Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para reproducibly e rapidamente gerar biologicamente inspirados, biodegradável articifical apresentadoras de células (aAPC) com tamanho ajustável, forma e apresentação de proteína de superfície de célula T expansão ex vivo ou in vivo .
Abstract
Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) são uma plataforma promissora para modulação imune devido a sua potente capacidade de estimular células T. Substratos acelulares oferecem vantagens chaves sobre aAPC baseados em células, incluindo um controle preciso dos parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície aAPC modular suas interações com as células T. aAPC, construída a partir de partículas anisotrópicas, partículas particularmente elipsoidais, foram mostrados para ser mais eficaz do que suas contrapartes esféricos para estimulantes células T devido ao aumento de vinculação e maior área de superfície disponível para a célula T entrar em contato, bem como como reduzida absorção inespecífica e reforçadas propriedades farmacocinéticas. Apesar do aumento do interesse em partículas anisotrópicas, ainda amplamente aceita métodos de geração de partículas anisotrópicas tais como alongamento de filme fino pode ser um desafio para implementar e usar reproducibly.
Para este fim, descrevemos um protocolo para a preparação rápida, padronizada de biodegradável aAPC anisotrópica baseada em partículas com tamanho ajustável, forma e sinal de apresentação para células T expansão ex vivo ou na vivo, juntamente com métodos para caracterizar o seu tamanho, morfologia e superfície teor de proteínas e para avaliar sua funcionalidade. Essa abordagem para fabricar aAPC anisotrópica é escalável e reprodutíveis, tornando-a ideal para a geração de aAPC para imunoterapias "prateleira".
Introduction
Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) têm mostrado promessa como agentes imunomoduladores porque elas podem gerar uma resposta robusta pilha de T antígeno-específicas. Essenciais para essas plataformas são sua capacidade de apresentar eficientemente cruciais sinais para a ativação de células T. AAPC acelular são uma alternativa atraente para aAPC baseados em células, porque eles são mais fácil e menos dispendiosa fabricar, enfrentam poucos desafios durante o scale-up e Tradução e atenuar os riscos associados com terapias baseadas em células. AAPC acelular também permitem um alto grau de controle sobre parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície que irá interagir com T células1.
aAPC deve recapitular um mínimo de dois sinais essenciais para a ativação de células T. Sinal 1 prevê o reconhecimento do antígeno e ocorre quando o receptor de células T (TCR) reconhece e se envolve com um MHC-classe I ou II, tendo seu antígeno cognato, culminando na sinalização através do TCR complexo. Para contornar a exigência de especificidade do antígeno, aAPC sistemas frequentemente suportar um agonístico anticorpo monoclonal contra o receptor CD3, que nonspecifically estimula o complexo TCR. Formas recombinantes do MHC, particularmente oriundas de MHC, também utilizámos na superfície da aAPC para fornecer o antígeno especificidade2,3. Sinal 2 é um sinal de co-estimulação que direciona a atividade das células T. Para fornecer o costimulation necessária para a ativação de células T, o receptor CD28 geralmente é estimulado com um anticorpo agonístico apresentado na superfície aAPC, apesar de outros receptores co-estimulação como 4-1BB foram alvejados com sucesso4. Proteínas de sinal 1 e 2 são normalmente imobilizadas na superfície de partículas rígidas para sintetizar aAPC. Historicamente, aAPC têm sido fabricados a partir de uma variedade de materiais, incluindo poliestireno4,5 e ferro dextrano6. Sistemas mais novos utilizam polímeros biodegradáveis como poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) para gerar aAPC que pode ser facilmente acoplado para sinalizar proteínas, é adequados para a administração direta na vivoe pode facilitar a liberação sustentada de encapsulados de citocinas ou fatores solúveis para aumentar a ativação de célula T7,8.
Além da presença de proteínas de sinal necessário, engajamento do receptor sobre uma superfície suficientemente grande durante a interação de célula aAPC/T é essencial para a ativação de células T. Assim, os parâmetros físicos da aAPC como tamanho e forma drasticamente alteram sua área de contato disponível e afetam sua capacidade de estimular células T. AAPC micro-empresas foram mostrados para ser mais eficaz em estimular as células T do que suas contrapartes de nanoescala9,10. No entanto, nano-aAPC pode ter biodistribuição superior e melhor drenagem para os linfonodos que pode melhorar seu desempenho na vivo sobre micro-aAPC11. A forma é outra variável de interesse em sistemas baseados em partículas aAPC. AAPC anisotrópica recentemente foram mostrados para ser mais eficaz do que partículas isotrópicas a estimular as células T, principalmente devido à interação aprimorada com células alvo juntamente com absorção reduzida celular específico. Células ligam preferencialmente ao eixo longo de partículas elipsoidais, e o maior raio de curvatura e superfície mais plana que permitem mais contato entre a aAPC e células T12. O longo eixo das partículas elipsoidais também desencoraja a fagocitose, resultando em aumento da circulação de tempo em comparação com as partículas esféricas em vivo administração12,13a seguir. Devido a estas vantagens, partículas elipsoidais mediam a maior expansão do antígeno-específicas T células in vitro e em vivo em comparação com as partículas esféricas, um efeito observado em ambos os micro e nanoscales12, 13. Existem várias estratégias para fabricar partículas anisotrópicas, mas alongamento de película fina é um método simples, amplamente aceitado, usado para gerar uma gama de partículas diversas formas14. Após a síntese, partículas são lançadas filmes e esticadas em uma ou duas dimensões, a uma temperatura acima da temperatura de transição vítrea do material das partículas. O filme é então dissolvido para recuperar as partículas. Apesar do crescente interesse em partículas anisotrópicas, abordagens atuais para fabricação baseada em partículas aAPC limitam-se principalmente aos sistemas isotrópicos, e métodos de alterar a forma das partículas podem ser difícil de implementar, incompatível com certa síntese aAPC estratégias e falta de precisão e reprodutibilidade15. Nossa técnica de alongamento de película fina pode ser executada manualmente ou em um modo automatizado para gerar rapidamente partículas anisotrópicas sintetizadas a partir de uma variedade de polímeros biodegradáveis, esticada para uma proporção desejada em uma ou duas dimensões15.
Baseado no nosso trabalho anterior, desenvolvemos uma abordagem baseada em partículas biodegradável combinada com tecnologia de alongamento de thin-film escalável para gerar rapidamente aAPC com tamanho ajustável e a forma de uma forma padronizada para células T expansão ex vivo ou em vivo. Nossa estratégia de conjugação de proteínas pode ser usada para acoplar qualquer somáticas de interesse aos grupos da carboxila na superfície da partícula em uma densidade desejada, dando a este sistema de aAPC um alto grau de flexibilidade. Descrevemos também métodos para caracterizar o tamanho, morfologia e teor de aAPC de proteínas de superfície e para avaliar sua funcionalidade em vitro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para expandir as células imunes ex vivo ou na vivo para uma variedade de aplicações de imunoterapia.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Johns Hopkins.
1. fabricação de PLGA esférico partículas de tamanho ajustável
- Preparação de materiais para a síntese de partículas
- Prepare a solução a 5% w/w de álcool polivinílico (PVA).
- Adicionar 500 mL de água desionizada (DI) para um Erlenmeyer com uma barra de agitação magnética e colocar no agitador de placa quente a 500 rpm e monitor de temperatura com termômetro. Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação.
- Quando a temperatura da água atinge aproximadamente 70 ° C, adicione o total de 25 g de PVA em pequenos lotes ao longo do tempo, à espera de PVA dissolver antes de adicionar mais.
- Uma vez que todas PVA é dissolvido (tipicamente 30-60 min), deixe filtro de solução fria e estéril. Armazenar a 4 ° C para uso futuro.
- Prepare a solução de fundição de filme de 10% w/w PVA e 2% w/w glicerol.
- Adicione 500 mL de água para um Erlenmeyer com uma barra de agitação magnética. Adicione 8 mL de glicerol em temperatura ambiente e misture por trituração.
- Colocar o balão no agitador prato quente a 500 rpm e monitor de temperatura com termômetro. Cubra o frasco com papel alumínio para evitar a evaporação.
- Quando a temperatura da solução atinge cerca de 70 ° C, adicione 50 g total de PVA em pequenos lotes ao longo do tempo, à espera de PVA dissolver antes de adicionar mais.
- Quando todos PVA é dissolvido (normalmente 60 min), deixe a solução legal e estéril filtro usando um sistema de filtro de vácuo garrafa-top com um tamanho de poros de 0,22 μm. Armazenar em temperatura ambiente para uso futuro.
- Prepare uma solução PVA 50 mL 1% w/w. Adicione 40 mL de água e 10 mL de solução a 5% PVA (feita em 1.1.1) para um copo de 100-150 mL.
- Prepare uma solução PVA 100ml 0,5% w/w. Adicione 90 mL de água e 10 mL de solução a 5% PVA para um copo de 150-250 mL.
- Adicione uma barra de agitação magnética para o 0,5% solução PVA e coloque em uma capa de química em uma placa de agitação à temperatura ambiente a 500 rpm.
- Prepare a solução a 5% w/w de álcool polivinílico (PVA).
- Síntese de micropartículas
- Pesar 100 mg de poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) em um frasco de cintilação e dissolver em 5 mL de diclorometano (DCM). Vórtice de dissolver o PLGA.
- Coloque homogenizador na solução 50 mL 1% PVA para que o homogeneizador é o mais próximo do fundo do copo quanto possível sem tocá-lo. Ligue homogenizador e ajuste a velocidade desejada — 3.200 rpm para partículas de diâmetro 5 μm, 5.000 rpm para 3 μm, 15.000 rpm para 1 μm (aumentando o tamanho de partícula de diminuições de velocidade de homogeneização). Uma vez na velocidade desejada, adicionar a solução PLGA para o copo e homogeneizar por 1 minuto.
- Após a homogeneização, despeje o 1% PVA, solução de micropartículas PLGA na solução 100 mL 0,5% PVA em um prato Misture e mexa pelo menos 4 horas para a evaporação de solvente em uma capa de química.
- Lave as partículas 3 vezes em água DI.
- Despeje a solução de partícula em tubos de Erlenmeyer de 50 mL e centrifugar a 3000 x g por 5 minutos. Derrama o sobrenadante e adicionar cerca de 20 mL de água Desionizada.
- Resuspenda as partículas vortexing. Uma vez resuspended, encha tubos cônicos para 50 mL com água.
- Lave novamente da mesma maneira duas vezes mais.
- Síntese de nanopartículas
- Pesar 200 mg de PLGA dentro de um frasco de cintilação e dissolver em 5 mL de DCM. Vórtice de dissolver o PLGA.
- Coloque um copo com 50 mL de solução de PVA 1% no recipiente cheio de gelo. Coloque a sonda de sonicador no copo como perto do fundo quanto possível sem tocar. Comece sonication e adicione imediatamente a solução PLGA no copo medidor. Proceda à sonicação com uma potência de 12 W por 2 minutos gerar nanopartículas com um diâmetro aproximado de 200 nm.
- Depois sonication, despeje o 1% PVA, solução de nanopartículas PLGA em uma solução PVA 100ml 0,5% em uma placa de agitação e mexa pelo menos 4 horas para a evaporação de solvente em uma capa de química.
- Despeje a solução de partícula tubos Erlenmeyer de 50 mL e centrifugação a 3.000 x g, durante 5 minutos para remover micropartículas. Remover o sobrenadante e despeje em tubos de centrífuga de alta velocidade.
- Lave as partículas 3 vezes com água Desionizada. Centrifugar a 40.000 x g durante 15 minutos. Derrama o sobrenadante e ressuspender em água DI vortexing. Lave novamente da mesma maneira duas vezes mais.
2. fabricação de partículas poliméricas de forma ajustável
- Depois de lavar as partículas PLGA três vezes, resuspenda as partículas em aproximadamente 1 mL de água Desionizada. Adicione a solução de fundição de filme de partículas para a concentração final de partícula das partículas de 2,5 mg/mL.
- Pipete a suspensão de partículas em alíquotas de 10 mL para pratos de Petri retangular 75 x 50 mm para distender unidimensional ou em alíquotas de 15 mL em pratos de Petri 100 x 100 mm quadrados para alongamento bidimensional. Remover bolhas ou pipeta ou bolhas empurra para o lado e deixar secar durante a noite filmes numa vizinhança de química.
- Uma vez que os filmes tenham secado, remover filmes de pratos de plástico com uma pinça e cortar bordas de filmes com uma tesoura. Salve as bordas em um tubo cônico de 50 mL, para ser usado como partículas esféricas.
- Carrega um filme para a película fina automatizado esticando o dispositivo por um filme em blocos de alumínio de montagem. Para 1D alongamento, monte filme para blocos de alumínio de um eixo de maca (Figura 2), colocando duas arestas curtas do filme entre dois pedaços de borracha neoprene. Usando uma chave Allen, Dane-se as alças de metal na parte superior de borracha para segurar o filme no lugar. Para alongamento 2D, monte todas as quatro bordas em quatro blocos de alumínio para esticar em ambos os eixos (Figura 2).
- Medir e registrar o comprimento do filme entre blocos de alumínio sobre um eixo para 1D alongamento ou ambos os eixos para distender 2D. Calcule a distância necessária para esticar o filme em uma ou duas direções com base em dobra-trecho desejado.
- Coloque o dispositivo de alongamento filme carregado em estufa a 90 ° C e trazer o filme para temperatura durante 10 minutos. Coloca um copo grande no forno com uma pequena quantidade de água.
- Filme estirável.
- Quando o alongamento for concluída, retire o dispositivo de alongamento do forno e deixe arrefecer o filme à temperatura ambiente durante 20 minutos.
- Para 1D alongamento, corte o filme fora o dispositivo de alongamento nas bordas. Para alongamento 2D, corte e salvar o centro quadrado de filme que é esticado uniformemente em ambos os eixos. Coloque filmes em tubos cónicos com 2 filmes por tubo e descartar o resto do filme.
- Adicione cerca de 25 mL de água Desionizada para cada tubo cônico e o vórtice até os filmes são dissolvidos.
- Uma vez que os filmes são partículas dissolvidas, lave 3 vezes com água Desionizada.
- Por micropartículas, encher tubos cônicos para 50 mL e centrifugar a 3000 x g por 5 minutos, derrama o líquido sobrenadante, adicionar cerca de 20 mL de água Desionizada e vórtice para Ressuspender as partículas.
- Para nanopartículas, partículas de transferência para tubos de centrífuga de alta velocidade e centrifugar 40.000 x g por 15 minutos, deite fora o líquido sobrenadante, adicionar cerca de 20 mL de água Desionizada e vórtice para Ressuspender as partículas.
- Após a terceira lavagem, resuspenda partículas em aproximadamente 1 mL de água Desionizada. Registrar o peso do tubo microcentrifuga e adicionar partículas ao tubo. Congele as partículas em um freezer-80 ° C por 1 hora ou congelamento flash em nitrogênio líquido. Uma vez congelado, lyophilize partículas durante a noite.
- Uma vez liofilizado, pesar as partículas no tubo microcentrifuga e subtrair o peso verificado do tubo vazio para determinar o peso das partículas liofilizados.
3. proteína conjugação para criar Artificial células apresentadoras
- Prepare 2-(N-Morpholinos) etanesulfónico tampão de ácido (MES). Faça uma solução 0,1 M de MES na água e ajustar o pH a 6.0 por titulação com 1M de hidróxido de sódio (NaOH).
- Resuspenda micro/nanopartículas de PLGA/PBAE liofilizadas em 20 μg/mL no buffer MES vortexing. Encher um tubo de polipropileno microcentrifuga com 900 μL de tampão MES e adicionar 100 μL de solução a partícula para o tubo.
- Prepare a solução EDC/NHS. Dissolva 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC) e 48 mg de N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) em 1 mL de tampão MES.
- Adicione solução EDC/NHS 100 μL para as partículas e o vórtice para misturar.
- Incube o tubo em um inversor em temperatura ambiente por 30 minutos.
- Spin para baixo de micropartículas a 5.000 x g por 5 minutos, ou nanopartículas a 17.000 x g por 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de solução Isotónica pela utilização do Vortex (micropartículas) ou sonicating em 2-3 W durante 5 segundos (nanopartículas).
- Por micropartículas, adicione 8 μg de proteína o sinal desejado 1 e 10 μg de anti-rato CD28 (clone 37.51) para as partículas. Por nanopartículas, adicione 16 μg sinal 1 e 20 μg anti-rato CD28. Adicione PBS para trazer o volume no tubo para 1,1 mL.
- Incube o tubo em um inversor a 4 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, lave as partículas. Spin para baixo de micropartículas a 5.000 x g por 5 minutos, ou nanopartículas a 17.000 x g por 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as partículas em 1 mL de PBS estéril, pela utilização do Vortex (micropartículas) ou sonication em 2-3 W durante 5 segundos (nanopartículas). Repita duas vezes.
- Resuspenda as partículas na concentração desejada em meio de cultura para uso imediato. Para armazenamento a longo prazo, resuspenda partículas em 10 mg/mL em uma solução de sacarose 100 mM. Congelar, lyophilize e armazenar as partículas a-80 ° C.
4. caracterização e avaliação da aAPC
- Caracterização da aAPC tamanho e forma (Figura 3)
- Caracteriza microparticulado tamanho e forma de partículas de imagem usando microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para SEM imagens, espalhou partículas liofilizadas em fita de carbono aderiram a um alumínio tack e salpicar o casaco com ouro-paládio.
- Analise o tamanho e a proporção de partículas usando software de análise de imagem.
- Para determinar o tamanho de partícula, definir escala usando a barra de escala e medir o diâmetro das partículas. Repita para aproximadamente 100 partículas determinar o diâmetro médio da partícula e gerar um histograma de tamanhos de partículas.
- Para determinar a relação de aspecto, medir a distância entre o eixo e o eixo curto de partículas e divida o longo eixo por eixo curto. Repita para aproximadamente 50 partículas de cada forma de determinar a relação de aspecto de partícula média para cada forma e gerar histogramas.
- Caracteriza as nanopartículas tamanho e forma por imagem de partículas usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Analise o tamanho e a proporção de nanopartículas usando software de análise de imagem, conforme descrito em 5.1.2. Alternativamente, medir o tamanho de nanopartículas esféricas usando Difusão dinâmica da luz (DLS) ou nanopartículas acompanhamento análise (NTA).
- Eficiência de conjugação de proteínas
- Preparar aAPC de acordo com métodos 1-3, mas no passo 3.7 usar proteína fluorescente etiquetadas sinal 1 e anti-rato CD28. Após a conjugação e lavagem, Ressuspender a aAPC em 1 mL de PBS para uma concentração final de 2 mg/mL aAPC.
- Prepare padrões de proteína em uma microplaca de 96 poços de poliestireno preta. Adicionar 5 μg de proteína fluorescente etiquetadas sinal 1 para PBS no primeiro poço da placa e faça 10 diluições de 1:2 em PBS em toda a linha da placa. Deixe o espaço em branco bem passado. Repita este passo para gerar um outro conjunto de normas com fluorescente etiquetadas anti-CD28.
- Pipete 100 μL da solução aAPC para replicar poços da microplaca de poliestireno preto em triplicado.
- Lê a fluorescência em um leitor de placa de fluorescência em comprimentos de onda adequados. Use as leituras de fluorescência dos padrões da proteína para gerar curvas padrão para cada anticorpo fluorescente. Usando a curva padrão, calcular a concentração de sinal 1 e anti-CD28 em cada poço de amostra e em seguida, calcular a quantidade de proteína e eficiência de conjugação (Figura 4A, Figura 5A).
- Avaliação da aAPC para estimulação em vitro de células T CD8 +
- Preparar a mídia B' (meio RPMI suplementado com L glutamina, 10% FBS, 1% solução de ácido aminado Non-essential, piruvato de sódio 1%, 1% solução de vitamina MEM, 92 μM β-Mercaptoetanol, 10 ng/mL ciprofloxacin e 30 U/mL IL-2.
- Sacrifica um rato preto 6 através de exposição de dióxido de carbono.
- O baço do mouse de acordo com um protocolo previamente estabelecido16da colheita. Recolher o baço em um tubo cônico de 50 mL, com 10 - 15 mL de PBS. Usando um pilão, amasse o baço através de um filtro de célula de 70 µm para um tubo cónico de 50 mL. Durante a trituração, lave o filtro com 40 mL de PBS.
- Gire os splenocytes a 300 x g por 5 minutos. Decantar o sobrenadante e ressuspender os splenocytes em 4 mL de tampão de lise de Ack para lisar células vermelhas do sangue. Permitir que o tubo se sentar imperturbável durante 1 minuto, em seguida, adicione o PBS para trazer o volume no tubo de 20 mL.
- Gire as células a 300 x g por 5 minutos. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS. Conte as células usando um hemocytometer.
- Girar as células a 300 x g por 5 minutos e ressuspender no volume desejado de buffer de separação da célula. Isole as células T CD8 + da suspensão única célula usando uma CD8 + seleção negativa kit de isolamento de célula T, a seguir o protocolo do fabricante.
- Após a separação magnética, girar as células T CD8 + a 300 x g durante 5 minutos e remover o buffer de separação da célula. Ressuspender as células em 1 mL de PBS e contar as células. Rotular as células com carboxyfluorescein Succinil éster (CFSE) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Incube 8.333 células T CD8 + e mg 0,0833 (ou dose desejada) da aAPC em media 150 μL B' em cada poço de um 96 bem U-cultura de tecidos tratados placa inferior.
- Incube a 37 ° C por 7 dias. Após 3-4 dias, atualize o meio de cultura adicionando meio fresco de 75 μL de cada poço.
- Após 3 dias de incubação, analise CFSE rotulados de células em um citômetro de fluxo, para avaliar a proliferação. Cada pico no histograma fluxo cytometry CFSE representa uma geração de células devido a diluição CFSE com cada divisão celular sucessiva.
- Após 7 dias, use um hemocytometer para contar o número de células em cada poço. Antes da contagem, manche as células mortas com uma solução de azul de Trypan. Exclua as células mortas da contagem de células final. Normalize a concentração celular final para a concentração inicial para calcular a dobra-expansão (Figura 4 e Figura 5).
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Representative Results
Um esquema para a película fina 2D automatizado dispositivo de alongamento é dada na Figura 1. Um esquema e uma descrição para uma película fina de 1D, dispositivo de alongamento é dada na Ho et al.17 a maca é construída a partir de usando o padrão de moagem e de técnicas de usinagem de peças de alumínio. Semelhante a maca 1D, 2D maca consiste em apertos metálicos e trilhos de guia. Bidirecional de roscas são usadas para traduzir linear de movimento rotacional. Os parafusos de chumbo são o anexado através de torneiras mecânicas para motores de passo idênticos com torque suficiente. Os 8 fios de controle motor deslizante podem ser soldados na amphenol resistente ao calor de 8 pinos conectores para fácil fixação no console de controle em um forno para alongamento de película fina. Fio de politetrafluoretileno (PTFE) revestido de comprimento suficiente deve ser usado para ligar os motores de passo para os drivers no painel de controle. O esquema de controle de computador recomendado é dado na figura 1A. Os dois motores devem ser ligados através de fios resistentes ao calor para 2 condutores independentes. Os dois pilotos então devem estar conectados a um microcontrolador para interface com um computador. Os drivers devem ser ligados para o eixo x e eixo y produz sobre o microcontrolador. Os drivers e o microcontrolador exigem uma fonte de alimentação externa. Antes de conectar a fonte de alimentação para estes três componentes recomenda-se que um 4 fusível A ser inserido entre cada uma das conexões pstos para proteger os componentes da sobrecarga de corrente. Finalmente, o microcontrolador pode ser ligado através de uma entrada de porta paralela para um computador usando um DB25 macho para cabo do macho. Os componentes eletrônicos usados para controlar os motores deslizantes são calor-sensível e, portanto, devem ser colocados fora de qualquer fonte de calor (como forno) usada durante a operação para aquecer os filmes finos de temperatura suficiente para permitir o alongamento. Embora os motores recomendados são resistentes ao calor até temperaturas indicadas no presente protocolo para distender as partículas, os motores e os pilotos vão construir calor adicional enquanto eles estão conectados à fonte de alimentação principal. Portanto, é recomendável que o dispositivo apenas ser ligado durante o período do filme real, estendendo-se para minimizar a potencial acumulação de calor.
PLGA nano - e micropartículas foram sintetizadas usando as técnicas de emulsão único descrito neste protocolo e fotografada usando TEM (Figura 3A) e SEM (Figura 3B), respectivamente. Nanopartículas esféricas tinham um diâmetro de 237.3 ± 4.0 nm, medida pelo DLS e 224 nm, medida pelo NTA (Figura 3). Micropartículas foram sintetizadas por homogeneização a 5000 rpm para gerar partículas esféricas com diâmetro médio de 3 ± 1 μm (Figura 3D). As partículas foram esticadas usando o filme automático dispositivo de alongamento a 90 ° C, em uma dimensão para gerar prolato elipsoidal nano e micropartículas e esticaram a 70 ° C em duas dimensões para gerar partículas elipsoidais Oblatas. Analisaram-se as proporções das micropartículas de todas as três formas medindo o longo eixo e a distância do eixo curto de partículas e dividindo os dois. Micropartículas esféricas tinham uma proporção de 1,05 ± 0,04, enquanto 1D esticada prolato partículas elipsoidais tinham uma maior proporção de 3,6 ± 0,8 (Figura 3E). 2D esticadas Oblatas partículas elipsoidais tinham uma proporção de 1,2 ± 0,2, aproximadamente, mantendo uma relação de aspecto de um.
Química de reação EDC/NHS utilizou-se a conjugar uma marcada fluorescentemente peptídeo-carregado MHC dímero e anti-CD28 anticorpo IgG para a superfície das partículas PLGA alongadas e esféricas. Resultados de eficiência de conjugação demonstrar quantidades semelhantes de proteína na superfície esférica e elipsoidal micro-aAPC (Figura 4A) e nano-aAPC (Figura 5A) e demonstrar que o acoplamento durante a aAPC síntese de proteína ocorre em um concentração-dependente. Para avaliar o efeito da forma na funcionalidade aAPC, esférico e prolato aAPC elipsoidal conjugado com gp100-carregado dímero de MHC IgG e anti-CD28 foram usados para estimular células T CD8 + transgénicas de PMEL. Células T foram rotuladas com CFSE e avaliadas por citometria de fluxo após 3 dias para avaliar a proliferação (Figura 4B, 5B). Prolato aAPC elipsoidal foram encontrados para induzir a níveis mais elevados da proliferação de células T em doses sub saturante que aAPC esférica, com a melhor separação alcançada em uma dose de 0,01 mg. Após 7 dias, as células T foram contadas manualmente. Prolato aAPC elipsoidal estimulada mais eficazmente as células T em comparação com suas contrapartes esféricos na escala nanométrica (Figura 5) e microescala (Figura 4), e observou-se expansão de células T de dose-dependente.
Figura 1: representação esquemática da maca de película fina automatizado. (A) esquema do console de controle para maca de película fina. (B) esquema de hardware mecânico para maca de película fina. (Esquerda) Visão aérea do hardware mecânico. (Direito) Seção transversal de preensão mecanismo para filmes finos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fotografias de maca de película fina automatizado montadas para esticar as partículas poliméricas em formas anisotrópicas. A dispositivo de alongamento 2D de película fina é composta de dois eixos com suportes de alumínio que segurar o filme. Os dois eixos contêm chumbo parafusos em direções opostas para que eles se movem separados um do outro. Para automatizar o procedimento de alongamento, um microcontrolador USB ligado está ligado a dois drivers de motor de passo que retransmitir sinais para unipolar stepper motors através de um cabo térmico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de tamanho e proporção de partículas PLGA esféricas e elipsoidais. (A) TEM e (B) SEM imagens de esférico, 1D esticada prolato elipsoidal e 2D esticada Oblatos elipsoidal PLGA (A) nanopartículas e micropartículas (B). (C) esférica nanopartículas foram tamanho por NTA e determinado a ser 224 nm de diâmetro. Imagens SEM de micropartículas PLGA foram analisadas para a distribuição de partículas esféricas (D) e (E) proporções de todas as formas de partículas. (C) reproduzido e adaptado com permissão do pequeno13, Copyright Wiley-VCH 2015. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: caracterização e avaliação funcional da esférica e prolato micro elipsoidal-aAPC. (A) eficiência conjugação de fluorescente etiquetado peptídeo carregado MHC dímero e anti-CD28 anticorpo IgG para a superfície do esféricas e prolato micropartículas elipsoidais. (B) CD8 + T células foram rotuladas com CFSE e incubadas com micro-aAPC esférica e 1D-esticada em doses de 0,01, 0,1 e 1mg ou controles não-cognato. Depois de 3 dias, as células foram avaliadas por citometria de fluxo, para avaliar a proliferação. As células T (C) também foram avaliadas após 7 dias pela contagem manual. Contagem de células foram normalizadas para a contagem inicial para calcular dobra-expansão. Para comparação entre expansão prolato dobra esférica e elipsoidal, * = p < 0.05, * * = p < 0,01, e * * * = p < 0,001. Barras de erro representam o erro padrão da média (SEM) para 3 repetições. Reproduzido e adaptado com permissão de biomateriais12, Copyright Elsevier 2014. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: caracterização e avaliação funcional da esférica e prolato elipsoidal nano-aAPC. (A) eficiência conjugação de fluorescente etiquetado peptídeo carregado MHC dímero e anti-CD28 anticorpo IgG para a superfície de nanopartículas elipsoidais esféricas e prolato. (B) CD8 + T células foram rotuladas com CFSE e incubadas com o esférico e prolato nano elipsoidal-aAPC de variados dobra-estiramento em doses de 0,01, 0,1 e 1mg. Depois de 3 dias, as células foram avaliadas por citometria de fluxo, para avaliar a proliferação. (C) T células incubadas com partículas elipsoidais prolato de variando de estiramento de dobra (variando de 1,5 a 3,5) também foram avaliadas após 7 dias pela contagem manual. Contagem de células foram normalizadas a uma condição não tratada para calcular dobra-expansão. * = p < 0.05, * * = p < 0,01, e * * * = p < 0,001 comparado ao esférico. Barras de erro representam o erro padrão da média (SEM) para 3 repetições. Reproduzido e adaptado com permissão do pequeno13, Copyright Wiley-VCH 2015. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo detalha um método versátil para a geração precisa de partículas poliméricas anisotrópicas. A película fina alongamento técnica descrita aqui é escalável, altamente reprodutível e barato. Técnicas alternativas para a geração de partículas anisotrópicas sofrem muitas limitações, incluindo o alto custo, baixa taxa de transferência e tamanho de partícula limitada. A película fina, abordagem de alongamento também é vantajosa porque as partículas são modificadas para serem anisotrópica após a síntese e, em consequência, é compatível com uma ampla gama de tamanhos de partículas e de técnicas de síntese. Figura 1 detalha a configuração do dispositivo automatizado de alongamento bidimensional. Este dispositivo também pode ser usado sem os componentes eletrônicos manualmente girando os parafusos até que o filme atingiu o grau desejado de alongamento. No entanto, descobrimos que o processo automatizado é muito mais consistente e rápida do que a operação manual15. Várias técnicas foram desenvolvidas para sintetizar partículas anisotrópicas, como microfluidic abordagens17,18,19, camada por camada de revestimento21e outras abordagens de síntese ascendente21 ,22. No entanto, essas abordagens não habilitar forte controle sobre a geometria das partículas e não são tão versáteis em termos de formas que podem ser geradas e materiais de partículas que podem ser usados. Um método popular de cima para baixo para a fabricação de partículas nonspherical é partícula replicação em modelos de Non-umectante (PRINT)24. Apesar de impressão permite um controle preciso sobre a forma das partículas, exige maquinário caro e não é tão acessível e simples de implementar como a película fina, método de alongamento.
A técnica de emulsão simples pode ser usada para fabricar partículas PLGA de vários tamanhos, que vão desde o nano a microescala12,13. Por variados amplitude homogeneização velocidade ou sonication, tamanho de micropartículas e nanopartículas, respectivamente, pode ser modulado. Uma vez que as partículas esféricas foram geradas, a película fina, esticando o método descrito aqui pode ser usada para deformar as partículas em várias formas15. Neste protocolo, descrevemos a geração de partículas elipsoidais prolato e Oblatas esticando em uma ou duas dimensões, respectivamente. As partículas esféricas são lançadas por uma película fina de plástico, que é aquecida acima da temperatura de transição vítrea de PLGA e esticada em uma ou duas dimensões de deformar as partículas. A proporção das partículas é altamente controlável. Por meio do ajuste do grau de estiramento do filme, a proporção das partículas podem ser modulada, e encontramos que essa proporção de partículas medido é altamente correlacionada com o valor previsto de12,13. Várias outras formas podem ser geradas, modificando a temperatura durante o alongamento ou o grau de alongamento. Por exemplo, partículas discoidal bicôncava, assemelhando-se a forma das células vermelhas do sangue podem ser geradas por alongamento micropartículas 1.5-fold em duas dimensões a 90 ° C. 15. este filme, técnica de alongamento também tem sido usada para transformar as partículas esféricas de poliestireno em muitas formas anisotrópicas, incluindo worms, tambores e discos retangular21. O filme se estende o dispositivo pode ser usado controlando manualmente os parafusos ou o dispositivo pode ser automatizado, como mostrado na Figura 1 , para tornar o processo mais eficiente e consistente15. Esta técnica simples produz confiantemente anisotrópicas partículas que mantêm sua forma sob condições fisiológicas24. Além disso, este método foi aplicado a outros materiais poliméricos, além de PLGA, tais como policaprolactona (PCL) e híbrido partículas feitas de PLGA e poli (beta-amino éster) (PBAE).
Este protocolo descreve também como partículas PLGA de tamanho variado e forma podem ser conjugadas com as proteínas de superfície necessárias para a ativação de células T CD8 + atuar como aAPC. As proteínas podem ser conjugados covalentemente anisotrópica e esférica PLGA micro e nanopartículas por EDC/NHS mediada por acoplamento de aminas primárias em proteínas para grupos carboxila na superfície da partícula. A eficiência de conjugação de proteínas pode ser medida pelo acoplamento proteína fluorescente etiquetada na superfície das partículas, conforme descrito no presente protocolo, e achamos que esta técnica casais proteína para partículas em 15-20% eficiência12, 13. Prolato elipsoidal micro e nanopartículas aAPC são mais eficazes do que suas contrapartes esféricos em Ativando T CD8 + células proliferação e expansão em vitro12,13. AAPC elipsoidal realçaram a ligação para e interação com as células T devido a sua maior área de superfície para contato12. Partículas anisotrópicas também têm propriedades superiores sobre as partículas esféricas em vivo devido ao seu avançada biodistribuição e resistência à fagocitose13. Esta plataforma é altamente modular e tem potencial para se adaptar a muitas outras aplicações de entrega de drogas. Usando este procedimento, poliméricas partículas de tamanho e forma ajustável podem ser geradas e a superfície da partícula pode ser conjugada com qualquer proteína de interesse.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891) e o KRR (DGE-1232825) agradecem o programa de bolsa de pesquisa pós-graduação NSF para apoio. RAM graças a pesquisa nacional serviço prêmio NIH NCI F31 (F31CA214147) e as recompensas de realização para comunhão universitária de cientistas para apoio. Os autores agradecer o NIH (R01EB016721 e R01CA195503), a pesquisa para evitar cegueira James e Carole livre Catalyst Award e o Instituto de Bloomberg-Kimmel JHU de imunoterapia para apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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