Summary
Здесь мы представляем протокол для герметизации и быстро генерировать биологически вдохновил, биологически articifical антиген представляющих клеток (aAPC) с перестраиваемой размер, форму и представление поверхности белка для Т-клеток расширения ex vivo или в естественных условиях .
Abstract
Искусственные антиген представляющих клеток (aAPC) являются перспективной платформой для иммунной модуляции вследствие их мощной способностью стимулировать Т-клеток. Бесклеточной субстратов предлагают ключевые преимущества над на основе ячеек aAPC, включая точный контроль параметров сигнала презентации и физические свойства поверхности aAPC чтобы модулировать его взаимодействия с Т-клеток. aAPC построены из анизотропных частиц, особенно эллипсоидальными частицами, было показано, чтобы быть более эффективным, чем связаться с их сферических коллегами на стимулирование Т-клеток, за счет расширения привязки и больше площадь поверхности для Т-клеток, а также как снижение неспецифической поглощения и расширенной фармакокинетические свойства. Несмотря на повышенный интерес к анизотропной частиц даже широко методы генерации анизотропной частицы, такие как растяжения тонкопленочных может быть сложным для реализации и использования можно воспроизвести.
С этой целью мы описать протокол для быстрого, стандартизированные изготовления биологически анизотропной aAPC на основе частиц с перестраиваемой размер, форма и сигнал презентации для Т-клеток расширения ex vivo или в естественных условиях, а также методы для характеризовать их размер, морфология и поверхностных белков содержание и оценить их функциональность. Такой подход к фабрикации анизотропной aAPC является масштабируемой и воспроизводимости, что делает его идеальным для генерации aAPC для «стандартных» immunotherapies.
Introduction
Искусственные антиген представляющих клеток (aAPC) показали обещание как иммуномодулирующих агентов, потому что они могут генерировать ответ надежные антиген специфические Т-клеток. Важное значение для этих платформ являются их способность эффективно представит решающую сигналов для активации Т-клеток. Бесклеточной aAPC являются привлекательной альтернативой на основе ячеек aAPC, потому что они легче и дешевле в изготовлении, сталкиваются с меньшими проблемами во время масштабирования и перевод и смягчить риски, связанные с лечения на основе ячеек. Бесклеточной aAPC также обеспечить высокую степень контроля над представления параметров сигнала и физические свойства поверхности, которая будет взаимодействовать с клетками T1.
aAPC должны охарактеризовать как минимум двух сигналов, необходимых для активации Т-клеток. Сигнал 1 обеспечивает антигены и происходит, когда Т-клеточных рецепторов (TCR) признает и осуществляет взаимодействие с MHC класса I или II, с учетом его родственных антигена, кульминацией сигнализации через TCR комплекс. Чтобы обойти требование конкретизации антигена, aAPC систем часто несут агонистических моноклональные антитела против CD3-рецептор, который nonspecifically стимулирует TCR комплекс. Рекомбинантные формы MHC, особенно MHC мультимеры, также используются на поверхности aAPC предоставлять антигена специфика2,3. Сигнал 2 это костимуляторных сигнал, который направляет деятельность Т-клеток. Предоставлять костимуляции, необходимые для активации клеток T, рецептор CD28 обычно стимулируется с агонистических антитела представлены на поверхности aAPC, хотя другие костимуляторных рецепторов, таких как 4-1BB были успешно целевых4. Сигнал 1 и 2 белки обычно лишенных подвижности на поверхности жестких частиц синтезировать aAPC. Исторически aAPC были изготовлены из различных материалов, в том числе полистирола4,5 и Железо декстран6. Новые системы используют биоразлагаемые полимеры как поли (молочно co гликолевая кислота) (PLGA) для создания aAPC, который может легко сочетаться сигнал белки, подходят для прямого управления в естественных условияхи могут облегчить стабильного выпуска инкапсулированные цитокинов или растворимых факторов для расширения Т-клеток активации7,8.
В дополнение к наличие необходимых сигналов белков рецептор взаимодействие через достаточно большой площади поверхности во время взаимодействия клеток aAPC/T имеет важное значение для активации клеток T. Таким образом физические параметры aAPC, такие как размер и форма резко изменить их доступных площадь контакта и влияет на их способность стимулировать клетки T. Микронных размеров aAPC показали должна быть более эффективной в стимулировании Т-клеток, чем их коллеги наноразмерных9,10. Однако нано aAPC может иметь Улучшенный накопление и лучше дренаж на лимфатические узлы, которые могут повысить их производительность в vivo над микро aAPC11. Форма является другой переменной интерес в системах на основе частиц aAPC. Анизотропные aAPC недавно было показано, быть более эффективным, чем изотропной частиц на стимулирование Т-клеток, главным образом благодаря укреплению взаимодействия с сочетании с снижение неспецифической клеток поглощения клеток-мишеней. Клетки преференциально связывают к длинной оси эллипсоидальными частицами, и больший радиус кривизны и плоской поверхности позволяют больше контакта между aAPC и12Т-клеток. Длинная ось эллипсоидальными частицами также препятствует фагоцитоза, что приводит к времени увеличенная циркуляция, по сравнению с сферических частиц, следуя в естественных условиях администрации12,13. Учитывая все эти преимущества эллипсоидальными частицами посредником большее расширение антиген специфические T клетки в пробирке и в естественных условиях по сравнению с сферических частиц, эффект наблюдается как микро, так и nanoscales12, 13. Существуют различные стратегии для изготовления анизотропной частицы, но тонкопленочных растяжения является простым, широко признанным метод, используемый для создания целого ряда различных частиц формы14. После синтеза частицы брошен в фильмах и растягивается в одном или двух измерениях при температуре выше температуры стеклования частиц материала. Затем фильм растворяется для извлечения частиц. Несмотря на растущий интерес к анизотропной частиц, текущие подходы для изготовления на основе частиц aAPC в основном ограничиваются изотропной систем и методы изменения формы частиц может быть трудно осуществить, несовместимые с определенным aAPC синтез стратегии и отсутствие точности и воспроизводимости15. Нашу технику растяжения тонкопленочных может быть выполнена вручную или в автоматическом режиме быстро сформировать анизотропной частицы, синтезированных из целого ряда биоразлагаемых полимеров, растягивается до желаемой пропорции в один или два размеры15.
Основываясь на нашей предыдущей работы, мы разработали биологически подход на основе частиц, в сочетании с масштабируемой растяжения тонкопленочной технологии быстро генерировать aAPC с перестраиваемой размер и форму в стандартизованном виде для Т-клеток расширения ex vivo или в VIVO. Наша стратегия спряжение белка может использоваться для пара любые белки интерес к карбоксильных групп на поверхности частиц на желаемой плотности, давая этой системы aAPC высокую степень гибкости. Мы также описывают методы характеризуют размер, морфология и поверхностных белков содержание aAPC и оценить их функциональность в пробирке. Этот протокол может быть легко адаптирована для расширения иммунные клетки ex vivo или в естественных условиях для различных иммунотерапевтических приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Джона Хопкинса.
1. Изготовление PLGA сферических частиц размером перестраиваемый
- Подготовка материалов для синтеза частиц
- Готовят раствор 5% w/w поливиниловый спирт (PVA).
- Добавить 500 мл деонизированной воды (DI) в колбу Эрленмейера с магнитной перемешать бар и место на Электроконфорка мешалкой при температуре 500 об/мин и монитор с термометром. Обложка колба с фольги для предотвращения испарения.
- Когда температура воды достигает примерно 70 ° C, добавьте 25 g всего ПВА небольшими партиями с течением времени, ожидая ПВА распустить перед добавлением больше.
- После того, как все ПВА растворяется (обычно 30-60 мин), пусть прохладно и стерильного фильтра решения. Хранить при 4 ° C для использования в будущем.
- Подготовка фильма литья раствор 10% w/w ПВА и 2% w/w глицерина.
- Добавьте 500 мл ди воды в колбу Эрленмейера с баром магнитные перемешать. Добавьте 8 мл глицерина при комнатной температуре и микс, Тритурация.
- Место колба на Электроконфорка мешалкой при температуре 500 об/мин и монитор с термометром. Обложка колба с фольги для предотвращения испарения.
- Когда решение температура достигает примерно 70 ° C, добавьте 50 g всего ПВА небольшими партиями с течением времени, ожидая ПВА распустить перед добавлением больше.
- После того, как все ПВА растворяется (обычно 60 мин), пусть прохладно и стерильные фильтр решения с использованием системы верхней бутылки вакуум-фильтр с размером пор 0,22 мкм. Хранить при комнатной температуре для использования в будущем.
- Приготовляют раствор 50 мл 1% w/w ПВА. Добавьте стакан 100-150 мл 40 мл воды ди и 10 мл 5% раствора ПВА (сделанные в 1.1.1).
- Приготовляют раствор 100 мл 0,5% w/w ПВА. Добавьте 150-250 мл стакан 90 мл воды ди и 10 мл 5% раствора ПВА.
- Добавьте панель магнитные размешать в 0,5% раствором ПВА и место в химической капот на плите перемешать при комнатной температуре на 500 об/мин.
- Готовят раствор 5% w/w поливиниловый спирт (PVA).
- Тонкодисперсный синтез
- Весят из 100 мг поли (молочно co гликолевая кислота) (PLGA) в сцинтилляционные флакона и растворяют в 5 мл Дихлорметан (DCM). Вихрь распустить PLGA.
- Место гомогенизатор в 50 мл 1% раствора ПВА, так что гомогенизатор является как можно ближе к нижней части стакан как можно не касаясь его. Включите гомогенизатор и приспособиться к желаемой скорости — 3200 об/мин, диаметр частиц 5 мкм, 5000 об/мин для 3 мкм, 15000 об/мин для 1 мкм (увеличение размера частиц уменьшает скорость гомогенизации). Однажды на желаемой скорости, PLGA решение добавить стакан и гомогенизации за 1 минуту.
- После гомогенизации, залейте 1% ПВА, PLGA микрочастица решения в 100 мл 0,5% раствора ПВА на пластину перемешать и перемешать по крайней мере 4 часа для испарения растворителя в химические вытяжки.
- Вымойте частиц 3 раза в воде ди.
- Залейте раствор частиц в 50 мл конические трубы и центрифуги на 3000 x g за 5 минут. Вылейте супернатант и добавить примерно в 20 мл воды ди.
- Ресуспензируйте частиц в vortexing. После высокомобильна, заполните вверх конические трубы до 50 мл с ди водой.
- Мойте снова таким же образом еще два раза.
- Синтез наночастиц
- Весят из 200 мг PLGA во флакон сцинтилляции и растворяют в 5 мл DCM. Вихрь распустить PLGA.
- Поместите стакан с 50 мл 1% раствора ПВА в контейнер, заполненный льдом. Место sonicator зонд в стакане как можно ближе к нижней как можно без прикосновения. Начать sonication и сразу же добавить PLGA решение в стакан. Sonicate с мощностью 12 Вт для 2 минут для получения наночастиц с диаметром приблизительно 200 Нм.
- После sonication, залить 1% ПВА, PLGA наночастиц решения в 100 мл 0,5% раствора ПВА на пластину перемешать и перемешать по крайней мере 4 часа для испарения растворителя в химические вытяжки.
- Залейте раствор частиц в 50 мл конические трубы и центрифуги на 3000 x g 5 минут для удаления микрочастиц. Удалить супернатант и вылить в высокой скорости пробирок.
- Вымойте частиц 3 раза с ди воды. Центрифуга на 40000 x g за 15 минут. Вылейте супернатант и Ресуспензируйте в воде ди, vortexing. Мойте снова таким же образом еще два раза.
2. Изготовление полимерных частиц перестраиваемый формы
- После мытья PLGA частицы в три раза, Ресуспензируйте частицы в приблизительно в 1 мл воды ди. Добавьте фильм литья решения частиц для окончательного частиц концентрация частиц 2,5 мг/мл.
- Пипетка частиц взвеси в 10 мл аликвоты в прямоугольные Петри 75 x 50 мм для одномерного растяжения или в 15 мл аликвоты в квадратных Петри 100 x 100 мм для двумерных растяжения. Удалить пузыри, либо пипетки или толкания пузырьков в сторону и пусть сухой ночлег фильмов в химические вытяжки.
- После фильмов уже высохли, удалите фильмов из пластиковых блюда с помощью пинцета и обрезают кромки фильмов с ножницами. Сохраните края в 50 мл Конические трубки для использования в качестве сферических частиц.
- Загрузите фильм на автоматизированных тонкой пленки, растяжения устройство путем монтажа фильма на алюминиевых блоков цилиндров. Для 1D растяжения, смонтируйте фильм на алюминиевых блоков цилиндров одной оси растяжителя (рис. 2), поставив два коротких края пленки между двух кусков резины, неопрен. С помощью гаечного ключа, винтовые металлические ручки на вершине резины держать фильм на месте. Для 2D растяжения, Маунт всех четырех краев на четырех алюминиевых блоков цилиндров растянуть по обеим осям (рис. 2).
- Измерьте и запишите длина фильма между алюминиевых блоков цилиндров на одной оси для 1 D растяжения или обеих осей для 2D растяжения. Вычислите расстояние, необходимых для стретч пленки в одном или двух направлениях, основанные на желаемый фолд стрейч.
- Место загрузки фильма растяжения устройство в духовке при 90 ° C и довести фильм до температуры более 10 минут. Место большой стакан в духовке с небольшим количеством воды.
- Стретч-пленки.
- Когда растяжения завершена, удалите натяжные устройства от печи и пусть фильм остыть до комнатной температуры за 20 минут.
- Для 1D растяжения, вырезать фильм из растяжения устройства на краях. Для 2D растяжения, вырежьте и сохранить центральный квадрат пленки, которая натягивается равномерно по обеим осям. Фильмы в конические трубы с 2 фильмов в трубку и отказаться от остальной части фильма.
- Добавьте примерно в 25 мл воды ди каждому конические пробки и вихревой пока растворится фильмы.
- После того, как фильмы растворяются, мыть частиц 3 раза с ди водой.
- Для микрочастиц заполнить конические трубы 50 мл и центрифуги на 3000 x g за 5 минут, слейте супернатанта, добавить примерно в 20 мл воды ди, и вихрь Ресуспензируйте частиц.
- Для наночастиц, переноса частиц высокой скорости пробирок и центрифуги на 40000 x g на 15 минут, слейте супернатанта, добавить примерно в 20 мл воды ди, и вихрь Ресуспензируйте частиц.
- После третьей стирки Ресуспензируйте частиц в приблизительно в 1 мл воды ди. Запишите вес пробки microcentrifuge и добавить частиц в трубу. Частицы заморозить в морозильной камере-80 ° C за 1 час или flash замораживание в жидком азоте. После того, как замороженные, lyophilize частиц на ночь.
- После лиофилизированный, весят частиц в пробки microcentrifuge и вычесть записанные вес пустой трубки для определения веса лиофилизированные частиц.
3. поверхности белка сопряжения для создания искусственного антиген представляющих клеток
- Подготовка 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES) буфера. Сделайте раствор 0,1 М МЧС в воде и отрегулировать pH 6.0 титрования с 1 М гидроокиси натрия (NaOH).
- Ресуспензируйте лиофилизированные микро PLGA/PBAE/наночастиц на 20 мкг/мл в буфере МЧС по vortexing. Заполнить трубы полипропиленовые microcentrifuge с 900 мкл буфера MES и добавить 100 мкл раствора частиц в трубу.
- Готовят раствор EDC/ГСЗ. Растворяют Карбодиимиды 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) 40 мг (EDC) и 48 мг N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) в 1 мл MES буфера.
- Добавьте 100 мкл EDC/NHS решение частиц и вихревой смешивать.
- Инкубируйте трубку на инвертор при комнатной температуре за 30 минут.
- Спин вниз микрочастиц в 5000 x g 5 минут, или наночастиц на 17.000 x g за 5 минут. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 1 мл PBS vortexing (микрочастиц) или sonicating на 2-3 Вт 5 секунд (наночастиц).
- Для микрочастиц добавление 8 мкг белка желаемого сигнала 1, и 10 мкг анти мыши CD28 (клон 37.51) частиц. Для наночастиц добавьте 16 мкг сигнал 1 и 20 мкг анти мыши CD28. Добавление PBS довести объем в трубку до 1,1 мл.
- Инкубируйте трубку на инвертор на 4 ° C на ночь.
- Следующий день, мыть частицы. Спин вниз микрочастиц в 5000 x g 5 минут, или наночастиц на 17.000 x g за 5 минут. Отменить супернатанта и Ресуспензируйте частиц в 1 мл стерильного PBS vortexing (микрочастиц) или sonication на 2-3 Вт 5 секунд (наночастиц). Повторите дважды.
- Ресуспензируйте частицы в нужной концентрации в питательной среды для немедленного использования. Для длительного хранения Ресуспензируйте частиц на 10 мг/мл в растворе сахарозы 100 мм. Заморозить, lyophilize и хранить частицы-80 ° c.
4. характеристика и оценка aAPC
- Характеристика aAPC размера и формы (рис. 3)
- Характеризуют микрочастица размер и форма визуализации частиц с помощью растровая электронная микроскопия (SEM). Для SEM изображений, распространение лиофилизированные частиц на углеродные ленты придерживаться алюминиевой тактику и распыления пальто с золото палладий.
- Анализируйте размер и пропорции частиц с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
- Чтобы определить размер частиц, задайте масштаб с помощью линейки и измерить диаметр частиц. Повторите для примерно 100 частиц определить диаметр средняя частиц и создать гистограмму размеров частиц.
- Чтобы определить пропорции, измерить расстояние по длинной оси и оси короткие частиц и разделить длинной оси по короткой оси. Повторите для примерно 50 частиц каждой фигуры, чтобы определить средний частиц пропорции для каждой формы и создания гистограммы.
- Характеризуют наночастиц размер и форма изображения частиц с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Анализируйте размер и пропорции наночастиц с помощью программного обеспечения для анализа изображений, как описано в 5.1.2. Кроме того размер сферических наночастиц с помощью динамического рассеяния света (DLS) или наночастиц, отслеживания анализа (НТА).
- Спряжение эффективность белка
- Подготовить aAPC согласно методы 1-3, но в шаге 3.7 использовать дневно обозначенные сигнал 1 белок и анти мыши CD28. После сопряжения и мытья Ресуспензируйте aAPC в 1 мл PBS для конечная концентрация 2 мг/мл aAPC.
- Подготовка стандартов белка в черный полистирола 96-луночных микропланшетов. Добавьте 5 мкг белка дневно обозначенные сигнал 1 PBS в первой скважины пластины и сделать 10 разведения 1:2 в PBS в строке пластины. Оставьте последний хорошо пустым. Повторите этот шаг для создания другого набора стандартов с дневно обозначенные анти CD28.
- Пипетка 100 мкл раствора aAPC в реплицировать скважины черный микроплиты из полистирола в трех экземплярах.
- Читайте флуоресцирования на читателя пластины флуоресценции в соответствующих длинах волн. Используйте флуоресценции чтений от белка стандартов для создания стандартных кривых для каждого флуоресцентные антитела. С помощью стандартной кривой, рассчитать концентрации сигнала 1 и анти CD28 в каждой скважине образца, а затем вычислить количество поверхностных белков и эффективности спряжение ( Рисунок 5AРисунок 4A, ).
- Оценка aAPC для стимуляции в vitro CD8 + Т-клеток
- Подготовить B СМИ (RPMI среднего дополнена L глютамина, 10% FBS, 1% раствор Non-essential аминокислота, пируват натрия 1%, 1% раствор витамина MEM, 92 мкм β-меркаптоэтанол, Ципрофлоксацин 10 нг/мл и 30 ед/мл Ил-2.
- Пожертвуйте черный 6 мыши через воздействия диоксида углерода.
- Урожай хандры от мыши в соответствии с ранее установленным Протоколом16. Собирать селезенки в 50 мл Конические трубки с 10 - 15 мл PBS. С помощью пестика, пюре селезенки через стрейнер ячейки 70 мкм в 50 мл Конические трубки. Во время затирания, промойте ситечко с 40 мл PBS.
- Спиновые splenocytes на 300 x g за 5 минут. Слить супернатант и Ресуспензируйте splenocytes в 4 мл Ack лизировать буфер для лизируют красных кровяных клеток. Позволяет трубе сидеть спокойно на 1 минуту, а затем добавить PBS довести объем в трубку до 20 мл.
- Вращайте клетки на 300 x g за 5 минут. Слить супернатант и Ресуспензируйте клеток в 1 мл ФСБ. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
- Спиновые клетки на 300 x g 5 минут и Ресуспензируйте желаемого объема буфера разделения клетки. Изолируйте CD8 + Т-клеток из одной ячейки подвеска с помощью CD8 + негативный выбор изоляции комплект Т-клеток, после производителя протокол.
- После магнитной сепарации спина CD8 + Т-клеток в 300 x g на пять минут и удалить буфер разделения клетки. Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS и подсчитать количество ячеек. Ярлык клетки с Карбоксифлуоресцеина succinyl эфира (CFSE) по данным производителя протокол.
- Инкубировать 8 333 CD8 + Т-клеток и 0.0833 мг (или нужную дозу) aAPC в 150 мкл B СМИ в каждой скважине 96 хорошо U-культуры ткани лечение днище.
- Инкубируйте при 37 ° C в течение 7 дней. После 3-4 дня обновите питательной среды, добавив 75 мкл свежие среднего для каждой скважины.
- После 3 дней инкубации анализируйте CFSE маркировку на проточный цитометр ячейки для оценки распространения. Каждый пик на гистограмме CFSE цитометрия потоков представляет собой поколение клеток за счет разбавления CFSE с каждой последовательно деление клеток.
- После 7 дней используйте Горяева подсчитать количество ячеек в каждой скважине. До подсчета, пятно мертвые клетки с раствором Трипановый синий. Исключите мертвые клетки из окончательного клеток. Нормализации концентрации окончательный ячейки для начальной концентрации для вычисления фолд расширение(рис. 4 и 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема для автоматизированного 2D тонкой пленки, растяжения устройство приводится на рисунке 1. Схема и описание для 1D тонкой пленки, растяжения устройство приводится в Хо et al.17 подрамника построен из алюминиевых деталей, используя стандартные фрезерные и обработки методов. Подобно носилках 1D, 2D подрамник состоит из металлических ручек и направляющие. Двунаправленный ходовые винты используются для перевода линейная вращательном движении. Ходовые винты являются прилагаемый через механические краны на Идентичные шаговых двигателей с достаточной крутящий момент. 8 шаговый мотор управления провода можно припаять на жаропрочные amphenol 8-контактный разъемы для метки легко наклеиваются на консоли управления в духовке для тонкопленочных растяжения. Проволока из политетрафторэтилена (ПТФЭ) покрытием достаточной длины должен использоваться для подключения шаговые двигатели к драйверам в консоли управления. Схема управления рекомендуется компьютер приводится на рисунке 1A. Два двигателя должен быть подключен через термостойкие провода 2 независимых водителям. Два водителя затем должен быть подключен к микроконтроллер для взаимодействия с компьютером. Драйверы должны быть подключены к оси x и оси y выводит на микроконтроллер. Драйверы и микроконтроллер требуют внешнего источника питания. До подключения питания для этих трех компонентов рекомендуется, что 4 A предохранитель вставляется между каждой из питание подключений для защиты от перегрузки по току компоненты. Наконец микроконтроллер могут быть связаны через параллельный порт вход на компьютер с помощью DB25 мужской мужской кабеля. Электроника используется для управления шаговыми двигателями являются тепла чувствительных и поэтому должны располагаться за пределами любой источник тепла (например, печь), используемый во время операции для тепла тонких пленок до достаточной температуры для включения растяжения. Хотя рекомендованные двигатели теплостойкость до температур, указанных в этом протоколе для растяжения частицы, двигатели и драйверы будет строить дополнительного тепла в то время как они крепятся к основной источник питания. Поэтому рекомендуется, что устройство включить только в период фактической фильма растяжения для сведения к минимуму потенциальных генерированием тепла.
PLGA нано - и микрочастицы были синтезированы с использованием единого эмульсии методов описанных в настоящем Протоколе и образы с использованием ТЕА (Рисунок 3А) и SEM (рис. 3B), соответственно. Сферических наночастиц имели диаметр 237.3 Нм ± 4.0 как измеряется DLS и 224 Нм измеряемый НТА (рис. 3 c). Микрочастицы были синтезированы гомогенизации при 5000 об/мин для создания сферических частиц со средним диаметром 3 ± 1 мкм (рис. 3D). Частицы протянулись с использованием автоматизированных фильма растяжения устройство на 90 ° C в одном измерении для создания обьемная эллипсоидальной нано - и микрочастицы и растягивается при 70 ° C в двух измерениях для создания сплюснутой эллипсоидальными частицами. Пропорции микрочастицы всех трех фигур были проанализированы путем измерения длинной оси и оси короткие расстояния частиц и два деления. Сферические микрочастицы имел пропорции 1,05 ± 0.04, в то время как 1D растягивается обьемная эллипсоидальными частицами имел большие пропорции 3.6 ± 0,8 (Рисунок 3E). 2D натянутой сплюснутой эллипсоидальной частицы имел пропорции 1,2 ± 0,2, примерно сохранения пропорций одного.
EDC/NHS реакции химии был использован для конъюгата дневно помечены загрузки пептидной MHC IgG димер и анти CD28 антитела к поверхности растягивается и сферических частиц PLGA. Спряжение эффективности результаты демонстрируют аналогичные количества белка на поверхности сферических и эллипсоидальной микро aAPC (рис. 4A) и нано aAPC (Рисунок 5A) и продемонстрировать, что соединения во время aAPC синтеза белков происходит в концентрация зависимых манере. Оценить влияние формы на aAPC функциональность, сферическая и обьемная эллипсоидальной aAPC проспряганное с загружен gp100 MHC IgG димер и анти CD28 были использованы для стимулирования PMEL трансгенных CD8 + Т-клеток. Т-клетки были помечены CFSE и оценены подачей cytometry после 3 дней, чтобы оценить распространения (рис. 4б, 5B). Обьемная эллипсоидальной aAPC были найдены навести более высокий уровень пролиферации клеток T в югу насыщения дозах чем сферических aAPC, с лучшим разделения, достигнутые в дозе 0,01 мг. После 7 дней вручную насчитали Т-клетки. Обьемная эллипсоидальной aAPC более эффективно стимулирует Т-клеток, по сравнению с их сферических микромасштабной (рис. 4 c) и наноразмерных (рис. 5 c), и было отмечено расширение дозозависимый Т-клеток.
Рисунок 1: Схематическое представление автоматизированных тонкопленочных носилки. (A) схема управления консоли для тонкой пленки носилках. (B) схемы механического оборудования для тонкой пленки носилках. (Слева) Вид сверху механического оборудования. (Справа) Поперечное сечение захвата механизм для тонких пленок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: фотографии собраны автоматизированных тонкопленочных носилках растянуть полимерных частиц в анизотропных фигур. 2D тонкой пленки, растяжения устройство состоит из двух осей с алюминиевые крепления, которые сцепление фильм. Две оси содержат ходовые винты в противоположных направлениях, таким образом, чтобы они движутся друг от друга. Чтобы автоматизировать растяжка процедуры, микроконтроллер связаны USB подключен к два шаговый мотор драйверы реле сигналов униполярными шаговыми техника через тепловой кабель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: размер и пропорции анализ частиц сферической и эллипсоидальной PLGA. (A) ТЕА и (B) SEM изображения сферических, 1D растягивается обьемная эллипсоидальной и 2D натянутой сплюснутой эллипсоидальной PLGA (A) наночастиц и микрочастиц (B). (C) сферических наночастиц были размером НТА и решимости быть 224 Нм в диаметре. SEM изображения PLGA микрочастиц были проанализированы для распределения сферических частиц по размерам (D) и (E) пропорции всех частиц фигур. (C) воспроизведены и адаптированы с разрешение от небольших13, авторское право Wiley-VCH 2015. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: характеристика и функциональной оценки сферических и обьемная эллипсоидальной микро aAPC. (A) спряжение эффективность дневно помечены загрузки пептидной MHC IgG димер и анти CD28 антитела к поверхности сферических и обьемная эллипсоидальной микрочастиц. (B) CD8 + Т-клетки были помечены CFSE и инкубировали с сферических и 1D-протянул микро aAPC на 0,01, 0,1 и 1 мг дозы, или элементы управления не существительное. После 3 дней клетки были оценены проточной цитометрии для оценки распространения. (C) Т-клетки были также оценены после 7 дней ручной подсчет. Клеток были нормализованы в начальное число для вычисления фолд расширение. Для сравнения между обьемная эллипсоидальной и сферических раз расширение * = p < 0,05, ** = p < 0.01, и *** = p < 0,001. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) для 3 реплицирует. Воспроизведены и адаптированы с разрешение от биоматериалов12, авторское право Elsevier 2014. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: характеристика и функциональной оценки сферических и обьемная эллипсоидальной нано aAPC. (A) спряжение эффективность дневно помечены загрузки пептидной MHC IgG димер и анти CD28 антитела к поверхности наночастиц сферических и обьемная эллипсоидальной. (B) CD8 + Т-клетки были помечены CFSE и инкубировали с сферических и обьемная эллипсоидальной нано aAPC различной фолд-стрейч на 0,01, 0,1 и 1 мг дозы. После 3 дней клетки были оценены проточной цитометрии для оценки распространения. (C) Т-клетки инкубировали с обьемная эллипсоидальными частицами различных лоно стрейч (начиная от 1.5 до 3.5) были также оценены после 7 дней ручной подсчет. Клеток были нормализованы необработанных состояния для расчета фолд расширение. * = p < 0,05, ** = p < 0.01, и *** = p < 0,001 по сравнению с сферической. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) для 3 реплицирует. Воспроизведены и адаптированы с разрешение от небольших13, авторское право Wiley-VCH 2015. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол подробности универсальным методом для точного поколения анизотропной полимерных частиц. Тонкая пленка, растяжения техники, описанные здесь, масштабируемые, воспроизводимые и недорогой. Альтернативные методы для генерации анизотропной частицы страдают от многих ограничений, включая высокую стоимость, низкую пропускную способность и ограниченные гранулометрического. Тонкая пленка, растяжения подход также выгодно, потому что частицы изменяются быть анизотропной после синтеза и, в результате, совместим с широкий спектр размеров частиц и методов синтеза. Рисунок 1 детали установки автоматической двумерной растяжения устройства. Это устройство также может использоваться без электронных компонентов, вручную поворачивая винты до тех пор, пока фильм достиг желаемой степени растяжения. Однако мы обнаружили, что автоматизированный процесс является гораздо более последовательное и быстрое чем ручной работы15. Различные методы были разработаны для синтезировать анизотропной частицы, например microfluidic подходы17,18,19, слой за слоем покрытия21и другие подходы, снизу вверх синтез21 ,22. Однако эти подходы не позволяют сильный контроль над геометрии частиц и как не универсальны с точки зрения формы, которые могут быть созданы и частиц материалов, которые могут быть использованы. Популярный метод сверху вниз для изготовления nonspherical частицы — частицы репликация в Non-смачивающий шаблоны (печать)24. Хотя печати обеспечивает точный контроль над форма частиц, он требует дорогих машин и не как доступным и простым в реализации, как тонкая пленка, растяжения метода.
Один эмульсии техника может использоваться для изготовления PLGA частиц различных размеров, начиная от nano микромасштабной12,13. По различной амплитуды скорости или sonication гомогенизации тонкодисперсный и наночастиц размер, соответственно, можно модулировать. После того, как были получены сферических частиц, тонкая пленка, растяжения метода, описанного здесь может использоваться деформировать частицы в различные формы15. В этом протоколе мы описываем поколения обьемная и сплюснутой эллипсоидальными частицами, растягивая в одном или двух измерениях, соответственно. Сферические частицы брошен в тонкий пластиковый фильм, который нагревается выше стеклования PLGA и растягивается в одной или двух измерениях деформировать частицы. Пропорции частиц очень управляемым. Настройка степени пленка стретч, пропорции частиц можно модулировать, и мы обнаружили, что пропорции что измерения частиц тесно связано с прогнозируемым значением12,13. Различные другие формы могут создаваться путем изменения температуры во время растяжения или степень растяжения. Например двояковогнутые discoidal частицы, напоминающие форму красных кровяных клеток могут быть получены путем растяжения микрочастицы 1,5 раза в два измерения на 90 ° C. 15. Этот фильм растяжения техники также были используется для преобразования сферических частиц из полистирола в многих анизотропной фигур, включая червей, бочки и прямоугольные диски21. Фильм, растяжения устройства могут быть использованы, вручную управляя винты или устройство может быть автоматизирована, как показано на рисунке 1 , чтобы сделать этот процесс более эффективным и последовательным15. Эта простая техника надежно производит анизотропной частицы, которые сохраняют свою форму при физиологических условиях24. Кроме того, этот метод был применен в других полимерных материалов, в дополнение к PLGA, например поликапролактон (PCL) и гибридных частицы PLGA и поли (бета аминокислоты Эстер) (PBAE).
Этот протокол также описывает, как PLGA частиц различных размеров и форм могут быть проспряганное с поверхности белки, необходимые для активации клеток CD8 + T в качестве aAPC. Белки могут быть ковалентно конъюгированных анизотропные и сферических PLGA микро - и наночастиц, EDC/NHS опосредованной муфта первичных аминов на белки карбоксильных групп на поверхности частиц. Эффективность спряжение белка может быть измерена путем соединения дневно обозначенные белка на поверхности частиц, как описано в настоящем Протоколе, и мы обнаружили, что эта техника пары белковых частиц на 15-20% эффективности12, 13. Обьемная эллипсоидальной микро - и наночастиц aAPC являются более эффективными, чем их сферических коллегами на активации CD8 + T мобильных распространения и расширения в пробирке12,13. Эллипсоидальной aAPC усилили связывания и взаимодействие с Т-клеток из-за их большую поверхность контакта12. Анизотропные частицы также имеют превосходные свойства над сферических частиц в естественных условиях из-за их более накопление и сопротивление фагоцитоза13. Эта платформа является весьма модульной и имеет потенциал, чтобы быть адаптирована для многих других приложений доставки наркотиков. С помощью этой процедуры, полимерных частиц перестраиваемый формы и размера могут быть созданы и поверхности частицы могут быть проспряганное с любой протеин интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
ВКО (DGE-1746891) и KRR (DGE-1232825) Спасибо программа NSF исследовательских стипендий для поддержки. Оперативной памяти благодаря национальной исследовательской службы премии NIH NCI F31 (F31CA214147) и достижение награды для стипендий коллежа ученых для поддержки. Авторы благодарят NIH (R01EB016721 и R01CA195503), исследования, чтобы предотвратить слепоту Джеймс и Кэрол бесплатно Катализатор премии и Институт УДХ Bloomberg-Kimmel рака иммунотерапия для поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
