gebruikt om tweede - en derdejaars studenten kennismaken met aspecten van de chemie van natuurproducten in het laboratorium. In dit verslag twee experimenten worden gepresenteerd: de PHWE van eugenol en acetyleugenol van kruidnagel en de PHWE van seselin en (+)-epoxysuberosin van de endemische Australische plantensoorten Correa reflexa. Deze experimenten door PHWE, het ruwe teentje extract, verrijkt met eugenol en acetyleugenol, op 4-9% w/w van kruidnagel is verkregen door tweedejaars studenten, seselin en (+)-epoxysuberosin werden geïsoleerd in opbrengsten van maximaal 1,1% w/w en 0,9% w/w van C. reflexa door derdejaars studenten. De voormalige oefening werd ontwikkeld als een vervanging voor het traditionele stoom distillatie experiment dat het verstrekken van een inleiding tot de extractie en afscheiding technieken, terwijl de laatstgenoemde activiteit geleid-onderzoek onderwijsmethoden featured in een poging om te simuleren natuurproducten bioprospecting. Dit is primair afgeleid van de snelle aard van deze techniek PHWE ten opzichte van traditionele extractiemethoden die vaak onverenigbaar met de tijdsdruk undergraduate laboratoriumexperimenten is gekoppeld zijn. Deze snelle en praktische PHWE-methode kan worden gebruikt om efficiënt isoleren van verschillende klassen van organische moleculen uit een aantal plantensoorten. Het complementaire karakter van deze techniek ten opzichte van meer traditionele methoden is ook eerder aangetoond.
Introduction
De isolatie en identificatie van natuurlijke producten zijn van fundamenteel belang voor de wetenschappelijke gemeenschap en de samenleving meer in het algemeen. 1 Bioprospecting, het zoeken naar waardevolle organische moleculen in de natuur, blijft een onmisbaar proces in de ontdekking van nieuwe drug leads en potentiële therapeutische agenten. Geschat wordt dat vanaf 1981-2014 ~ 75% van alle goedgekeurde klein molecuul farmaceutische drugs werden natuurproducten, natuurlijke product afkomstige of natuurlijke product-geïnspireerd. 1 voorts natuurproducten beschikken over enorme structurele en chemische diversiteit. Om deze reden vertegenwoordigen zij ook waardevolle chemische steigers die direct kunnen worden gebruikt in de organische synthese of in de ontwikkeling van chirale ligand en katalysatoren. 2 , 3
Relatief tijdrovende procedures zoals maceratie Soxhlet extractie en stoomdestillatie hebben van oudsher de steunpilaar van onderzoek gericht op het isolement van secundaire metabolieten van planten. 4 modernere technieken van de extractie, met inbegrip van versnelde solvent extractie, hebben gericht op de vermindering van de winning keer en tot oprichting van groenere protocollen. 4 , 5 in 2015, een originele drukkend warm water-extractiemethode (PHWE) werd gemeld. 6 deze techniek gebruikt een ongewijzigde huishoudelijke espressomachine ter vergemakkelijking van de snelle en vooral efficiënte winning van shikiminezuur zuur van steranijs. Espressomachines zijn specifiek ontworpen en gebouwd om uittreksel van organische moleculen uit adequaat grond koffiebonen. Om dit, deze instrumenten warmte water bij temperaturen tot 96 ° C en druk van meestal 9 bar. 7 met dit in gedachten, het is misschien niet verrassend dat espressomachines kunnen worden gebruikt om natuurproducten efficiënt te extraheren uit een scala van plantaardig materiaal.
Latere studies waarbij allerlei soorten terrestrische planten hebben aangetoond dat de capaciteit van deze techniek PHWE efficiënt uitpakken van natuurlijke producten in een relatief brede polariteit scala. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 voorts verbindingen met enigszins gevoelig functionele groepen, zoals aldehyden, epoxiden, glycosiden en potentieel epimerizable stereogenic centra werden meestal niet beïnvloed door het extractieproces. Het complementaire karakter van deze techniek ten opzichte van meer traditionele methoden is ook aangetoond. 12 , 16 deze PHWE methode heeft ook tewerkgesteld te isoleren multi gram hoeveelheden van natuurlijke producten, die zijn gebruikt voor het bereiden van roman natuurproduct derivaten en in ingewikkelde molecuul synthese meer in het algemeen. 8 , 11 , 17
Het was vastgesteld dat deze nieuwe PHWE methode zou kunnen dienen als een nuttig leermiddel die kan worden opgenomen in het undergraduate laboratorium. Dit is primair afgeleid van de snelle aard van deze techniek ten opzichte van de traditionele extractiemethoden die vaak onverenigbaar met de tijdsdruk undergraduate laboratoriumexperimenten is gekoppeld zijn. Bijgevolg is deze techniek verdrongen de traditionele undergraduate chemie laboratorium experiment, gericht op de winning van eugenol uit teentjes dienst stoomdestillatie op de Universiteit van Tasmanië. 9 , 18 sinds die tijd, variaties van dit experiment zijn overgenomen door andere universiteiten en een gemodificeerde experiment, gericht op de PHWE van kruidnagel nu functies in het programma van de laboratorium undergraduate scheikunde aan de Universiteit van Sydney (vide infra ).
Om aan te tonen de uitvoerbaarheid en de haalbaarheid van het gebruik van deze nieuwe benadering van de PHWE voor onderwijsdoeleinden, zijn twee protocollen ingediend als onderdeel van deze studie. Het eerste deel van dit verslag wijst op een experiment op de PHWE van eugenol en acetyleugenol van kruidnagel die deel van het programma van het tweede jaar undergraduate laboratorium aan de Universiteit van Sydney (Figuur 1 uitmaakt). Dit experiment dient om studenten kennismaken met chemie van natuurproducten terwijl de ontwikkeling van fundamentele praktische vaardigheden. Het tweede deel beschikt over een experiment op de PHWE van de endemische Australische plantensoorten Correa reflexa dat deel van het programma van de derdejaars undergraduate laboratorium aan de Universiteit van Tasmanië (Figuur 2 uitmaakt). Dit experiment is ontworpen om te simuleren van natuurproducten bioprospecting en versterking van de kern laboratoriumtechnieken. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het is raadzaam dat alle procedures worden uitgevoerd in een zuurkast. Studenten dienen passende persoonlijke beschermingsmiddelen te allen tijde te dragen in het laboratorium en de veiligheidsinformatiebladen (SDS) dat elk reagens gekoppeld moeten worden geraadpleegd voordat gebruik.
1. PHWE van kruidnagel: isolatie van eugenol en acetyleugenol
- Extractie van eugenol en acetyleugenol van kruidnagel
- Plaats grof gemalen kruidnagel (12,5 g) in een bekerglas van 250 mL.
- Zand (12,5 g) toevoegen aan de kruidnagel maalt en meng goed.
- Een portafilter (monster compartiment) verzamelen en laden van de mand met het gehele kruidnagel-zand mengsel. Licht comprimeren het monster met de stamper.
Opmerking: Het mengsel niet te veel comprimeren of vloeistof zal stromen niet door. - Plaats de portafilter in de espressomachine en plaats een schoon 250 mL-bekerglas eronder. Een 30% ethanol/H2O-oplossing aan het waterreservoir van de espressomachine toevoegen als het minder dan half vol is.
- Gebruik de espressomachine voor het verzamelen van 100 mL van het extract.
Opmerking: Raadpleeg een instructeur als de machine lijkt te worden verstopt. - Laat de portafilter klaar is vochtig en verwijder het uit de espressomachine.
Let op: De maalt en metalen omgeving zullen warm zijn. - Met behulp van een spatel, verwijder het teentje maalt uit de portafilter en weggooien in de Prullenbak.
- De residuele lichamen van de portafilter met H2O onder een kraan in de gootsteen spoelen en terug te sturen voor de volgende persoon te gebruiken.
- Koel de kruidnagel uitpakken in een ijsbad, totdat de temperatuur heeft verminderd tot ten minste 30 ° C.
- Plaats van het extract in een separatory trechter van 250 mL, voeg toe 30 mL hexaan en schud zachtjes.
- Plaats de scheitrechter in een ring-klem gemonteerd op de stand van een retort en laat de waterige en biologische lagen te scheiden dan verzamelen de waterige (onderste) laag terug in het bekerglas van 250 mL.
Opmerking: Het kan duren tot 10 minuten voor de lagen om te scheiden. Studenten worden geadviseerd om het verrichten van oplosmiddelen optimalisatie van TLCs tijdens het wachten voor de eerste scheiding optreden (Zie stappen 1.2). - De biologische (bovenste) laag (die het product bevat) overbrengen in een erlenmeyer van 250 mL schoon, en giet de onderlaag (waterige) terug in de trechter van de separatory.
- Pak de waterige laag nog eens twee keer met hexaan (2 x 30 mL).
- De (bovenste) organische lagen samenvoegen door de dezelfde kolf na elke extractie.
- Na de derde vloeistof-vloeistof extractie, giet het gecombineerde organische extract in de trechter van de separatory, en wassen met 100 mL H2O door schudden. Verzamelen van de (bovenste) organische laag in een erlenmeyer van 250 mL schoon en droog door toevoeging van MgSO4 en zwenken van de kolf.
- Het filteren van de daaruit voortvloeiende mengsel door gecanneleerde filterpapier vervat in een glazen trechter in een vooraf gewogen 250mL-rondbodemkolf.
Opmerking: Het vaste residu (gehydrateerd MgSO4) kan worden weggegooid in de afvalstoffen. - Het oplosmiddel (hexaan) verdampen uit de verzamelde filtraat met behulp van een rotatieverdamper (Bad watertemperaturen: 60 ° C, vacuüm druk: 350 mbar) en opnieuw wegen de kolf die de resulterende olie bevatten.
- Optimalisatie van dunne-laag chromatografie (TLC) oplosmiddel systeem
Opmerking: Als een groep studenten zal worden een oplosmiddel systeem van 100:0 aceton: cyclohexaan tot toegewezen 0:100 aceton: cyclohexaan door de instructeur te identificeren van de verhouding waarmee de maximumresolutie van eugenol van acetyleugenol.- Het verkrijgen van een TLC referentie oplossing van pure eugenol en acetyleugenol.
Opmerking: De nodige TLC referentie oplossingen van pure eugenol en acetyleugenol werden voorbereid door lab technici voorafgaand aan de zitting van het lab. - Markeer een basislijn ~1.5 cm vanaf de onderkant met een zacht potlood op een TLC-plaat. Mark uit drie even verdeelde punten.
- Gebruik een TLC spotter om ter plaatse een druppel van pure eugenol TLC referentie oplossing in één lane, een plek van zuivere acetyleugenol TLC referentie oplossing in de derde rijstrook en een plek voor elk in de tweede baan (de co plek).
- Controleren op de aanwezigheid van eugenol en acetyleugenol op de TLC-plaat bij het bekijken van de plaat onder een UV-lamp (254 nm) in de TLC kabinet bekijken.
Opmerking: Moet er kleine (1-2 mm breed) zwarte vlekken op de plaat waar de TLC-standaardoplossingen werden gespot. Als geen spots of de vlekken vaag verschijnen, toepassing een andere plek van de passende oplossing voor TLC totdat een zwarte vlek onder UV-licht wordt waargenomen. - Voeg 10 mL van de toegewezen oplosmiddel mengsel aan een schone, droge TLC jar.
Opmerking: Zorg ervoor dat de oplosmiddelen hoogte in de pot niet ~ 1 cm overschrijden. - Plaats de voorbereide TLC-plaat met pincet in de TLC kruik. Sluit het deksel van de pot.
Opmerking: Het oplosmiddel moet liggen onder de basislijn van de TLC-plaat. - Het toestaan van het oplosmiddel om te reizen van de TLC-plaat. Zodra het oplosmiddel ~ 1 cm van de bovenkant van de plaat is, de TLC-plaat uit de pot verwijderen met een pincet en markeer de regel van het oplosmiddel front met een potlood.
- Toestaan van het oplosmiddel te verdampen uit de TLC-plaat (~ 1 min), dan bekijken de TLC-plaat onder een UV-lamp (254 nm). Met behulp van een potlood, cirkel de zwarte vlekken op de TLC-plaat in acht genomen.
- Bereken de retentie factor (Rf) van eugenol en acetyleugenol door het verdelen van de afstand die is afgelegd door de verbinding door de afstand die is afgelegd door het oplosmiddel.
- Bereken het verschil tussen de Rf -waarden voor eugenol en acetyleugenol (ΔR-f).
- De resultaten delen met de rest van de klas. De waarden van de retentie overgenomen door medestudenten met andere oplosmiddelen ratio's opnemen.
- Bepaal welk oplosmiddel systeem best voor het analyseren van de ruwe eugenol oplossing en de daaropvolgende zuivering stappen.
Opmerking: De beste TLC oplosmiddel verhouding zorgt voor de grootste scheiding tussen eugenol en acetyleugenol aangeduid door de grootste ΔRf -waarde. Als ΔRf wordt uitgezet tegen oplosmiddelen samenstelling, moet de grafiek lijken op een bell curve.
- Het verkrijgen van een TLC referentie oplossing van pure eugenol en acetyleugenol.
- Scheiding van eugenol en acetyleugenol door vloeistof-vloeistof extractie
- Hexaan (10 mL) toevoegen aan het ruwe eugenol-bevattende verkregen extract uit stap 1.1.17, en de daaropvolgende oplossing in een 250 mL separatory trechter giet.
- Spoel de Rondbodemkolf met hexaan (10 mL) en voeg dit toe aan de separatory trechter.
- Pak de hexaan-oplossing met 3 M waterige NaOH (2 x 25 mL) via vloeistof-vloeistof extractie. Verzamelen en combineren de waterige onder lagen in een conische kolf van 250 mL van elk extractie. Verzamelen van de organische laag in een conische kolf van 50 mL en droog door toevoeging van MgSO4 en zwenken van de kolf.
Let op: NaOH is corrosief. Vermijd elk contact met de huid.
Opmerking: Acetyleugenol blijft in de organische laag, terwijl eugenol nu in het alkalische waterig extract (onderste lagen is). - Behouden de organische laag (organische oplossing A) voor een latere anayse van TLC.
- Swirl de erlenmeyer, waarin de alkalische waterige fractie uit stap 1.3.3 in een ijs-waterbad en voeg langzaam 10 M waterige HCl tot een witte emulsie ontstaat; Controleer het zuurgehalte met Congo rood papier, met behulp van een precisiepipet overbrengen van een daling van de oplossing op het papier van de pH (het moet wenden blauw).
Let op: HCl is corrosief. Vermijd elk contact met de huid. Toevoeging van HCl kan leiden tot krachtige borrelen, HCl zorgvuldig moet worden toegevoegd de erlenmeyer op ijs te houden.
Opmerking: Een totaal van 20-30 mL HCL (10 M van een waterige oplossing) worden vereist. - Pak de melkachtig waterige emulsie met hexaan (2 x 30 mL), met behulp van vloeistof-vloeistof extractie in een scheiding van de kolf van 250 mL. Zorg ervoor dat de temperatuur van het waterig extract bij kamertemperatuur of hieronder voordat u toevoegt de hexaan. Het combineren van de twee hexaan-extracten in een conische kolf van schone 100 mL.
Opmerking: De eugenol worden nu in de gecombineerde biologische (top) lagen (organische oplossing B). - Toevoegen van MgSO4 te drogen organische oplossing B.
- Analyseren van organische oplossing A, organische oplossing B, pure eugenol TLC verwijzing en acetyleugenol TLC verwijzing door TLC met behulp van de geoptimaliseerde TLC oplosmiddel verhouding geïdentificeerd in de vorige sessie.
- Filtreer organische oplossing A en B door gecanneleerde filterpapier in aparte vooraf gewogen ronde onderkant flessen van 250mL. Gooi het vaste residu (gehydrateerd MgSO4) in het afval.
- Verwijder het oplosmiddel uit de ronde onderkant kolven met een rotatievacuümverdamper (Bad watertemperaturen: 60 ° C, vacuüm druk: 350 mbar).
- Voeg diethylether (5 mL) toe aan elk Rondbodemkolf en breng de gezuiverde acetyleugenol (organische oplossing A) en eugenol (organische oplossing B) in een flesje van het labelloze, preweighed met behulp van een trechter.
- Spoel de kolf met verdere diethylether (5 mL) in het flesje. Damp het oplosmiddel met een rotatievacuümverdamper (Bad watertemperaturen: 50 ° C, vacuüm druk 800 mbar) met een flacon bijlage. Opnemen van de opbrengst en de flacon adequaat etiket.
- Analyseren van organische oplossing A, organische oplossing B, pure eugenol TLC verwijzing en acetyleugenol TLC verwijzing door TLC met behulp van de geoptimaliseerde TLC oplosmiddel verhouding geïdentificeerd in de vorige sessie.
Opmerking: Waterige oplossingen kunnen worden gegoten in de gootsteen voor verwijdering. Hexaan en ether afvalstoffen moet worden verwijderd in de niet-gechloreerde organische afval flessen.
2. PHWE van Correa reflexa : isolatie van seselin en (+)-epoxysuberosin
-
Sessie 1. PHWE van Correa reflexa
- Slijpen Correa reflexa bladeren (10 g) in een elektrische spice grinder en vervolgens het plantmateriaal grond overbrengen in een bekerglas van 250 mL.
Opmerking: Slijpen 20-30 seconden moet duren. - Voeg ~ 2 g grof zand aan de bekerglas plantmateriaal.
- Mix en pakje in de mand van de portafilter (monster compartiment). Het comprimeren van het monster met de stamper.
Opmerking: Pak het monster niet te strak. - Voeg ~ 300 mL 35% ethanol/H2O-oplossing aan de espresso machine tank.
- Plaats de portafilter in de espressomachine en plaats een schoon 250 mL-bekerglas eronder.
- Verzamelen van ~ 100 mL voor extract, ~ 1 minuut wachten en vervolgens verzamelen nogmaals 100 mL.
Let op: De machine en de extracten zullen warm op dit punt. - Dit mengsel in een ijsbad afkoelen en de ethanol met behulp van een rotatieverdamper verdampen (Bad watertemperaturen: ~ 40 ° C).
- Breng het waterig extract met separatory vultrechter en uittreksel met ethylacetaat (4 x 50 mL).
Opmerking: Tijd kan nodig zijn om het toestaan van emulsies te scheiden tussen extracties uit te voeren. - Combineren van de organische extracten, droog door het toevoegen van MgSO4 en wervelende de kolf, filteren met behulp van een glasfiltertrechter, en verdampen met behulp van een rotatieverdamper (Bad watertemperaturen: ~ 35 ° C) om het ruwe extract.
- Verkrijgen van een spectrum van de nucleaire magnetische resonantie (NMR) 1H (Zie de instructeur voor bijstand). 11
- TLC analyses van het ruwe extract om een geschikt oplosmiddel systeem te isoleren van de verbindingen die zijn uitgepakt uit te voeren.
Opmerking: TLC analyse is van overeenkomstige toepassing op de procedures die zijn beschreven in stap 1.2 uitgevoerd.
- Slijpen Correa reflexa bladeren (10 g) in een elektrische spice grinder en vervolgens het plantmateriaal grond overbrengen in een bekerglas van 250 mL.
-
Sessie 2. Scheiding van seselin en (+)-epoxysuberosin door flash kolom-chromatografie11,19
Opmerking: Het volgende protocol impliceert het gebruik van flash kolom-chromatografie voor de scheiding van organische stoffen. Raadpleeg een instructeur om aan te tonen hoe pack een flash silicagel-kolom.- Plaats de kolom (~ 30 mm diameter) in een klem gemonteerd op de stand van een retort. Plaats een erlenmeyer van 100 mL onder aan de kolom.
- Vullen van de kolom met silicagel (60 μm flash grade) tot een niveau van ~ 10 cm en voeg vervolgens hexanes (~ 100 mL) toe aan de kolom.
- Plaatsen van een glazen stop in de kolom, verwijder de kolom uit de klem en schud om een gier te verkrijgen. Plaats van de kolom in de klem en laat het mengsel te regelen.
- Open de kraan van de kolom en met behulp van een gas-adapter aangesloten op een persluchtleiding, leeg de kolom te laten ~ 2 mm oplosmiddel boven het bed van silica gel. Verwijderen van de gas-adapter en sluit de kraan.
- Gebruik de hexanes verzameld in de erlenmeyer (~ 5 mL) te wassen beneden een silica gel van de wanden van de kolom met een pipet van Pasteur voorzien van een rubber tussenschot.
- Herhaal stap 2.2.4 en vervolgens een klein laagje zand (~ 1 cm) toevoegen aan de kolom.
- Toevoegen van dichloormethaan (~ 1mL) aan op de maatkolf bevattende de ruwe extract uit stap 2.1.9. Zorgvuldig laden de daaropvolgende oplossing op de kolom met behulp van een pipet van Pasteur voorzien van een rubber tussenschot. Open de kraan van de kolom en het monster aan adsorberen op de silicagel.
- Herhaal stap 2.2.7 nog eens twee keer.
- Voeg zorgvuldig hexanes (~ 20 mL) toe aan de kolom. Herhaal stap 2.2.4.
- Voeg voorzichtig (~ 180 mL van een oplossing van het ethylacetaat/hexanes 15%). Open de kraan van de kolom en, met behulp van een gas-adapter aangesloten op een persluchtleiding, leeg de kolom te laten ~ 2 mm boven het bed van silica gel, het verzamelen van de breuken in reageerbuizen 10 mL oplosmiddel.
Opmerking: Hiermee kunnen seselin worden geïsoleerd. - Combineer de reageerbuis breuken met seselin in een kolf met ronde bodem van 250 mL en damp met behulp van een rotatieverdamper (Bad watertemperaturen: ~ 35 ° C).
Opmerking: TLC analyse wordt gebruikt om dit te bepalen en wordt uitgevoerd door naar analogie met de procedures die zijn beschreven in stap 1,2. - Voeg voorzichtig (~ 75 mL van een 25% ethylacetaat/hexanes-oplossing). Open de kraan van de kolom en, met behulp van een gas-adapter aangesloten op een persluchtleiding, leeg de kolom te laten ~ 2 mm boven het bed van silica gel, het verzamelen van de breuken in reageerbuizen 10 mL oplosmiddel.
Nota: Dit zal toestaan (+)-epoxysuberosin worden geïsoleerd. - Combineren van de reageerbuis breuken met (+)-epoxysuberosin in een 250 mL-ronde bodem kolf en verdampen met een rotatievacuümverdamper (Bad watertemperaturen: ~ 35 ° C).
Opmerking: TLC analyse wordt gebruikt om dit te bepalen en wordt uitgevoerd door naar analogie met de procedures die zijn beschreven in stap 1,2. - Monsters van de geïsoleerde bestanddelen worden geanalyseerd met behulp van NMR-spectroscopie. 11
Opmerking: NMR spectroscopie experimenten worden uitgevoerd door een lab technicus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PHWE van kruidnagel. Wanneer u probeert uit te voeren van de vloeistof-vloeistof extractie stap, tegengekomen studenten vaak emulsies (de toevoeging van pekel was meestal niet effectieve). In dit stadium, studenten werden instructies hebt ontvangen laat het mengsel in de scheitrechter staan terwijl ze de effecten van eluens samenstelling op de scheiding van eugenol en acetyleugenol onderzocht van TLC. Opgemerkt moet worden dat hexaan met heptaan of dichloormethaan in de vloeistof-vloeistof extractie stap kan worden vervangen. 9 studenten waren toegewezen een TLC oplosmiddel verhouding van aceton en cyclohexaan en voorzien van pure normen van eugenol en acetyleugenol en vervolgens uitgevoerd TLC analyse (Figuur 3). Hun resultaten waren tabelvorm op een whiteboard, en de effecten van oplosmiddel samenstelling op de retentie factor (Rf) en de optimale eluens werden beschouwd in een groepsgesprek (tabel 1). De optimale oplosmiddel composities geïdentificeerd door studenten meestal varieerden van 5-20% aceton/cyclohexaan met een ΔR-f tussen 0,1-0,2.
Na TLC eluens optimalisatie, studenten terug naar hun eugenol extracties. Het extract van de ruwe teentje (voornamelijk bestaande uit eugenol en acetyleugenol) werd geïsoleerd in 4-9% w/w. In de tweede sessie van dit experiment benut studenten de verschillende eigenschappen van het zuur-base van de twee grote organische moleculen om ze te scheiden door vloeistof-vloeistof extractie. Typisch, eugenol werd geïsoleerd in een rendement van 45-65% w/w voor de ruwe extract terwijl acetyleugenol werd geïsoleerd in een rendement van 5-10% w/w voor de ruwe extract. Studenten vervolgens gebruikt de geoptimaliseerde eluens (geïdentificeerd zoals hierboven beschreven) om te bepalen van het succes van hun vloeistof-vloeistof extractie door vergelijking van extracten daarvan naar de pure verwijzing monsters door TLC (Figuur 3). Studenten analyseerde hun ruwe kruidnagel-extract, en hun gezuiverde eugenol en acetyleugenol monsters door Fourier-transform infrarood spectroscopie van (FTIR) uit te voeren. 9 het oplosmiddel of het water pieken werden af en toe waargenomen in IR spectra als gevolg van slecht uitgevoerde werk-upprocedures (of arme monstervoorbereiding).
Gevorderde studenten ertoe ongeveer de helft van hun geïsoleerde ruwe olie de vloeistof-vloeistof extractie hierboven beschreven en het andere gedeelte onderworpen aan flash kolom-chromatografie (meer informatie vindt u in de ondersteunende informatie). Hoewel de vloeistof-vloeistof extractie en flash kolom-chromatografie stappen voltooien in een vier uur durende sessie nogal ambitieus lijkt was dit haalbaar voor de meeste van de gevorderde studenten bezig met dit experiment. De volledige scheiding van eugenol van acetyleugenol door flash kolom-chromatografie was zelden bereikt vanwege hun nauwe retentie-factoren (Figuur 4). Studenten konden echter in het algemeen te verzamelen van een paar breuken met zuivere eugenol. Gevorderde studenten waren vervolgens om commentaar gevraagd over de twee verschillende zuivering-technieken als onderdeel van hun verslag.
PHWE van Correa reflexa. Studenten uitgevoerd de PHWE van Correa reflexa met minimale hulp van de laboratorium-instructeur. Tijdens de vloeistof-vloeistof extractie stap emulsies meestal gevormd en studenten vaak moesten laat het mengsel te staan in de separatory trechter (~0.25 h) met periodieke agitatie van het mengsel met een roerstaaf. De chromatografische reiniging van het ruwe extract werd het comfortabel voltooid binnen de vier uur durende laboratorium-sessie door studenten. Seselin en (+)-epoxysuberosin in opbrengsten van maximaal 1,1% w/w en 0,9% w/w, respectievelijk werden geïsoleerd en geïsoleerde monsters van beide verbindingen werden geanalyseerd door 1H en 13C-NMR en FTIR spectroscopie (Figuur 2). Hoewel studenten ondernam de FTIR spectroscopie experimenten en bereid monsters voor NMR spectroscopie, lab technici uitgevoerd NMR spectroscopie experimenten. De door studenten behaalde resultaten waren consistent met eerder gepubliceerde werk. 11
Hoewel dit niet is ingediend in dit verslag, in de praktijk, kenmerkt dit experiment ook een tweede deel dat studenten uit te voeren van de winning een plantensoorten die niet onderzocht PHWE daagt is (meer informatie vindt u in de ondersteunende dienst informatie).
Figuur 1. PHWE van kruidnagel. 9 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. PHWE van Correa reflexa. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Een representatieve TLC plaat bereid door een student. (10% aceton / cyclohexaan elutie). Lane 1, onder E: eugenol norm; Lane 2 (ruwe): ruwe kruidnagel extract; Lane 3 (A): acetyleugenol standaard). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| aceton / cyclohexaan (%v/v) | acetyl-eugenol Rbedoelf | acetyl-eugenol Rf (σ) | bedoel eugenol Rf | Eugenol Rf (σ) | bedoel ΔRf | aantal TLC analyses |
| 0 | 0,06 | 0.08 | 0.04 | 0,06 | 0.02 | 12 |
| 5 | 0.34 | 0.11 | 0.27 | 0.09 | 0,07 | 15 |
| 10 | 0,45 | 0,07 | 0.34 | 0,05 | 0.12 | 20 |
| 20 | 0.51 | 0,07 | 0,41 | 0,06 | 0.10 | 20 |
| 30 | 0,58 | 0.10 | 0,49 | 0.12 | 0.10 | 19 |
| 40 | 0.63 | 0.08 | 0,56 | 0.08 | 0,07 | 16 |
| 50 | 0.76 | 0.08 | 0,73 | 0.08 | 0.03 | 17 |
| 60 | 0.77 | 0.13 | 0,73 | 0,15 | 0.04 | 12 |
| 70 | 0.84 | 0.13 | 0.81 | 0.13 | 0.03 | 11 |
| 80 | 0.90 | 0,06 | 0,87 | 0.08 | 0.02 | 10 |
| 90 | 0.88 | 0,06 | 0,87 | 0,05 | 0,01 | 11 |
| 100 | 0,87 | 0.13 | 0.86 | 0.14 | 0.02 | 6 |
Tabel 1. Tabel van retentie factoren waarin het effect van samenstelling van de elutievloeistof op Rf.
Figuur 4 . Representatieve TLC platen bereid door studenten. Links: Een TLC plaat analyseren van de resultaten van de stap van vloeistof-vloeistof extractie (10% aceton / cyclohexaan elutie). Lane 1, onder E: eugenol norm; Lane 2 (LEB): eugenol-bevattende organische uitpakken; Lane 3 (A): acetyleugenol norm; Lane 4 (LEN): acetyleugenol-bevattende organische extract. Rechts: Een TLC plaat analyseren van de resultaten van flash kolom-chromatografie stap (10% aceton / cyclohexaan elutie). Getallen op de TLC-plaat hebben betrekking op de reageerbuis breuk-nummer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De klassieke procedure voor het isoleren van eugenol van kruidnagel door stoomdestillatie is onderdeel van het programma laboratorium tussenliggende scheikunde aan de Universiteit van Sydney geweest voor decennia maar werd gemoderniseerd om PHWE methodologie in 2016 (Figuur 1) tewerk te stellen. 9 , 18 dit leverde een aantal voordelen. In de eerste plaats met behulp van huishoudelijke espressomachines in de labo-omgeving onmiddellijk gefascineerd en studenten in dienst genomen door de toepassing van een niet-klassieke, alternatieve methode om een traditionele wetenschappelijke studie te illustreren. Bovendien, deze nieuwe methode verminderd de tijd genomen om de extractie te voltooien en ingeschakeld de opneming van aanvullende oefeningen in deze nieuwe iteratie van het experiment. In het bijzonder hierdoor dunne-laag chromatografie (TLC) worden ingevoerd (en kolom-chromatografie flash voor gevorderden).
Het experiment zich te concentreren op de PHWE van kruidnagel is ontworpen als een inleidende laboratorium ervaring voor tweede jaar undergraduate scheikunde studenten en om deze reden het functies verklarend onderwijsmethoden. 9 deze prescriptiever, recept-stijl procedure kan studenten met de enigszins beperkte ervaring in de organische chemie om efficiënt de extractie van eugenol van kruidnagel. In dit experiment, worden concepten zoals zuur-base van zure verbindingen, met behulp van TLC ter identificatie van geschikte eluens samenstelling voor chromatografie, en het gebruik van een rotatieverdamper drooggedampt extractie geïntroduceerd of versterkt door een combinatie van on-line pre lab video opleiding en persoonlijke demonstraties. In de aanvullende componenten uitgevoerd tijdens de twee toegewezen sessies, studenten in de geavanceerde stroom van intermediaire chemie ook eugenol en acetyleugenol gescheiden door kolom-chromatografie en bepaald de identiteit van de uitgepakte onderdelen met behulp van TLC. In de tweede sessie, kunnen studenten kritisch de twee scheidingsmethoden vergelijken. In het algemeen konden studenten voltooien van het algehele experiment binnen de toegewezen twee termijnen van vier uur met minimale instructie.
Het experiment te focussen op de PHWE en isolatie van de seselin en (+)-epoxysuberosin van Correa reflexa werd ontwikkeld voor studenten van de derdejaars Bachelor Chemie meer ervaren studenten. Met name was deze oefening leren een resultaat van een studie van oorsprong in het onderzoekslaboratorium. 11 de eerste iteratie van het experiment werd opgenomen in het programma laboratorium derdejaars Bachelor Chemie bij de Universiteit van Tasmanië in 2015. Na twee jaar van revisies en herbeoordeling, werd dit experiment uitgevoerd door een derde jaar undergraduate klasse voor de derde keer in 2017.
Dit experiment werd specifiek ontworpen als een begeleide-onderzoek gebaseerde activiteit die streeft naar het simuleren van sommige van de benaderingen die werkzaamheden in loondienst in de onderzoekslaboratoria van natuurlijke producten en functies minimale schriftelijke instructies. Dit is een student-geleide leerervaring en de laboratorium-instructeur speelt een sleutelrol in het bijstaan van de studenten als ze via het experiment werken doordat richting zoals vereist. In dit experiment, studenten ontwikkelen van belangrijke Laboratoriumvaardigheden chromatografie en NMR-spectroscopie voor het uitvoeren van de opheldering van de structuur in dienst. De ervaring van dit laboratorium versterkt het concept van bioprospecting die wordt uitgereikt aan studenten in de klas en dit kan worden uitgebreid tot studies over eerder ongedwongen plantaardig materiaal om te zorgen voor een meer representatieve ervaring van natuurlijke producten bioprospecting. C. reflexa is een Australische endemische plantensoorten, echter dit voorbeeld kan worden vervangen voor geschikte blad materiaal uit andere soorten terrestrische planten in dit experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de School of Natural Sciences - chemie, Universiteit van Tasmanië en de School in de chemie, de Universiteit van Sydney voor financiële steun. B.J.D. en J.J. bedanken de Australische regering voor onderzoek Training programma beurzen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| espresso machines | Breville/Sunbeam | Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II | |
| rotary evporators | Buchi and Heidolph | ||
| cloves (plant material) | Dijon Food Pty Ltd | Cloves must be ground in a food processor for students. | |
| Correa reflexa (plant material) | sample obtained in Tasmania | Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania | |
| sand | Ajax | 1199 | |
| ethanol | Redoc Chemicals | E95 F3 | |
| hexanes | Ajax | 251 | |
| magnesium sulfate | Ajax | 1548 | |
| diethyl ether | Merck | 1009215000 | |
| silica on aluminium TLC plates | Merck | 1055540001 | |
| eugenol | Merck | 1069620100 | |
| eugenyl acetate | Aldrich | W246905 | |
| acetone | Redox Chemicals | Aceton13 | |
| cyclohexane | ChemSupply | CA019 | |
| silica gel 60 | Trajan | 5134312 | 40 - 63um (230-400mesh) |
| Congo red paper | ChemSupply | IS070-100S | |
| 32% hydrochloric acid | Ajax | 256 |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
- Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
- DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
- Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
- Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
- Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
- Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
- Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
- Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
- Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
- Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
- Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
- Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
- Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
- Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
- Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
- Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
- Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. , 2923-2925 (1978).
