Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת ביעילות הומו - ו heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק, בנוסף לשיטות של דגימה רקמה, דור נתונים, ניתוח נתונים, עבור החקירה של הקור מגיבים מיקרו Rna.
Abstract
Rna (miRNAs) הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs של בערך 20-24 nt, ידוע תפקיד חשוב ב מפעל פיתוח והתאמה. ראיות המצטבר מראה כי הביטויים של miRNAs מסוימים הם שינו בעת השתלת עור, תרגול החקלאי בשימוש נפוץ על ידי חקלאים לשיפור יבול עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים. דלעת הבקבוק הוא חיתוך גמיש מטבעו האקלים לעומת רבים אחרים הגדולות cucurbits, לרבות אבטיח, טיוח זה לאחד כנות הנפוצה ביותר עבור האחרון. לקידום טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה האחרונות סיפקה הזדמנויות גדולות לחקור miRNAs קר מגיב ותרומתם יתרונות heterograft; ובכל זאת, שגרות ניסיוני נאותה הן תנאי הכרחי למטרה זו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת ביעילות הומו - ו heterografts בין אבטיח קר, רגישים את הדלעת בקבוק קר-סובלנית, בנוסף לשיטות של דגימה רקמה, דור נתונים, ניתוח נתונים. השיטות הציג שימושיים גם למערכות אחרות מפעל הרכבה, לחקור miRNA תקנות תחת לחצים סביבתיים שונים, כגון חום, יובש, מליחות.
Introduction
הרכבה זמן כבר מועסקים כ טכניקה חקלאית כדי לשפר את ייצור יבול, עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים1,2,3. במערכות heterografting, כנות האליטה יכול לשפר את ספיגת מים וחומרים מזינים של צמחים לחיזוק עמידות בפני פתוגנים בקרקע, להגביל את ההשפעות השליליות של מתכות רעילות4,5, אשר עשויה לתת השתלים משופרת מרץ צמיחה, עמידות מוגברת בפני לחצים סביבתיים. במקרים רבים, heterografting יכול גם להשפיע איכויות פרי בצמחים הגננות, שמוביל בטעם פירות משופרת ותכניה מוגברת תרכובות הקשורים לבריאות6,7. זה נמצא כי העברת הבינעירוניים phytohormones, RNAs, פפטידים וחלבונים בין את כנות הנצר הוא מנגנון בסיסי להתכוונן את הצמיחה ואת פיתוח התכנות של נצר צמחים8,9 ,10. הרכבה כבר בשימוש נרחב במחקרים של איתות הבינעירוניים ואמצעי התחבורה ביחס הסתגלות סביבתית11. ניסויים הרכבה חזקים במיוחד לצורך זיהוי ברורה וחד משמעית של מולקולות המשודרת בקבלת רקמות או sap כלי הדם, ואת ההפעלה או דיכוי של מטרות מולקולריות עקב אות שידור12.
Non-קידוד RNAs, מחזור גדול של RNA להפעיל פונקציות חשובות תקינה בתאים, דווחו לשחק תפקיד בקידום הצמח ההסתגלות מתח והאביוטיים13. miRNAs הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs של בערך 20-24 nt. מחקרים גילו תפקיד miRNAs בהיבטים שונים של הצמח פעילות תקינה, כגון כמו יורה צמיחה, לרוחב שורש היווצרות14,15,16, ספיגת התזונתי, סולפט מטבוליזם הומאוסטזיס17, ואת התגובות ביוטיים, והאביוטיים להדגיש18. לאחרונה, הביטוי של miRNAs ואת הגנים היעד שלהם היו קשורות מלח מתח סובלנות שתילי מלפפון heterografted19. השתלים intervariety ענבים, התגובות של miRNA ביטוי למתח הבצורת נמצאו תלויי-גנוטיפ20.
ההתפתחות המהירה של הפחתת העלות של הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף סיפקו הזדמנות גדולה עבור המחקר לתקנות miRNA בצמחים אגרונומיים תחת פיקוח הדוק. אבטיח (אבטיח צמיר [Thunb]. Mansf.), של cucurbit חשוב הגידול ברחבי העולם, היא חשופה בטמפרטורות נמוכות. דלעת הבקבוק (Lagenaria siceraria [מולינה] Standl..) כאכארביט יותר. האקלים-גמישים בשימוש נפוץ על ידי חקלאים כדי להשתיל עם אבטיח. המטרה העיקרית של המחקר הנוכחי הוא לבסס סטנדרט, יעיל, ושיטת נוח להכנת heterografts בין אבטיח (אבטיח צמיר [Thunb]. Mansf.) דלעת הבקבוק (StandlLagenaria siceraria [מולינה]). פרוטוקול זה מספק גם ערכה ניסוי מפורט נהלים אנליטיים לחקר ברגולציה של ביטויים miRNA בעקבות השתלת עור, אשר הוא שימושי עבור חשיפת המנגנונים heterografting יתרונות.
החומרים הצמח השתמשו במחקר זה כוללים את הזן אבטיח את צמחי תרבות מסורתיים דלעת הבקבוק. לדבורי אבטיח הוא זנים מסחריים עם תשואה גבוהה אבל רגישים בטמפרטורה נמוכה. צמחי תרבות מסורתיים דלעת הבקבוק הוא ככנה פופולרי עבור הרכבה עם אבטיח, מלפפון, דלעת, עקב שלה עמידות מעולה של טמפרטורות נמוכות21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיקור וה נביטת הזרעים
- עבור משטח עיקור, משרים את זרעי דלעת הבקבוק בתוך 500-mL מלא מים ב 58 ° C עם ערבוב מדי פעם, עד טמפרטורת המים יורדת ל- 40 מעלות צלזיוס.
- בינתיים, לשים 3 ק ג של אדמת כבול לתוך שקית ניילון, לחטא זה, החיטוי זה 120 ° C/0.5 MPa כעשרים דקות.
- שמור השריית הזרעים דלעת הבקבוק h 4-5 יותר עם אין ערבוב.
- ברגע המים מגיעה לטמפרטורת החדר, יש לשטוף את הזרעים 2 x - x 3 עם מים מזוקקים.
- לנקז את המים העודפים ולאפשר את הזרעים לנבוט בתוך שקית גזה ב 28 מעלות צלזיוס בתוך תא הצמיחה בחושך.
- לאחר נביטה, לזרוע את הזרעים לתוך סירי פלסטיק (6 ס מ קוטר) מלא אדמה כבול מעוקר.
- כאשר השתילים דלעת הבקבוק פיתחו שני פסיגי הזרע שעברו שיטוח, חזור על השלבים 1.1-1.3 עם גרעיני אבטיח.
הערה: ניהול זמן זה מבטיח כי הגודל של נצר, כנות להתאים גם עבור הרכבה מוצלחת.
2. שתיל הצמיחה ואת הרכבה
- גדלים השתילים בתוך תא צמיחה עם מחזור 16-h /8-h אור כהה, שמירה על הטמפרטורה ב- 28 מעלות צלזיוס במהלך היום (אור) וב -22 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (כהה). להשקיית השתילים על-ידי הוספת מים 1 x יום בשעות אחר הצהריים.
- להשתמש בשיטה הרכבה-גזור22 לעשות heterografts השתילים של הדלעת (כנות) הם בשלב עלים אמת אחת ולא פסיגי הזרע של האבטיח (נצר) הופיעו (לא עדיין שעברו שיטוח).
- לחתוך את hypocotyls השתילים אבטיח ב 2-3 ס מ מתחת פסיגי הזרע, ומשאיר העליון של השתילים דלעת הבקבוק באתר מיד מעל האמיתי.
- השתמש קיסם כדי לעשות חור בחלק העליון של השתילים דלעת הבקבוק החתוך. הכנס את השתילים אבטיח החתוך לתוך החורים השתילים דלעת הבקבוק כדי להפוך heterografts.
- השתמש שיטה דומה כפי שהוצג בשלב 2.2 כדי להפוך homografts.
הערה: שילובים הומו -, heterografting צריך תמיד להתבצע בו זמנית (איור 1), אשר, במקרה זה, התוצאות הבאות: דלעת אבטיח/הבקבוק (WB, heterograft), אבטיח/אבטיח (WW, מאותו מין), דלעת הבקבוק /bottle דלעת (BB, מאותו מין).
איור 1: איור של הצירופים שתל ולמבנים צמח המושתל. WB = heterografting דלעת אבטיח/בקבוק; WW = אבטיח/אבטיח homografting; BB = דלעת הבקבוק/בקבוק דלעת הומו-הרכבה; WB-S = נצר עלים של heterografts דלעת אבטיח/בקבוק זה היו שנדגמו; WB-R = כנות עלים של heterografts דלעת אבטיח/בקבוק זה היו שנדגמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
3. ניהול, טיפול קר, postgrafting, דגימה
- שלכדו את השתילים המושתל עם שקיות פוליאתילן שקופה כדי לשמור על לחות גבוהה יחסית ולשמור אותם עבור d 7 בתנאים סביבתיים מחזורים 16-h אור/8-h כהה, שמירה על הטמפרטורה ב- 28 מעלות צלזיוס במהלך היום (אור) וב -22 מעלות צלזיוס במהלך לילה (כהה).
- לחשוף את שקיות פוליאתילן שקוף ביום השביעי. תן שהצמחים גדלים במשך 7-10 ימים תחת אותו תנאים נוספים.
- לחלק את השתילים אחיד בריא לשתי קבוצות, אחת לטיפול קר (הדגיש) ואחת עבור פקד (שאינם הדגיש). עבור קבוצת בקרה, לעזוב את השתילים בבית הבליעה צמיחה אותו (ב 28 ° C) במשך שעה 48 נוספים, ואילו עבור הקבוצה הדגיש קר, להעביר את השתילים תא צמיחה עם טמפרטורת חום קבועה ב 6 ° C, עם תנאים/כהה כפי שמתואר בשלב 2.1.
- לטעום את העלים של הנצר, את כנות מ השתלים (איור 1). להקפיא את הדגימות מיד בחנקן נוזלי ואחסן אותם ב-70 מעלות צלזיוס עד השימוש.
4. ספריית הכנה ורצף תפוקה גבוהה
- להעביר את הדגימות קפוא צינור 2-mL microcentrifuge חנקן נוזלי.
- מוסיפים חרוז מפלדת (5 מ מ קוטר) כל שפופרת המכילה הרקמות.
- Homogenize הרקמות כדי אבקה באמצעות מהמגן מיל חרוז עבור 30 s.
- עבור כל שילוב grafting, לקחת כמויות שוות (0.1 גר') של הקרקע מדגם עשרת השתילים ומערבבים אותם בשפופרת צנטרפוגה 10-mL. להוסיף כמות מספקת של ריאגנט הידרוכלוריד guanidium (טבלה של חומרים) מבוסס על ההצעות של היצרן התואם משקל הרקמה.
- להסיר מציג דנ א גנומי על-ידי הוספת נטולת RNA DNase I U/mL 150 ב 37 ° C עבור 1 h.
- לקבוע את הסכום הכולל כמות ה-RNA על מערכת אלקטרופורזה microcapillary כדי להבטיח את שלמות RNA מספר > 7.0.
הערה: רין > 7.0 מבטיח של יושרה גבוהה של הדגימות RNA. - להכין את ספריות RNA קטנים באמצעות ערכת מסחרי (טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן. השתמש µg 1 של RNA מוחלט בכל דגימה ליזום.
- הפשרה ספריית נורמליזציה ריאגנטים ומתאמי בהתאם להנחיות היצרן. מאתרים ומפסיקים RNAs קטן עם המתאמים יונקות ו 3′ ו elute-לטהר אותם. לאחר מכן, הפוכה לתמלל את יונקות ו 3' מאתרים קטנים RNAs בעקבות הנחיות היצרן.
- לבצע הגברה PCR על פי הפרוטוקול של היצרן. להעריך את האיכות והכמות של ספריות cDNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה microcapillary.
- לטעון µL 1 של ספריית ה-RNA על מערכת אלקטרופורזה microcapillary על מנת להבטיח את רין > 7.0.
- רצף של ספריות RNA קטנים על מכשיר רצף תפוקה גבוהה כמתואר23.
5. miRNA ותחזית ג'ין היעד
- עבור כל שילוב grafting, השתמש הקוד הפתוח UEA sRNA עבודה, שעליו מונחים גרסה 2.4-צמח24 כדי להסיר רצפים באיכות ירודה לקצץ מתאם רצפים של קריאות raw. למחוק את רצפי קטנות יותר 18 nt או הגדולים מ- 32 nt.
- להשוות את רצפי "נקי" באיכות גבוהה למסד הנתונים של קוד פתוח Rfam 11.0 ' כדי לזהות ולהסיר קריאות של rRNA, tRNA, snoRNA ו snRNAs אחרים.
- יישר את קריאות הנותרים כדי הגנום הפניה באמצעות של הכלי יישור רצף קצר-קריאה25. אין אי התאמה מותר בשלב זה.
הערה: מכלול הגנום "97103" אבטיח V126 שימש יישור עם הקריאות מן הנצר, ואת מכלול הגנום "הרץ" דלעת הבקבוק V127 שימש עבור קריאות מן כנות. - להשוות את קריאות הנותרים נגד miRNAs בוגר ידוע miRBase 22.028קוד פתוח. קריאות כי הם הומולוגיים כדי miRNAs ידוע מסווגים miRNAs ההכפלה.
- להשוות את רצפי להיכשל להתאים את מבשרי miRNA ידוע עם רצף הגנום. השתמש האלגוריתם29 MIREAP כדי לזהות פוטנציאל miRNAs הרומן תחת הגדרות ברירת המחדל.
6. ביטוי דיפרנציאלי וניתוח אונטולוגיה ג'ין
- להשוות את רמות הביטוי של miRNAs בהתבסס על ספירת קריאה שלהם. miRNAs עם P-ערך (מבחן המדויק של פישר) < 0.05 וערך > 2 על2 יומן מוחלטת נחשבים לבוא לידי ביטוי באופן שונה.
- השתמש של antisense oligonucleotide היעד באתר מבחר כלי (TargetFinder)30 לחזות mRNAs משלימים פוטנציאליים (miRNA היעד גנים) miRNAs באופן שונה ביטוי תחת פרמטרים ברירת המחדל.
- השתמש אונטולוגיה של ג'ין (ללכת) כלי אנליטי העשרה31 כדי לחשוף את היעד גנים אונטולוגיה של miRNA (קדימה) תבניות תחת P- ערך הסף של 0.05 מובהקות סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2: פנוטיפים שתלי שונים-בטמפרטורת החדר ותנאים הדגיש קר. () לוח זה מראה הומו - שתילים heterografted בטמפרטורת החדר של הפקד. (b) לוח זה מראה הומו - שתילים heterografted לאחר 48 שעות של טיפול קר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באמצעות השיטה המתוארת, השגנו שיעור הצלחה גבוה (הישרדות) של 98% עבור הרכבה. פנוטיפים שתלי שונים-בטמפרטורת החדר ותנאים הדגיש קר מוצגים באיור2. לאחר 48 שעות של טיפול קר, הצמחים אבטיח homografted הראה צמיחה ברורה פיגור עם עלים צעירים נבולה, בעוד הצמחים דלעת הבקבוק homografted, את heterografts דלעת אבטיח/בקבוק הציגו צמיחה נמרצת יותר. סימפטומים של נזק נצפו העלים של heterografts, אשר אפילו ביצועים טובים יותר הצמחים דלעת הבקבוק homografted, שבו נפגעו העלים נכון הנמוך ביותר. תוצאות אלו מדגימים בבירור את היתרון של heterografts משוחח סובלנות קר.
רצפי RNA קטנים של ספריות שמונה הניבו סכום כולל של 258 מיליון קריאות raw. לאחר בקרת איכות (QC), סך של 146 מיליון קריאות המייצגים רצפים ייחודי כ 30 מיליון היו נשמרים (טבלה 1). בהתבסס על קבוצה זו של רצפי sRNA נקי, miRNAs 323, כולל 10 ידוע miRNAs הרומן 313, היו חזה של הדלעת, ולא 20 miRNAs הרומן 802 וידוע כהכרחיים מ watermelon.sRNAs של 24 nt המצאתי את הכיתה הכי גדול של sRNAs ב כל הרכבה שילובים, ללא תלות בטמפרטורת החדר או תנאים הדגיש קר (איור 3).
| טיפול | קוד | לא. קורא | sRNA | |
| סה | ייחודי | |||
| WW-CK | Raw | 30612962 | ||
| לנקות | 19727501 | 3858868 | ||
| למפות גנומית | 19059359 | 3777952 | ||
| BB-CK | Raw | 30845546 | ||
| CK | לנקות | 16832061 | 3787866 | |
| למפות גנומית | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | Raw | 39492123 | ||
| לנקות | 26783053 | 6319473 | ||
| למפות גנומית | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-R | Raw | 23763619 | ||
| לנקות | 10187791 | 1784447 | ||
| למפות גנומית | 8946929 | 1537867 | ||
| WW-CL | Raw | 27557577 | ||
| לנקות | 17879038 | 3336242 | ||
| למפות גנומית | 17153763 | 3259960 | ||
| BB-קלרנית | Raw | 29780991 | ||
| לנקות | 13342206 | 3235570 | ||
| קר | למפות גנומית | 12949972 | 3164329 | |
| WB-CL-S | Raw | 45708415 | ||
| לנקות | 23071845 | 4310276 | ||
| למפות גנומית | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-R | Raw | 30585408 | ||
| לנקות | 19029266 | 3541729 | ||
| למפות גנומית | 17364239 | 3196106 | ||
טבלה 1: סטטיסטיקה של RNAs קטן בשתלים שונים בטמפרטורת החדר או תחת טיפול קר.
איור 3: התפלגות גודל sRNA קורא ב שתלים שונים. () לוח זה מציג שהתפלגות גודל של sRNA קורא ב heterografts תחת שליטה או בתנאי קור. (b) לוח זה מציג שהתפלגות גודל של sRNA קורא ב homografts תחת שליטה או בתנאי קור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
על 48-ה של טיפול קר, 30 ו- 268 miRNAs היו למעלה - downregulated, בהתאמה, העלים של הנצר ב heterografts. זה היה בניגוד חד התוצאות על העלים של כנות, היכן 31 והיו miRNAs רק 12. ואת downregulated, בהתאמה (איור 4). Homografts אבטיח/אבטיח, 64 ו- 83 miRNAs היו. ואת downregulated, בהתאמה. Homografts דלעת מרה דלעת הבקבוק/בקבוק, מספרים אלה היו 30 ו 28. ככל הנראה, heterografting גרם של התכנות עמוקה של הביטויים miRNA. קדימה-העשרה ניתוחים של הגנים בשם היעד של miRNAs ביטוי באופן שונה מזוהה 78 מועשר ללכת תנאי הנצר של heterografts, עם 40 מסווגים תהליכים ביולוגיים, 2 מרכיבי התא, ולאחר 36 לתוך פונקציות מולקולרית (איור 5). מצאנו כי כמה ידוע לך תנאי/מסלולים הקשורים התמרה חושית ההתנגדות ושידור והאביוטיים/ביוטי מתח, למשל, תהליך קטבולי כיטין (ללכת: 0006030, ללכת: 0006032), איתות מופעל אתילן (ללכת: 0009873), פוליאמין תהליך biosynthetic הוחלף נגזר (גו: 0006596), מעבר אותות על ידי זירחון חלבונים (ללכת: 0009755), היו מעורבים. משולב, התוצאות שלנו להציע downregulation של miRNAs, על-ידי כיוונון השפע של התרשימים של הגנים היעד שלהם, עשוי לייצג מנגנון חשוב שבבסיס משופרת סובלנות קר. ב השתלים דלעת אבטיח/בקבוק, heterograft כשלעצמה יש השפעה משמעותית על דפוסי miRNA שיוצרות את היתרונות שתל.
איור 4: השוואה של דפוסי miRNAs ואת downregulated בתגובה שורר עומס קור ב שתלים שונים. WB-S = נצר עלים של heterografts דלעת אבטיח/בקבוק זה היו שנדגמו; WB-R = כנות עלים של heterografts דלעת אבטיח/בקבוק זה היו שנדגמו; WW = את homografts אבטיח/אבטיח; BB = homografts דלעת מרה דלעת הבקבוק/בקבוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ללכת העשרה ניתוחים של הגנים בשם היעד באופן שונה ביטוי miRNAs בהתפתחות של הנצר עוזב של heterografts על מתח קר. WB-CL-S = נצר עלים של heterografts דלעת אבטיח/בקבוק תחת טיפול קר; WB-CK-S = נצר עלים של heterografts דלעת אבטיח/בקבוק בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר בפירוט שיטה יעילה מאוד לשחזור כדי להפוך הומו - heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק. שיטה זו, הדורשים אין ציוד ספציפי, קל מאוד לתפעול וכוללת בדרך כלל שיעור הישרדות מאוד גבוהה של הרכבה. השיטה גם ניתן לבצע שתלים לקבלת cucurbits אחרים, כגון בין אבטיח, מלפפון, דלעת.
ראוי לציין כי הגודל היחסי (גיל) של כנות, נצר הוא קריטי כדי לעשות השתלה מוצלחת (שלב 2.2 פרוטוקול). הבחנו כי אם כנות בשימוש היה גדול מדי בהשוואה הנצר, האיחוד שתל היה קשה יותר לטופס כי הגבעול של הנצר היה מעט בכל יום. על סמך שלנו נתונים קודמים פרוטיאומיה מבנית31, הכללת נצר עצמית המושתל, כנות עצמית המושתל כפקדי מומלץ מאוד (שלב 2.3 לפרוטוקול), כי אז, ניתן לסלק את ההשפעה של הרכבה פציעות במידה רבה.
פרוטוקול זה מספק גם ערכה ניסוי מפורט להליכים הספציפיים ניסיוני עבור חוקרים את abundances של miRNAs במערכת heterografting. שיטה זו גם יהיה מועיל ללימודי במערכות אחרות הרכבה-צמח כדי לחשוף את המנגנונים של רגולציה ושל שיחות חוץ miRNA. נציג תוצאות, מדווחים שינויים הביטוי רק מקומיים miRNAs ב הנצר או כנות בתגובה טמפרטורה נמוכה. דוחות צבירת הדגישו את מעורבותם של שידור RNA קטן לנסיעות ארוכות הרכבה הקשורות לשינויים פנוטיפי. פרוטוקול המובאים כאן, המשלבת השיטות לניתוח נתונים הרכבה, תפוקה גבוהה, יכול לשמש גם לניתוח שידור miRNA בין הנצר את כנות. העיקרון של המבדילים המשודרת miRNAs מ miRNAs מקומי המבוסס על הדמיון בין שלהם רצף הגנום הפניה (כלומר, של miRNA ב הנצר זה יותר כמו הגנום כנות נחשבת ניתן להעביר את כנות, ו ולהיפך).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף. הנתונים רצפי RNA קטנים מופקד על GenBank תחת המספר הצטרפותן SRP136842.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31772191), פרויקט מחקר ענין לציבור, ג'ה-ג'יאנג (2017C 32027), מפתח המדע הפרוייקט של נעשו בג'ה-ג'יאנג (2016C 02051), התכנית הלאומית התמיכה של אנשי עסקים צעירים מעולה (אל P.X.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
