Summary
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per fare in modo efficiente omo - e heterografts tra anguria e zucca bottiglia, oltre ai metodi di campionamento del tessuto, generazione di dati e analisi dei dati, per l'indagine dei microRNA freddo-sensible a reagire.
Abstract
I microRNA (Mirna) sono piccoli RNA non codificanti di circa 20-24 endogeni nt, conosciuto per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di pianta e di adattamento. C'è un'evidenza accumula mostrando che le espressioni di alcuni miRNA sono alterate quando l'innesto, una pratica agricola comunemente utilizzata dagli agricoltori per migliorare la tolleranza delle colture agli stress biotici e abiotici. Zucca del Pellegrino è una coltura intrinsecamente clima-resiliente rispetto a molte altre cucurbitacee principali, tra cui anguria, rendendolo uno dei portinnesti più ampiamente usati per quest'ultimo. Il recente progresso delle tecnologie di sequenziamento ad alte prestazioni ha fornito grandi opportunità per indagare Mirna freddo-sensible a reagire e i loro contributi ai vantaggi heterograft; Eppure, adeguate procedure sperimentali sono un prerequisito per questo scopo. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione efficiente di omo - e heterografts tra l'anguria fredda-sensibili e la zucca bottiglia fredda-tollerante, oltre ai metodi di campionamento del tessuto, generazione di dati e analisi dei dati. I metodi presentati sono anche utili per altri sistemi di impianto-innesto, per interrogare miRNA regolamenti sotto vari stress ambientali, quali calore, siccità e salinità.
Introduction
L'innesto è stato impiegato a lungo come una tecnica agricola per migliorare la produzione vegetale e la tolleranza agli stress biotici e abiotici1,2,3. Nei sistemi heterografting, portinnesti d'eliti possono migliorare l'assorbimento di acqua e sostanze nutritive delle piante, rafforzare la resistenza ai patogeni del suolo e limitare gli effetti negativi della tossicità del metallo4,5, che possono conferire una maggiore gli innesti vigore di crescita e una maggiore tolleranza agli stress ambientali. In molti casi, heterografting possono avere un impatto anche qualità di frutta in piante orticole, che conduce al sapore di frutta migliorata e maggiore contenuto di composti correlati con la salute6,7. È stato trovato che il trasferimento a lunga distanza di fitormoni, RNAs, peptidi e proteine fra il portinnesto e la marza è un meccanismo fondamentale modulando la crescita e lo sviluppo riprogrammazione di scion piante8,9 ,10. L'innesto è stato ampiamente usato negli studi di segnalazione a lunga distanza e trasporto in relazione di adattamento ambientale11. Esperimenti di innesto sono particolarmente potenti per inequivocabile rivelazione di molecole trasmesse nella ricezione del tessuto o vascolare sap e l'attivazione o soppressione di bersagli molecolari a causa di segnale trasmissione12.
RNA non-codificanti, una grande classe di RNA che esercitano importanti funzioni di regolamentazione in cellule, è stati segnalati a giocare un ruolo nel facilitare l'adattamento della pianta a stress abiotici13. i miRNA sono endogeni di piccoli RNA non codificanti di circa 20-24 nt. studi hanno rivelato il ruolo regolatore dei miRNA nei vari aspetti dell'attività degli impianti, così come sparare crescita, laterale radice formazione14,15,16, l'assorbimento di nutrienti, metabolismo di solfato e omeostasi17e risposte a stress biotici e abiotici stress18. Recentemente, l'espressione di Mirna e dei loro geni bersaglio sono stati collegati al sale tolleranza allo stress in piantine di cetriolo heterografted19. Negli innesti di intervariety di uva, le risposte dell'espressione dei miRNA a stress idrico sono state trovate per essere dipendente dal genotipo20.
Il rapido sviluppo e diminuendo il costo della tecnologia di sequenziamento ad alta velocità hanno fornito una grande opportunità per lo studio dei regolamenti di miRNA in piante agronomiche. Cocomero (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), una coltura importante cucurbita in tutto il mondo, è sensibile alle basse temperature. Zucca del Pellegrino (siceraria Lagenaria [Molina] Standl.) è una cucurbita di resilienza del clima più comunemente utilizzata dagli agricoltori per l'innesto con l'anguria. L'obiettivo primario di questo studio è quello di stabilire uno standard, efficiente e conveniente metodo per rendere heterografts tra cocomero (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) e bottiglia zucca (siceraria Lagenaria [Molina] Standl). Questo protocollo prevede inoltre un dettagliato schema sperimentale e procedure analitiche per lo studio della regolazione di miRNA espressioni dopo l'innesto, che è utile per rivelare i meccanismi alla base di vantaggi heterografting.
I materiali vegetali utilizzati in questo studio includono la cultivar di anguria e la zucca bottiglia landrace. Cultivar di anguria è una cultivar commercio con alto rendimento ma sensibili alle basse temperature. Landrace bottiglia zucca è un portinnesto popolare per l'innesto con anguria, cetriolo e bottiglia zucca, grazie alla sua eccellente tolleranza di basse temperature21.
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Protocol
1. sterilizzazione e germinazione del seme
- Per la sterilizzazione superficiale, immergere i semi di zucca bottiglia in un becher da 500 mL con acqua a 58 ° C con agitazione occasionale, fino a quando la temperatura dell'acqua scende a 40 ° C.
- Nel frattempo, mettere 3 kg di terreno della torba in un sacchetto di nylon e, per sterilizzare, autoclave a 120 ° C/0.5 MPa per 20 min.
- Tenete in ammollo i semi di zucca bottiglia per 4-5 h più con nessuna agitazione.
- Una volta che l'acqua raggiunga la temperatura ambiente, sciacquare i semi 2 x - 3 volte con acqua distillata.
- Scolare l'acqua in eccesso e permettere i semi a germogliare in un sacchetto di garza a 28 ° C in una camera di crescita nel buio.
- Dopo la germinazione, seminare i semi in vasi di plastica (6 cm di diametro) riempiti con terreno della torba sterilizzata.
- Quando le piantine di zucca bottiglia hanno sviluppato due cotiledoni appiattiti, ripetere i passaggi 1.1-1.3 con semi di anguria.
Nota: Questa gestione del tempo assicura che le dimensioni della marza e portinnesto corrispondono bene per l'innesto di successo.
2. semenzale crescita e innesto
- Crescere le piantine in una camera di crescita con un ciclo di 16-h luce /8-h scuro, mantenendo la temperatura a 28 ° C durante il giorno (luce) e a 22 ° C durante la notte (scuro). Irrigare le piantine aggiungendo acqua 1 x al giorno nel tardo pomeriggio.
- Utilizzare il metodo cut-innesto22 per rendere heterografts quando i semenzali della zucca bottiglia (rizoma) sono il vero-foglia monostadio e i cotiledoni dell'anguria (scion) sono emersi (non ancora appiattiti).
- Tagliare gli ipocotili le piantine di anguria a 2-3 cm di sotto i cotiledoni, e lascia la parte superiore della bottiglia zucca semenzali nel sito immediatamente sopra il vero.
- Utilizzare uno stuzzicadenti per fare un buco nella parte superiore dei semenzali profilati bottiglia zucca. Inserire le piantine di anguria tagliata nei fori dei semenzali bottiglia zucca per fare heterografts.
- Utilizzare un metodo simile come presentato nel passaggio 2.2 per rendere gli omotrapianti.
Nota: Combinazioni di omo - e heterografting devono sempre essere eseguite simultaneamente (Figura 1), che, in questo caso, si traduce nei seguenti: anguria/bottiglia zucca (WB, heterograft), anguria/cocomero (WW, omotrapianto) e bottiglia zucca /bottle zucca (BB, omotrapianto).
Figura 1: illustrazione delle combinazioni di innesto e le strutture di piante innestate. WB = heterografting di zucca cocomero/bottiglia; WW = homografting anguria/cocomero; BB = bottiglia zucca/bottiglia zucca homo-innesto; WB-S = foglie rampollo dell'heterografts di zucca cocomero/bottiglia campionate; WB-R = portinnesto foglie dell'heterografts di zucca cocomero/bottiglia campionate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. gestione, trattamento a freddo, postgrafting e campionamento
- Avvolgono i semenzali innestati con i sacchetti di polietilene trasparente per mantenere un'umidità relativamente alta e mantenerli per 7 d in condizioni ambientali di cicli scuri di luce/8-h 16-h, mantenendo la temperatura a 28 ° C durante il giorno (luce) e a 22 ° C durante il notte (buio).
- Scoprire i sacchetti di polietilene trasparente del 7 ° giorno. Lasciate che le piante crescono per un ulteriore 7-10 giorni sotto le stesse condizioni.
- Dividere i semenzali uniformi sani in due gruppi, uno per il trattamento a freddo (sottolineato) e uno per il controllo (non-sollecitato). Per il gruppo di controllo, lasciare i semenzali nella stessa camera di crescita (a 28 ° C) per 48 h, mentre per il gruppo di freddo-sollecitato, trasferire le piantine a una camera di crescita con una temperatura costante a 6 ° C, con condizioni di luce/buio, come descritto nel passaggio 2.1.
- Assaggiare le foglie della marza e il portinnesto da innesti (Figura 1). Congelare i campioni immediatamente in azoto liquido e conservarli a-70 ° C fino all'utilizzo.
4. Biblioteca preparazione e High-throughput sequenziamento
- Trasferire i campioni congelati in una provetta 2 mL microcentrifuga in azoto liquido.
- Aggiungere un cordone di acciaio inox (5 mm di diametro) in ogni provetta contenente i tessuti.
- Omogeneizzare i tessuti ad una polvere fine utilizzando un omogeneizzatore del mulino di tallone per 30 s.
- Per ogni combinazione di innesto, prendere quantità uguali (0,1 g) del campione di terra da dieci piantine e mescolarli in una provetta da centrifuga 10 mL. Aggiungere una quantità appropriata di reagente di cloridrato di guanidium (Tabella materiali) basate sui suggerimenti del produttore corrispondente al peso del tessuto.
- Rimuovere contaminazioni di DNA genomici aggiungendo dnasi RNA-libera I a 150 U/mL a 37 ° C per 1 h.
- Determinare la totale quantità di RNA in un sistema di elettroforesi microcapillary per garantire l'integrità del RNA numero > 7.0.
Nota: Un RIN > 7.0 garantisce un'elevata integrità dei campioni di RNA. - Preparare piccole librerie di RNA utilizzando un kit commerciale (Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 1 µ g di RNA totale per campione per avviare.
- Disgelo biblioteca normalizzazione reagenti e schede secondo le linee guida del produttore. Lega i piccoli RNA con le schede di 5 ' e 3 ' ed eluire e purificarle. Poi, retromarcia trascrivere il 5 ' e 3' legato piccoli RNA seguendo le linee guida del produttore.
- Eseguire l'amplificazione di PCR secondo il protocollo del produttore. Valutare la qualità e la quantità delle librerie di cDNA utilizzando un sistema di elettroforesi microcapillary.
- Caricare 1 µ l di una libreria di RNA su un sistema di elettroforesi microcapillary per garantire il RIN > 7.0.
- Sequenza le piccole librerie di RNA su uno strumento di sequenziamento ad alte prestazioni come descritto altrove23.
5. miRNA e la previsione di Gene Target
- Per ogni combinazione di innesto, è necessario utilizzare l'open source UEA sRNA workbench versione 2,4-pianta24 per rimuovere sequenze di scarsa qualità e tagliare sequenze adattatore dal crude letture. Scartare le sequenze che sono minori di 18 nt o più grandi di 32 nt.
- Confrontare le sequenze di "pulite" di alta qualità per il database open source Rfam 11.0 per riconoscere e rimuovere letture di rRNA, tRNA, snoRNA e altri snRNAs.
- Allineare il restante letture per i genomi di riferimento utilizzando una sequenza di lettura breve allineamento strumento25. Nessuna corrispondenza è consentito in questo passaggio.
Nota: L'Assemblea di genoma "97103" anguria V126 è stato utilizzato per l'allineamento con le letture da scion e l'Assemblea di genoma "HZ" bottiglia zucca V127 è stato utilizzato per le letture dal rizoma. - Confrontare le letture restante contro Mirna conosciuti maturi nell'opensource miRBase 22.028. Si legge che sono omologhi ai miRNA conosciuti sono classificati come conservato miRNAs.
- Confrontare le sequenze che non riescono a abbinare i precursori di miRNA noti con la sequenza del genoma. Utilizzare l'algoritmo di29 MIREAP per rilevare potenziali Mirna romanzo sotto le impostazioni predefinite.
6. differenziale espressione ed analisi di Ontology del Gene
- Confrontare i livelli di espressione di Mirna basati sulla loro lettura conta. Mirna con un P-valore (test esatto di Fisher) < 0,05 e un registro assoluto2 valore > 2 sono considerati essere differenzialmente espressi.
- Utilizzare un oligonucleotide antisenso destinazione sito selezione strumento (TargetFinder)30 per prevedere potenziali mRNA complementari (miRNA geni target) per i miRNA differenzialmente espressi sotto i parametri predefiniti.
- Utilizzare il ontology del gene (GO) arricchimento strumento analitico31 per rivelare l'ontologia di geni bersaglio (GO) di miRNA modelli sotto un P- soglia di valore di 0,05 per significatività statistica.
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Representative Results
Figura 2: fenotipi di vari innesti a temperatura ambiente e condizioni di freddo-sollecitato. (un) questo pannello mostra omo - e piantine di heterografted a temperatura ambiente come il controllo. (b) questo pannello mostra omo - ed heterografted piantine dopo 48 h di trattamento a freddo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Utilizzando il metodo descritto, abbiamo ottenuto un alto (sopravvivenza) Tasso di successo del 98% per l'innesto. Fenotipi di vari innesti a temperatura ambiente e condizioni di freddo-ha sottolineato sono mostrati nella Figura 2. Dopo 48 h di trattamento a freddo, le piante di anguria homografted mostrato il ritardo di crescita evidente con giovani foglie avvizzite, mentre le piante di zucca bottiglia homografted e il heterografts di zucca cocomero/bottiglia esposta molto più vigorosa crescita. Nessun sintomo di danni sono stato osservato nelle foglie di heterografts, che anche ha superato le piante homografted bottiglia zucca, dove sono state danneggiate le foglie più basse vere. Questi risultati dimostrano chiaramente il vantaggio di heterografts che conferiscono resistenza al freddo.
Piccoli RNA 16s delle otto biblioteche ha prodotto un totale di 258 milioni di letture crudi. Dopo il controllo di qualità (QC), un totale di 146 milioni letture corrispondenti a sequenze uniche circa 30 milioni sono stati mantenuti (tabella 1). Basato su questa serie di sequenze di sRNA pulito, 323 Mirna, tra cui 10 noto e Mirna romanzo 313, stimati da bottiglia zucca e 20 miRNAs noti e 802 romanzo erano predetti da watermelon.sRNAs di 24 nt compone la più grande classe di sRNAs in tutti l'innesto combinazioni, indipendentemente dalla temperatura ambiente o freddo-ha sottolineato le condizioni (Figura 3).
| Trattamento | Codice | No. letture | sRNA | |
| Totale | Unico | |||
| WW-CK | Crudo | 30612962 | ||
| Pulire | 19727501 | 3858868 | ||
| Mappato a genomica | 19059359 | 3777952 | ||
| BB-CK | Crudo | 30845546 | ||
| CK | Pulire | 16832061 | 3787866 | |
| Mappato a genomica | 16375142 | 3694388 | ||
| WB-CK-S | Crudo | 39492123 | ||
| Pulire | 26783053 | 6319473 | ||
| Mappato a genomica | 25919944 | 6132389 | ||
| WB-CK-R | Crudo | 23763619 | ||
| Pulire | 10187791 | 1784447 | ||
| Mappato a genomica | 8946929 | 1537867 | ||
| WW-CL | Crudo | 27557577 | ||
| Pulire | 17879038 | 3336242 | ||
| Mappato a genomica | 17153763 | 3259960 | ||
| BB-CL | Crudo | 29780991 | ||
| Pulire | 13342206 | 3235570 | ||
| Freddo | Mappato a genomica | 12949972 | 3164329 | |
| WB-CL-S | Crudo | 45708415 | ||
| Pulire | 23071845 | 4310276 | ||
| Mappato a genomica | 22363113 | 4224166 | ||
| WB-CL-R | Crudo | 30585408 | ||
| Pulire | 19029266 | 3541729 | ||
| Mappato a genomica | 17364239 | 3196106 | ||
Tabella 1: Statistiche di piccoli RNA in vari innesti a temperatura ambiente o sotto trattamento a freddo.
Figura 3: distribuzione di dimensione del sRNA legge in vari innesti. (un) questo pannello mostra che la distribuzione delle dimensioni del sRNA legge in heterografts sotto controllo o condizioni di freddo. (b) questo pannello mostra che la distribuzione delle dimensioni del sRNA legge dentro omotrapianti sotto controllo o condizioni di freddo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Al momento un 48 h di trattamento a freddo, Mirna 30 e 268 erano up - e downregulated, rispettivamente, nelle foglie dello scion nella heterografts. Questo era in netto contrasto con i risultati nelle foglie del portinnesto, dove 31 e Mirna soltanto 12 erano up - e downregulated, rispettivamente (Figura 4). Negli omotrapianti anguria/cocomero, Mirna 64 e 83 erano up - e downregulated, rispettivamente. Negli omotrapianti zucca bottiglia zucca/bottiglia, questi numeri sono stati 30 e 28. A quanto pare, heterografting ha causato una profonda riprogrammazione delle espressioni miRNA. GO-arricchimento analisi dei geni putativi target dei miRNA differenzialmente espressi identificati 78 arricchito va termini nel rampollo di heterografts, con 40 classificati in processi biologici, 2 in componenti cellulari e 36 in funzioni molecolari (Figura 5). Abbiamo trovato che parecchi termini/vie GO conosciute legate alla trasduzione del segnale e resistenza di stress abiotici/biotico, per esempio, il processo catabolico di chitina (andare: 0006030, andare: 0006032), etilene-attivato via di segnalazione (andare: 0009873), poliammina processo biosintetico (GO: 0006596) e la trasduzione del segnale di fosforilazione della proteina (andare: 0009755), sono stati coinvolti. Combinati, i nostri risultati suggeriscono che il downregulation dei miRNA, regolando l'abbondanza delle trascrizioni dei loro geni bersaglio, possa rappresentare un importante meccanismo alla base di una maggiore resistenza al freddo. Negli innesti di zucca cocomero/bottiglia, il heterograft di per sé ha un impatto significativo sui modelli miRNA che formano i vantaggi dell'innesto.
Figura 4: confronto dei modelli di Mirna - up e downregulated in risposta a stress da freddo in vari innesti. WB-S = foglie rampollo dell'heterografts di zucca cocomero/bottiglia campionate; WB-R = portinnesto foglie dell'heterografts di zucca cocomero/bottiglia campionate; WW = gli omotrapianti anguria/cocomero; BB = gli omotrapianti zucca zucca bottiglia/bottle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: andare analisi di arricchimento dei geni bersaglio putativo di Mirna differenzialmente espressi in scion di foglie di heterografts a stress freddo. WB-CL-S = foglie rampollo dell'heterografts di zucca cocomero/bottiglia sotto trattamento a freddo; WB-CK-S = foglie rampollo dell'heterografts di zucca cocomero/bottiglia a temperatura ambiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo descritto in dettaglio un metodo altamente efficace e riproducibile per rendere omo - e heterografts tra anguria e zucca del Pellegrino. Questo metodo, che richiedono senza attrezzature specifiche, è molto facile da usare e in genere ha un tasso di sopravvivenza molto alta di innesto. Il metodo è utilizzabile anche per fare innesti per altre cucurbitacee, come tra anguria, cetriolo e zucca.
Vale la pena notare che la dimensione relativa (età) del portainnesto e Marza è critica a fare un innesto di successo (punto 2.2 del protocollo). Abbiamo osservato che, se il portinnesto utilizzato era troppo grande rispetto al Scion, l'Unione dell'innesto era più difficile forma perché il gambo dello scion è stato scavato un po '. Basato sul nostro precedente proteomica dati31, l'inclusione di self-innestata marza e portinnesto self-innestata come controlli è fortemente raccomandato (punto 2.3 del protocollo), perché allora, l'impatto delle lesioni l'innesto può essere in gran parte eliminato.
Questo protocollo fornisce anche uno schema sperimentale dettagliato e specifiche procedure sperimentali per indagare le abbondanze di miRNA nel sistema heterografting. Questo metodo sarà anche utile per gli studi in altri sistemi di impianto-innesto per rivelare i meccanismi di regolazione di miRNA locali e interurbane. Nei Risultati del rappresentante, segnaliamo i cambiamenti di espressione del solo locali Mirna in scion o portinnesto in risposta ad una temperatura bassa. Accumulando rapporti hanno evidenziato il coinvolgimento della lunga distanza piccola trasmissione di RNA in cambiamenti fenotipici relativi l'innesto. Il protocollo qui presentato, che combina i metodi per l'analisi di dati d'innesto e ad alta produttività, è utilizzabile anche per l'analisi di trasmissione di miRNA tra la marza e il portinnesto. Il principio di differenziazione Mirna trasmessi da Mirna locali si basa sulla loro somiglianza di sequenza per i genomi di riferimento (cioè, un miRNA a scion che è più come il genoma di portinnesto è considerato trasferito dal rizoma, e viceversa).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare. I dati di sequenziamento di RNA piccoli viene depositati in GenBank sotto il numero di adesione SRP136842.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (31772191), il progetto di ricerca di interesse pubblico nella provincia di Zhejiang (2017C 32027), la chiave scienza progetto di allevamento vegetale in Zhejiang (2016C 02051) e il programma nazionale per il supporto di prim'ordine giovani professionisti (per spaccio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
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