Summary
Aquí, utilizamos un método de extracción (PHWE) de agua caliente a presión, que utiliza una máquina de espresso hogar sin modificar para introducir a estudiantes a la química de productos naturales en el laboratorio. Se presentan dos experimentos: PHWE de eugenol y acetyleugenol de dientes y PHWE de seselin y (+)-epoxysuberosin de la planta australiana Correa reflexa.
Abstract
Un método de extracción (PHWE) recientemente desarrollado agua caliente a presión que utiliza una máquina de espresso hogar sin modificar para facilitar la investigación de productos naturales también ha encontrado aplicaciones como una herramienta de enseñanza eficaz. Específicamente, esta técnica se ha utilizado para introducir a estudiantes de segundo y tercer año en aspectos de la química de productos naturales en el laboratorio. En este informe, se presentan dos experimentos: el PHWE de eugenol y acetyleugenol de dientes y el PHWE de seselin y (+)-epoxysuberosin de las especies de plantas endémicas de Australia Correa reflexa. Empleando PHWE en estos experimentos, se obtuvo el extracto de clavo crudo, enriquecido en eugenol y acetyleugenol, en 4-9% w/w de dientes por estudiantes de segundo año y seselin y (+)-epoxysuberosin se aislaron en los rendimientos de hasta 1,1% w/w y 0,9% w/w de C. reflexa por estudiantes de tercer año. El ejercicio anterior fue desarrollado como un reemplazo para el experimento de destilación de vapor tradicional proporciona una introducción a las técnicas de extracción y separación, mientras que esta última actividad contó con métodos de enseñanza de investigación guiada en un esfuerzo por simular bioprospección en productos naturales. Esto deriva principalmente de la naturaleza rápida de esta técnica PHWE en relación con los métodos de extracción tradicionales que a menudo son incompatibles con las restricciones de tiempo asociadas con experimentos de laboratorio pregrado. Este método rápido y práctico de PHWE puede utilizarse para aislar eficientemente varias clases de moléculas orgánicas de una variedad de especies de plantas. El carácter complementario de esta técnica en relación con los métodos más tradicionales también se ha demostrado previamente.
Introduction
El aislamiento e identificación de los productos naturales son de fundamental importancia para la comunidad científica y la sociedad en general. 1 bioprospección, la búsqueda de moléculas orgánicas valiosas en la naturaleza, sigue siendo un proceso indispensable en el descubrimiento de nuevos contactos de drogas y agentes terapéuticos potenciales. Se estima que, desde 1981-2014, ~ 75% de fármacos de molécula pequeña aprobado todos productos naturales, natural naturales o derivados de productos producto-inspiraron. 1 además, productos naturales poseen gran diversidad estructural y química. Por este motivo, representan también andamios químicos valiosos que pueden ser utilizados directamente en síntesis orgánica o en el desarrollo de ligandos quirales y catalizadores. 2 , 3
Tradicionalmente, los procedimientos relativamente mucho tiempo como la maceración, extracción Soxhlet y destilación de vapor han sido el pilar de la investigación que se centró en el aislamiento de metabolitos secundarios de las plantas. 4 técnicas de extracción más modernas, incluyendo extracción acelerada con disolventes, se han centrado en reduciendo los tiempos de extracción y establecer protocolos más verde. 4 , 5 en el 2015, informó un método original de extracción (PHWE) de agua caliente a presión. 6 esta técnica emplea una máquina espresso hogar sin modificar para facilitar la extracción rápida y particularmente eficaz de Ácido shikímico de anís estrellado. Máquinas de café han sido específicamente diseñadas y diseñado para extraer las moléculas orgánicas de café debidamente molidos. Para lograr esto, estos instrumentos calentar agua a temperaturas hasta 96 ° C y a presiones de típicamente 9 bar. 7 con esto en mente, tal vez no es sorprendente que máquinas de café expreso pueden ser utilizadas para extraer eficientemente productos naturales de una gama de material vegetal.
Estudios posteriores que involucran una variedad de especies vegetales terrestres han demostrado la capacidad de esta técnica PHWE para extraer eficientemente productos naturales a través de una gama relativamente amplia de la polaridad. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 además, compuestos que contienen grupos funcionales algo sensibles, tales como aldehídos, epóxidos, glucósidos y potencialmente epimerizable stereogenic centros eran generalmente inafectados por el proceso de extracción. También se ha demostrado el carácter complementario de esta técnica en relación con los métodos más tradicionales. 12 , 16 método PHWE este también se ha empleado para aislar cantidades de varios gramos de productos naturales, que han sido utilizados para preparar derivados de nuevos productos naturales y en la síntesis de la molécula compleja en términos más generales. 8 , 11 , 17
Se identificó que este nuevo método PHWE podría servir como herramienta de enseñanza útil que se podría incorporar en el laboratorio de pregrado. Esto deriva principalmente de la naturaleza rápida de esta técnica en relación con los métodos de extracción tradicionales que a menudo son incompatibles con las restricciones de tiempo asociadas con experimentos de laboratorio pregrado. En consecuencia, esta técnica suplantó el experimento de laboratorio de química licenciatura tradicional centrado en la extracción del eugenol de clavo empleando la destilación de vapor de la Universidad de Tasmania. 9 , 18 desde entonces, las variaciones de este experimento han sido adoptadas por otras universidades y un experimento modificado enfocando la PHWE de dientes ahora funciones en el programa de laboratorio de química Licenciatura en la Universidad de Sydney (vide infra ).
Para demostrar la funcionalidad y viabilidad de emplear este nuevo enfoque PHWE para fines de enseñanza, se presentan dos protocolos como parte de este estudio. La primera parte de este informe pone de relieve un experimento en el PHWE de eugenol y acetyleugenol de dientes que es parte del programa de laboratorio de pregrado de segundo año en la Universidad de Sydney (figura 1). Este experimento sirve para introducir a los estudiantes a la química de productos naturales en el desarrollo de habilidades prácticas fundamentales. La segunda parte presenta un experimento en el PHWE de las especies de plantas endémicas de Australia Correa reflexa que forma parte del programa de pregrado laboratorio de tercer año de la Universidad de Tasmania (figura 2). Este experimento está diseñado para simular la bioprospección de productos naturales y reforzar las técnicas de laboratorio core. 11
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Protocol
Nota: Es recomendable que todos los procedimientos se llevan a cabo en una campana de humos. Los estudiantes deben usar equipo de protección personal en todo momento en el laboratorio y las hojas de seguridad (SDS) asociadas con cada reactivo deben ser consultadas antes de usar.
1. PHWE de clavos: aislamiento de eugenol y acetyleugenol
- Extracción del eugenol y acetyleugenol de dientes
- Colocar groseramente molidos (12,5 g) en un vaso de precipitados de 250 mL.
- Añadir arena (12.5 g) para el clavo de olor molido y mezclar bien.
- Recoger un portafiltro (compartimento) y cargue la canasta con toda la mezcla de clavo de olor-arena. Comprimir ligeramente la muestra con el tamper.
Nota: No comprimir la mezcla demasiado o líquido no fluirá a través. - Coloque el portafiltro en la máquina de espresso y coloque un vaso de precipitados de 250 mL limpio debajo de él. Añadir una solución al 30% etanol/H2O al tanque de agua de la cafetera si es menos de la mitad.
- Utilizar la máquina de espresso para recoger 100 mL del extracto.
Nota: Consulte a un instructor si la máquina parece estar tapado. - Permita que el portafiltro terminar goteo y retire de la máquina de café espresso.
PRECAUCIÓN: Las rutinas y sus alrededores metal estará calientes. - Con una espátula, retire el clavo de olor molido en el portafiltro y deséchela en el cubo de la basura.
- Enjuague los residuos sólidos desde el portafiltro con H2O bajo un grifo en el fregadero y volver para la siguiente persona que utilice.
- Fría el diente de extracto en un baño de hielo hasta que la temperatura ha reducido a menos de 30 ° C.
- Colocar el extracto en un matraz de 250 mL, agregar 30 mL de hexano y agitar suavemente.
- El embudo en una abrazadera de anillo montado en un soporte de retorta y permitir que las capas acuosas y orgánicas separar y recoger la capa acuosa (inferior) en el vaso de precipitados de 250 mL.
Nota: Puede tardar 10 minutos para las capas separar. Aconsejan los estudiantes para llevar a cabo la optimización solvente de TLCs esperando la primera separación que se produzca (ver pasos 1.2). - Transferir la capa orgánica (superior) (que contiene el producto) a un erlenmeyer limpio de 250 mL y luego Vierta la capa de fondo (acuoso) en el matraz.
- Extraer la capa acuosa otras dos veces con hexano (2 x 30 mL).
- Combinar las capas orgánicas (superiores) en el mismo frasco después de cada extracción.
- Después de la tercera extracción líquido-líquido, vierta el extracto orgánico combinado en el matraz de filtración y lavado con 100 mL de H2O agitando con fuerza. Recoger la capa orgánica (superior) en un erlenmeyer de 250 mL limpio y seco añadiendo MgSO4 y girando el frasco.
- Filtrar la mezcla resultante a través de papel de filtro estriado contenida en un embudo de vidrio a un matraz de fondo redondo de 250mL previamente tarado.
Nota: El residuo sólido (hidratada MgSO4) puede ser desechado en la basura. - Evaporar el disolvente (hexano) del filtrado recogido usando un evaporador rotatorio (temperatura del baño de agua: 60 ° C, presión de vacío: 350 mbar) y volver a pesar el matraz que contiene el aceite resultante.
- Optimización del sistema de solventes cromatografía en capa fina (TLC)
Nota: Como grupo, los estudiantes se asignarán un sistema solvente de acetona: ciclohexano 100: 0 a 0:100 acetona: ciclohexano por el instructor que identifiquen la relación que proporciona la máxima resolución de eugenol de acetyleugenol.- Obtener una solución de referencia de TLC de eugenol puro y acetyleugenol.
Nota: Las soluciones de referencia de TLC necesarias de eugenol puro y acetyleugenol fueron preparadas por técnicos de laboratorio antes de la sesión de laboratorio. - En una placa de TLC, marque una línea de base ~1.5 cm desde la parte inferior con un lápiz suave. Marcar tres puntos equidistantes.
- Utilice un spotter de TLC para detectar una gota de solución de referencia de eugenol puro TLC en un carril, un lugar de pura acetyleugenol TLC solución de referencia en el tercer carril y un punto de cada uno en el segundo carril (el punto Co).
- Comprobar la presencia de eugenol y acetyleugenol en la placa de TLC mediante la visualización de la placa bajo una lámpara ultravioleta (254 nm) en el TLC viendo el gabinete.
Nota: Debe haber manchas negras de pequeño (1-2 mm de ancho) en la placa donde las soluciones de referencia de TLC fueron vistas. Si no hay puntos o los puntos débiles, aplicar otro punto de la solución adecuada de TLC hasta que una mancha negra se observa bajo luz ultravioleta. - Añadir 10 mL de la mezcla solvente asignada a un frasco limpio y seco del TLC.
Nota: Asegúrese que la altura del solvente en el frasco no supere ~ 1 cm. - Utilizando pinzas, coloque la placa de TLC preparada en la jarra de TLC. Cierre la tapa de la jarra.
Nota: El disolvente debe estar por debajo de la línea de fondo de la placa de TLC. - Deje que el solvente que viajes hasta la placa de TLC. Una vez que el solvente es ~ 1 cm desde la parte superior de la placa, retire la placa de TLC del frasco con una pinza y marque la línea del frente del disolvente con lápiz.
- Permitir que el solvente que se evapora de la placa de TLC (~ 1 min) y luego ver la placa de TLC bajo una lámpara ultravioleta (254 nm). Utilizando un lápiz, círculo de los puntos negros en la placa de TLC.
- Calcular el factor de retención (Rf) de eugenol y acetyleugenol dividiendo la distancia recorrida por el compuesto por la distancia recorrida por el disolvente.
- Calcular la diferencia entre los valores def de R de eugenol y acetyleugenol (ΔRf).
- Compartir los resultados con el resto de la clase. Registrar los valores de retención adquiridos por otros estudiantes con otras proporciones de solvente.
- Identificar que sistema solvente será mejor analizar la solución cruda de eugenol y pasos subsecuentes de la purificación.
Nota: La mejor relación solvente TLC proporcionará la mayor separación entre el eugenol y acetyleugenol por el mayor valor def ΔR. Si ΔRf se traza contra la composición del solvente, el gráfico debería parecerse a una curva de campana.
- Obtener una solución de referencia de TLC de eugenol puro y acetyleugenol.
- Separación de eugenol y acetyleugenol por extracción líquido-líquido
- Añadir (10 mL) de hexano al extracto crudo que contengan eugenol obtenido paso 1.1.17 y vierte la solución resultante en un matraz de 250 mL.
- Enjuague el matraz de fondo redondo con hexano (10 mL) y añadir esto al embudo.
- Extraer la solución de hexano con 3 M de NaOH acuosa (2 x 25 mL) a través de la extracción líquido-líquido. Recoger y combinar las capas de base acuosa en un erlenmeyer de 250 mL de cada extracción. Recoger la capa orgánica en un erlenmeyer de 50 mL y secar añadiendo MgSO4 y girando el frasco.
PRECAUCIÓN: El NaOH es corrosivo. Evitar cualquier contacto con la piel.
Nota: Acetyleugenol permanece en la capa orgánica, mientras que el eugenol es ahora en el extracto acuoso alcalino (capas inferiores). - Retener lo orgánico capa (solución orgánica A) para su posterior análisis de TLC.
- Agitar el erlenmeyer que contiene la fracción acuosa alcalina de paso 1.3.3 en un baño de hielo-agua y añada lentamente 10 M HCl acuoso hasta que se forma una emulsión blanca; Compruebe su acidez con papel rojo Congo con una pipeta para transferir una gota de la solución en el papel de pH (debe resultar azul).
PRECAUCIÓN: el ácido clorhídrico es corrosivo. Evitar cualquier contacto con la piel. Adición de ácido clorhídrico puede causar burbujeo vigoroso, HCl se debe agregar con cuidado, manteniendo el frasco cónico en el hielo.
Nota: Un total de 20-30 mL de HCl (10 M de una solución acuosa) se requiere. - Extracto de la emulsión acuosa lechosa con hexano (2 x 30 mL), usando extracción líquido-líquido de 250 mL matraz de separación. Asegúrese que la temperatura del extracto acuoso a temperatura ambiente o inferior antes de agregar el hexano. Combinar los dos extractos de hexano en un erlenmeyer de 100 mL limpio.
Nota: El eugenol estará ahora en el combinado orgánico (top) capas (solución orgánica B). - Añadir MgSO4 para que se seque la solución orgánica B.
- Analizar la solución orgánica A, solución orgánica B, referencia de TLC de eugenol puro y acetyleugenol TLC por TLC con la proporción de solvente optimizada de TLC identificada en la sesión anterior.
- Filtrar la solución orgánica A y B a través de papel filtro estriado en separado matraces de fondo redondo de 250mL previamente pesados. Deseche el residuo sólido (hidratada MgSO4) en los residuos.
- Quite el solvente de los matraces de fondo redondo utilizando un evaporador rotatorio (temperatura del baño de agua: 60 ° C, presión de vacío: 350 mbar).
- Añadir éter dietílico (5 mL) en cada matraz de fondo redondo y transferir la acetyleugenol purificada (solución orgánica A) y eugenol (solución orgánica B) en un frasco sin etiqueta, previamente utilizando un embudo.
- Enjuague el matraz con más éter dietílico (5 mL) en el frasco. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio (temperatura del baño de agua: 50 ° C, presión de vacío 800 mbar) con un adaptador para vial. Registrar el rendimiento y etiquetar el frasco apropiadamente.
- Analizar la solución orgánica A, solución orgánica B, referencia de TLC de eugenol puro y acetyleugenol TLC por TLC con la proporción de solvente optimizada de TLC identificada en la sesión anterior.
Nota: Soluciones acuosas pueden ser vertidas el fregadero para su eliminación. Hexano y éter de desechos deben eliminarse en las botellas de residuos orgánicas no clorados.
2. PHWE de Correa reflexa : aislamiento de seselin y (+)-epoxysuberosin
-
Sesión 1. PHWE de Correa reflexa
- Correa reflexa hojas (10 g) de moler en un molinillo eléctrico de especias y luego transferir el material de planta de la tierra a un vaso de precipitados de 250 mL.
Nota: Pulido debe tomar 20-30 segundos. - Añadir ~ 2 g de arena gruesa en el vaso que contiene el material vegetal.
- Mezcla y el paquete en la canasta del portafiltro (compartimento). Comprimir la muestra con el tamper.
Nota: No el paquete de la muestra demasiado. - Añadir ~ 300 mL de solución al 35% etanol/H2O para el depósito de la máquina de espresso.
- Coloque el portafiltro en la máquina de espresso y coloque un vaso de precipitados de 250 mL limpio debajo de él.
- Recoger ~ 100 mL de extracto, espere ~ 1 minuto y luego cobrar un adicional 100 mL.
PRECAUCIÓN: La máquina y extractos estará calientes en este momento. - Enfriar la mezcla en baño de hielo y se evapore el etanol usando un evaporador rotatorio (temperatura del baño de agua: ~ 40 ° C).
- Transferir el extracto acuoso a un matraz y extraer con acetato de etilo (4 x 50 mL).
Nota: Puede necesitarse tiempo para permitir emulsiones separar entre extracciones. - Combinar los extractos orgánicos secos añadiendo MgSO4 y remolino el matraz, filtrar con un embudo de vidrio sinterizado y evaporar utilizando un evaporador rotatorio (temperatura del baño de agua: ~ 35 ° C) para proporcionar el extracto crudo.
- Obtener un espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H (ver al instructor para asistencia). 11
- Realizar análisis de TLC del extracto crudo para determinar un sistema solvente adecuado para aislar los compuestos que han sido extraídos.
Nota: Se realizan análisis de TLC por analogía a los procedimientos descritos en el paso 1.2.
- Correa reflexa hojas (10 g) de moler en un molinillo eléctrico de especias y luego transferir el material de planta de la tierra a un vaso de precipitados de 250 mL.
-
Sesión 2. Separación de seselin y (+)-epoxysuberosin por cromatografía de columna flash11,19
Nota: El siguiente protocolo implica el uso de cromatografía en columna flash para la separación de compuestos orgánicos. Consulte con un instructor para demostrar cómo empacar una columna flash gel de sílice.- Lugar la columna (~ 30 mm de diámetro) en una pinza montado en un soporte de retorta. Coloque un matraz cónico de 100 mL debajo de la columna.
- Llenar la columna con gel de sílice (60 μm flash grado) a un nivel de ~ 10 cm y luego añadir hexanes (~ 100 mL) a la columna.
- Colocar un tapón de vidrio en la columna, quitar la columna de la abrazadera y agitar para obtener una mezcla. Colocar la columna en la pinza y luego deje que la mezcla a colocar.
- Abrir el grifo de la columna y, utilizando un adaptador de gas conectada a una línea de aire comprimido, vacíela la columna para salir de ~ 2 mm de solvente sobre la cama de gel de silicona. Quite el adaptador de gas y cerrar el grifo.
- Use el hexanes recolectados en el frasco cónico (~ 5 mL) para lavar abajo cualquier gel de sílice de las paredes de la columna con una pipeta Pasteur con una membrana de goma.
- Repita el paso 2.2.4 entonces añadir una pequeña capa de arena (~ 1 cm) a la columna.
- Añadir diclorometano (~ 1mL) en el matraz que contiene el crudo extraído paso 2.1.9. Con cuidado coloque la solución resultante sobre la columna utilizando una pipeta Pasteur con una membrana de goma. Abrir el grifo de la columna y la muestra para sobre el gel de sílice.
- Repita el paso 2.2.7 otras dos veces.
- Cuidadosamente añadir hexanes (20 mL) a la columna. Repita el paso 2.2.4.
- Añadir cuidadosamente (~ 180 mL de una solución de acetato de etilo/hexanes 15%). Abierto el grifo de la columna y mediante un adaptador de gas unido a una línea de aire comprimido, vacíela la columna para salir de ~ 2 mm de solvente sobre la cama de gel de sílice, que recoge las fracciones en tubos de ensayo de 10 mL.
Nota: Esto permitirá seselin a aislarse. - Combine las fracciones de tubo de ensayo que contiene seselin en un matraz de fondo redondo de 250 mL y evaporar utilizando un evaporador rotatorio (temperatura del baño de agua: ~ 35 ° C).
Nota: Análisis de TLC se utilizan para determinar esto y se realizan por analogía a los procedimientos descritos en el paso 1.2. - Añadir cuidadosamente (~ 75 mL de una solución de acetato de etilo/hexanes 25%). Abierto el grifo de la columna y mediante un adaptador de gas unido a una línea de aire comprimido, vacíela la columna para salir de ~ 2 mm de solvente sobre la cama de gel de sílice, que recoge las fracciones en tubos de ensayo de 10 mL.
Nota: Esto permitirá a (+)-epoxysuberosin a aislarse. - Combinar las fracciones de tubo de ensayo que contiene (+)-epoxysuberosin en un redondo de 250 mL matraz de fondo y se evapora utilizando un evaporador rotatorio (temperatura del baño de agua: ~ 35 ° C).
Nota: Análisis de TLC se utilizan para determinar esto y se realizan por analogía a los procedimientos descritos en el paso 1.2. - Muestras de los compuestos aislados son analizadas mediante espectroscopia RMN. 11
Nota: Los experimentos de espectroscopia NMR son realizados por un técnico de laboratorio.
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Representative Results
PHWE de clavos. Al intentar realizar el paso de extracción líquido-líquido, los estudiantes encontraron a menudo emulsiones (la adición de la salmuera por lo general no era eficaz). En esta etapa, los estudiantes fueron instruidos para permitir la mezcla de soporte en el embudo mientras que exploraron los efectos de la composición del eluyente en la separación de eugenol y acetyleugenol por el TLC. Cabe señalar que hexano puede sustituirse con heptano o diclorometano en el paso de extracción líquido-líquido. 9 los estudiantes fueron asignados una relación solvente TLC de acetona y ciclohexano y con estándares puros de eugenol y acetyleugenol y luego análisis de TLC (figura 3). Los resultados se tabularon en una pizarra, y se consideraron los efectos de composición solvente sobre el factor de retención (Rf) y el eluyente óptimo en una discusión de grupo (tabla 1). Las composiciones solvente óptimo identificadas por los estudiantes por lo general oscilan entre 5-20% acetona/ciclohexano con un ΔRf entre 0.1-0.2.
Tras la optimización de eluyente TLC, estudiantes regresaron a sus extracciones de eugenol. El extracto de clavo crudo (consiste principalmente en eugenol y acetyleugenol) fue aislado en 4-9% w/w. En la segunda sesión de este experimento, los estudiantes explotan las diferentes propiedades ácido-base de las moléculas orgánicas principales dos separación por extracción líquido-líquido. Por lo general, eugenol fue aislado en una producción de 45-65% w/w del extracto crudo mientras que acetyleugenol se aisló en una producción de 5-10% w/w de extracto crudo. Los estudiantes entonces utilizaron el eluyente optimizado (identificado como se indicó anteriormente) para determinar el éxito de su extracción líquido-líquido por comparación de sus extractos a las muestras de referencia puro por TLC (figura 3). Los estudiantes también analizan su extracto de clavo crudo y sus muestras de eugenol y acetyleugenol purificadas mediante la realización de la espectroscopia infrarrojo de Fourier (FTIR). 9 picos de disolventes o de agua de vez en cuando fueron observadas en espectros de IR debido a procedimientos de trabajo mal ejecutados (o preparación de la muestra pobre).
Estudiantes avanzados comprometidos aproximadamente la mitad de su petróleo crudo aislado para la extracción líquido-líquido descrita arriba y sujeta la otra parte a cromatografía en columna flash (más información se proporciona en la información de apoyo). Aunque completar la extracción líquido-líquido y pasos de cromatografía de columna flash en una sola sesión de cuatro horas puede aparecer algo ambicioso fue alcanzable para la mayoría de los estudiantes avanzados, llevando a cabo este experimento. Raramente se logró la separación completa del eugenol del acetyleugenol por cromatografía de columna flash debido a los factores de retención de cierre (figura 4). Sin embargo, los estudiantes pudieron generalmente recoger unas fracciones que contengan eugenol puro. Se preguntaron a estudiantes avanzados a comentar las dos técnicas diferentes de purificación como parte de su informe.
PHWE de Correa reflexa. Los estudiantes realizan PHWE de Correa reflexa con mínima asistencia del instructor de laboratorio. Durante la etapa de extracción líquido-líquido emulsiones normalmente forman y a menudo se requirieron que los estudiantes permiten la mezcla en el matraz de filtración (~0.25 h) con agitación periódica de la mezcla con una varilla de vidrio. La purificación cromatográfica del extracto crudo concluyó cómodamente dentro de la sesión de cuatro horas de laboratorio por los estudiantes. Seselin y (+)-epoxysuberosin se aislaron en los rendimientos de hasta 1,1% w/w y 0,9% w/w, respectivamente y se analizaron muestras aisladas de ambos compuestos por 1H y 13C RMN y FTIR espectroscopia (figura 2). Mientras los estudiantes llevó a cabo los experimentos de espectroscopia FTIR y muestras preparadas para espectroscopia RMN, técnicos de laboratorio realizaron experimentos de espectroscopia NMR. Los resultados obtenidos por los estudiantes eran constantes con trabajos previamente publicados. 11
Aunque esto no ha sido presentado en este informe, en la práctica, este experimento también cuenta con una segunda parte que desafía a los estudiantes para realizar la extracción de una especie de planta que no ha sido estudiada empleando PHWE (más información se proporciona en el apoyo a la información).
Figura 1. PHWE de clavos. 9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. PHWE de Correa reflexa. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Una placa de TLC representante preparada por un estudiante. (10% acetona / elución de ciclohexano). Carril 1 (E): eugenol estándar; carril 2 (crudo): crudo diente de extracto; carril 3 (A): estándar de acetyleugenol). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| acetona / ciclohexano (%v/v) | significa acetil eugenol Rf | acetil eugenol Rf (σ) | significa eugenol Rf | eugenol Rf (σ) | significa ΔRf | número de análisis de TLC |
| 0 | 0.06 | 0.08 | 0.04 | 0.06 | 0.02 | 12 |
| 5 | 0.34 | 0.11 | 0.27 | 0.09 | 0.07 | 15 |
| 10 | 0.45 | 0.07 | 0.34 | 0.05 | 0.12 | 20 |
| 20 | 0.51 | 0.07 | 0,41 | 0.06 | 0.10 | 20 |
| 30 | 0.58 | 0.10 | 0.49 | 0.12 | 0.10 | 19 |
| 40 | 0,63 | 0.08 | 0,56 | 0.08 | 0.07 | 16 |
| 50 | 0,76 | 0.08 | 0.73 | 0.08 | 0.03 | 17 |
| 60 | 0.77 | 0.13 | 0.73 | 0.15 | 0.04 | 12 |
| 70 | 0.84 | 0.13 | 0.81 | 0.13 | 0.03 | 11 |
| 80 | 0.90 | 0.06 | 0.87 | 0.08 | 0.02 | 10 |
| 90 | 0.88 | 0.06 | 0.87 | 0.05 | 0.01 | 11 |
| 100 | 0.87 | 0.13 | 0.86 | 0.14 | 0.02 | 6 |
Tabla 1. Tabla de factores de retención que el efecto de la composición del eluyente en Rf.
Figura 4 . Placas de TLC representante preparadas por los estudiantes. Izquierda: Una TLC placa analizando los resultados de la etapa de extracción líquido-líquido (10% acetona / elución de ciclohexano). Carril 1 (E): estándar de referencia eugenol; carril 2 (LEB): Extracto de eugenol que contienen orgánico; carril 3 (A): estándar de referencia acetyleugenol; carril 4 (LEN): extracto orgánico que contiene acetyleugenol. Derecha: Una TLC placa analizando el resultado del paso de cromatografía de columna flash (10% acetona / elución de ciclohexano). Números en la placa de TLC se refieren al número de fracción in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El procedimiento clásico para aislar el eugenol de clavo por destilación de vapor ha sido parte del programa de laboratorio de química intermedia en la Universidad de Sydney por décadas pero fue modernizado para emplear metodología PHWE en 2016 (figura 1). 9 , 18 Esto proporcionó un número de beneficios. En primer lugar, cafeteras domésticas en el ambiente de laboratorio inmediatamente fascinado y participan a los estudiantes ilustrando la aplicación de un método no clásico, alternativa para efectuar un estudio científico tradicional. Además, este nuevo método reduce el tiempo necesario para completar la extracción y permitió la incorporación de ejercicios adicionales en esta nueva iteración del experimento. Específicamente, esto permitió a cromatografía en capa fina (TLC) para introducir (y el flash cromatografía en columna para estudiantes avanzados).
El experimento enfocando la PHWE de dientes fue diseñado como un laboratorio introductorio para los estudiantes de segundo año pregrado química y por esta razón los métodos de enseñanza expositivo características. 9 este más prescriptivo, receta estilo procedimiento permite a los estudiantes con experiencia limitada en química orgánica para completar eficientemente la extracción del eugenol de clavo de olor. En este experimento, conceptos como la extracción de la ácido-base de compuestos ácidos, utilización de TLC para identificar la composición del eluyente adecuado para cromatografía y el uso de un evaporador rotativo introducidos o reforzados por una combinación de video on-line de pre-laboratorio manifestaciones de la formación y en persona. Componentes complementarios realizados durante las dos sesiones asignadas, los estudiantes en la corriente de avanzada de la química intermedia también separaron eugenol y acetyleugenol por cromatografía de columna y determinaron la identidad de los componentes extraídos utilizando el TLC. En la segunda sesión, los estudiantes podrían comparar críticamente los métodos de separación de dos. En general, los estudiantes fueron capaces de completar el experimento global dentro de los asignados dos períodos de cuatro horas con instrucción mínima.
El experimento enfocando la PHWE y aislamiento de seselin y (+)-epoxysuberosin de Correa reflexa fue desarrollado para estudiantes de pregrado química de tercer año de los estudiantes más experimentados. En particular, este ejercicio de aprendizaje fue el resultado de un estudio que se origina en el laboratorio de investigación. 11 la primera iteración del experimento fue incorporada en el programa de laboratorio de química grado tercer año de la Universidad de Tasmania en 2015. Después de dos años de revisiones y reevaluación, este experimento fue realizado por una clase de estudiantes de tercer año por tercera vez en el año 2017.
Este experimento fue diseñado específicamente como una actividad guiada-investigación-basado que se esfuerza por simular algunos de los métodos empleados en laboratorios de investigación de productos naturales y características mínimas las instrucciones escritas. Se trata de una experiencia de aprendizaje dirigido por el estudiante y el instructor de laboratorio desempeña un papel clave en ayudar a los estudiantes mientras trabajan a través de la experiencia proporcionando la dirección según sea necesario. En este experimento, los estudiantes desarrollan habilidades clave laboratorio en cromatografía y emplean la espectroscopia de RMN para realizar la aclaración de la estructura. Esta experiencia de laboratorio refuerza el concepto de bioprospección que se presenta a los estudiantes en el aula y esto puede ser extendido a estudios sobre el material vegetal previamente estudiadas para proporcionar una experiencia más representativa de los productos naturales Bioprospección. C. reflexa es una especie de planta endémica de Australia, sin embargo, esta muestra puede sustituirse por material apropiado hoja de otras especies de plantas terrestres en este experimento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen la Facultad de Ciencias naturales - química, Universidad de Tasmania y la escuela de química de la Universidad de Sydney para apoyo financiero. B.J.D. y J.J. gracias al gobierno australiano para becas de programa de formación de investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| espresso machines | Breville/Sunbeam | Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II | |
| rotary evporators | Buchi and Heidolph | ||
| cloves (plant material) | Dijon Food Pty Ltd | Cloves must be ground in a food processor for students. | |
| Correa reflexa (plant material) | sample obtained in Tasmania | Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania | |
| sand | Ajax | 1199 | |
| ethanol | Redoc Chemicals | E95 F3 | |
| hexanes | Ajax | 251 | |
| magnesium sulfate | Ajax | 1548 | |
| diethyl ether | Merck | 1009215000 | |
| silica on aluminium TLC plates | Merck | 1055540001 | |
| eugenol | Merck | 1069620100 | |
| eugenyl acetate | Aldrich | W246905 | |
| acetone | Redox Chemicals | Aceton13 | |
| cyclohexane | ChemSupply | CA019 | |
| silica gel 60 | Trajan | 5134312 | 40 - 63um (230-400mesh) |
| Congo red paper | ChemSupply | IS070-100S | |
| 32% hydrochloric acid | Ajax | 256 |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
- Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
- DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
- Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
- Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
- Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
- Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
- Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
- Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
- Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
- Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
- Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
- Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
- Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
- Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
- Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
- Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
- Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. , 2923-2925 (1978).
