一种自动测定果蝇在空间和时间温度变化中的性能的方法

温度是一个持续的环境因素, 影响生物体的功能和行为¹。纬度和海拔高度的差异导致气候有机体类型的差异, 这导致了他们对温度^2,3反应的进化选择。生物体通过形态学、生理和行为适应来响应不同的温度, 从而在其特定环境下实现最佳性能⁴。例如, 在果蝇中, 不同地区的人群在不同温度下有不同的温度偏好、体型、发育时间、长寿、繁殖力和行走性能^{2 ,5,6,7}。不同起源蝇之间的多样性由遗传变异和塑性基因表达^8,9部分解释。同样, 不同区域的果蝇种类在温度梯度上分布不同, 并显示耐极端热和冷试验的差异^10、11、12。

果蝇最近也成为了选择的模型, 了解温度知觉的遗传和神经基础^{13,14,15,16,17}。一般来说, 成人苍蝇通过在天线和通过温度传感器在大脑^13,14,15,16的冷和热外围温度传感器感知温度^,17,18,19,20. 热温度的外围受体表示Gr28b¹⁶或发热²¹, 而外围冷受体的特征是Brivido¹⁴。在大脑中, 温度由表达TrpA1¹⁵的神经元处理。对这些途径突变体的行为研究正在提高我们对温度如何处理的理解, 并对不同地区果蝇种群的变化机制进行深入的了解。

在这里, 我们描述一个温度控制的竞技场, 产生快速和精确的温度变化。调查人员可以对这些变化进行预编程, 这样就无需人工干预即可实现标准化和可重复的温度操纵。飞行记录和跟踪与专门的软件, 以确定他们的位置和速度在实验的不同阶段。本协议中提出的主要测量方法是在不同温度下的行走速度, 因为它是一种生态学相关的生理性能指标, 可识别个体的热适应性⁵。与温度受体突变体一起, 这种技术可以帮助揭示细胞和生化水平的热适应机制。

1. 飞行食品培养基的制备

1. 将 1 l 的自来水倒入2升玻璃杯中, 加入一个磁力搅拌棒。将烧杯放在300摄氏度的磁性热板上, 直到达到沸腾温度。
2. 搅拌在500发/分钟, 并添加以下内容:10 克琼脂, 30 克葡萄糖, 15 克蔗糖, 15 克玉米粉, 10 克小麦胚芽, 10 克大豆面粉, 30 克糖蜜, 和 35 g 活性干酵母。
3. 当混合泡沫剧烈时, 将热板温度降低到120摄氏度, 同时继续搅拌。
4. 将热板温度进一步降低到30摄氏度后10分钟, 并继续搅拌, 直到混合冷却到48摄氏度。通过直接将温度计插入到食物中而不触及烧杯壁来测量温度。
5. 将 2 g 的 p-羟基苯甲酸甲酯溶解成10毫升的96% 乙醇, 并加入到混合物中, 再加上5毫升的1米丙酸。持续搅拌3分钟。
6. 关闭热板, 倒入45毫升的食物到饲养瓶和6.5 毫升的食物到收集瓶。

2. 苍蝇的制备

1. 将20只雄性和20只雌性苍蝇放入含有45毫升苍蝇食品培养基的饲养瓶中。在3到4天后, 将苍蝇转到新瓶子, 然后点击它们, 然后敲击到新鲜的瓶子里。三更改后丢弃苍蝇。
   1. 将瓶子放在孵化器的12小时 light/12-h 暗循环下, 恒温温度为25摄氏度。
      注意: 新一代苍蝇将在十天后 eclose。
2. 麻醉新 eclosed 在二氧化碳垫上飞行最多4分钟, 并收集他们在 2.5 x 9.5 厘米飞行饲养小瓶与6.5 毫升飞行食品培养基使用画笔。
   1. 收集只有处女苍蝇, 并把他们按性别分成20苍蝇每饲养小瓶组。
   2. 将小瓶放入孵化器5-7 天, 每2-3 天和实验前几天将苍蝇更换为新的小瓶。

3. 灯光框架

1. 制作10厘米长、4厘米宽、4厘米高和0.5 厘米厚的木制框架。
2. 在每个短边上, 创建4厘米长、4厘米高度和1.5 厘米宽的边框, 使其朝向木框架的内部区域。使边框的内部面保持打开状态。
3. 在木框架的一个长边和短边的每个边界处, 钻出直径为0.5 厘米的两个孔。
4. 在短边的每个边界内放置10厘米的暖白色 LED 条。剥下 LED 条的背面, 立即将其粘在原位。
   注意: 对于需要消除照明的实验, 可将暖白 led 条替换为红外线 led 条。
5. 将 led 条的一端连接到开关电源及其另一端到相反边界的 led 条上。
6. 打开开关电源以验证两个 LED 条是否打开。
7. 用一张白色的纸盖住每个边框的开口面。
8. 将另一张纸粘附到长边的每个内部阶段。

4. 温度控制竞技场

1. 打开温度控制的竞技场 (图 1A和1C)。确保风扇开始运行, 铝环开始升温。
2. 使用 USB 电缆将温度控制的竞技场连接到运行带有温度序列的TemperaturePhases脚本的控制计算机上。
3. 在控制计算机中打开TemperaturePhases脚本, 并验证是否正确设置了温度序列 (视频 1)。
   1. 通过验证 "par", 检查每个实验阶段的持续时间是否设置为六十年代。StimulusDur "等于六十年代。
   2. 检查 1) 等于所需的相位数, 2) 迭代开/关设置的指示性红光发光二极管 (led), 3) 2 °c 每相温度升高, 和 4) 16 °c 作为启动温度所有正确下 "启动实验块 "部分。
      注意: 允许苍蝇适应飞行竞技场7分钟在16摄氏度, 以避免人为增加速度在第一个实验阶段 (图 2)。
   3. 运行TemperaturePhases脚本。该软件将初始化5秒, 在 "竞技场" 中确定。等待 "然后停止。
   4. 按下键盘的空格键开始运行实验阶段, 一旦苍蝇被吹入飞竞技场 (步骤 5.3)。
      注意: TemperaturePhases是当前控制方框的脚本;但是, 可以创建其他自定义脚本以使用此设备来适应不同实验的要求。
4. 使用相机的 USB 电缆将竞技场顶部的摄像机连接到录制计算机。
5. 在录制计算机中打开视频录制程序 (参见材料表), 选择 "文件 |新的电影录制 "。将会打开显示相机图像的屏幕。
   1. 确保相机图像捕获竞技场的所有边缘和指示性红色 led。
   2. 通过按屏幕底部边缘的红色按钮开始录制, 在舞台周围设置灯光帧后显示相机图像 (步骤 5.4)。
      注意: 光照的细微变化会影响跟踪的准确性。建议通过固定设备的位置来保持温度控制的竞技场恒定的照明。

5. 温度行为实验

1. 准备飞行竞技场 (图 1C)。
   1. 将一束白色导电胶带放在铜砖的顶部, 确保覆盖所有边缘。
   2. 在铜砖周围放置加热铝环。环的边缘完全适合铜砖, 因此它总是放置在同一位置。
   3. 用干净的纸巾清洁玻璃盖, 把它放在铝环的顶部, 留下一个可以吹飞的缝隙。
      注意: 在实验前, 用渗硅剂涂上玻璃盖, 形成光滑的表面。应用渗硅剂24小时, 用清水冲洗。
2. 运行TemperaturePhases脚本 (步骤 4.3.3) 并打开视频录制程序 (步骤 4.5)。
3. 从饲养小瓶 (步 2.2.2) 吹飞到飞行竞技场 (如图 3中的1个雄蝇).
   1. 从孵化器中取出一小瓶苍蝇, 点击两次, 迫使它们进入底部, 用嘴吸引器一只苍蝇, 然后关闭小瓶并把它放回孵化器。
   2. 通过在玻璃罩和铝环之间留下的缝隙 (步骤 5.1.3) 将苍蝇放在竞技场上。
   3. 将玻璃盖和铝环之间的缝隙按下, 直到飞向飞行竞技场时, 它才到达铝环的边缘。
4. 在竞技场周围放置灯光框以确保对称照明。
   1. 在飞行竞技场周围的灯光框架 (图 1C) 上标记位置 (例如, 使用永久标记), 以确保框架始终放置在同一位置。
5. 使用视频录制程序 (步骤 4.5.2) 开始录制, 然后按控制计算机键盘上的空格键开始运行实验阶段 (步骤 4.3.4)。
6. 完成所有实验阶段后, 请将视频保存在. mp4 或. avi 格式中, 然后用吸嘴的方式从飞行竞技场中移除苍蝇。
   注意: 实验阶段的结束可由指示性红色 led 指示灯关闭或TemperaturePhases脚本停止决定。
   1. 在录制程序中按屏幕底部边缘中间的 "停止" 按钮停止视频录制。按 "文件 |另存为 "保存视频。

6. 视频跟踪和数据分析

1. 使用FlySteps跟踪软件 (视频 2) 跟踪视频。
   1. 在 "FlyTracker" 文件夹中打开 "configuration_file"。
   2. 在 "video_folder" 中设置视频的位置和 "video_files" 中视频的名称。
   3. 根据竞技场边缘多个点的 (x、y) 像素坐标, 指定 "arena_settings" 中的飞行竞技场的边框。
   4. 根据 led 中心位置的 (x、y) 像素坐标, 在 "led_settings" 中指定指示性红色 led 的位置。
   5. 通过在 "arena_settings" 中设置 "调试" 到 "true", 单击 "保存", 然后在终端运行脚本, 检查飞行竞技场的边界位置。视频的屏幕截图将以 "arena_settings" 中输入的坐标形成的蓝色正方形显示。
      注: 此正方形环绕要跟踪的区域。
   6. 更改 "调试" 在 "arena_settings" 到 "false", 单击 "保存", 并再次运行在终端屏幕。
      注意: 这将启动跟踪过程。
      注意: 苍蝇可以走出跟踪区域到加热铝环。这种情况发生在实验的第一秒, 之后苍蝇停止接触加热环并留在跟踪区域内。
      注意: 视频可以根据实验者的喜好跟踪其他跟踪软件。
2. 使用跟踪软件提供的每只苍蝇的 (x,y) 位置来计算温度性能的利息测量值。可以使用自定义脚本 ( FlyStepsAnalysis 补充)。
3. 使用统计软件 (参见材料表), 比较不同飞行组的温度性能曲线, 重复测量 (RM) 方差 (方差分析) 和后向多比较。

温度控制的竞技场 (图 1A) 由三个铜瓦组成, 其温度可通过可编程电路单独控制。每块铜瓦都有一个温度传感器, 可以向可编程电路提供反馈。电路激活电源以增加每个磁贴的温度。被动式热电元件充当恒定的加热元件, 以保持所需的温度, 而风扇冷却的散热片提供恒定的冷却。温度变化的幅度以非线性的方式决定了过程的速度。增加2摄氏度只需要0.1 秒, 增加18摄氏度需要4秒。连接到可编程电路的屏幕 (图 1C) 通知用户每个磁贴中温度传感器测量的温度。铜砖四周环绕着铝环, 其周围围绕着半导体, 不断加热至50摄氏度 (图 1B和1C)。这枚戒指形成了飞行竞技场的边缘 (图 1C), 在其中放置苍蝇的区域。飞行竞技场覆盖着硅化玻璃罩 (图 1A和1C), 提供3毫米高的空间, 确保苍蝇可以行走但不能飞行。旁边的飞行竞技场是两个红色的 led (图 1C), 可以编程, 以标记不同的实验阶段。例如, 对于图 2A所示的结果, 每个 led 都与不同的温度相关联, 而在图 2B中, 每个 led 指示六十年代。FlySteps软件可以在每个指示灯亮起时进行注册, 研究员随后可以使用此信息根据温度或时间自动确定实验阶段。

温度控制的竞技场可以用来比较不同遗传背景的苍蝇对动态温度变化的行为反应。例如, 不同物种的苍蝇可以暴露在逐渐增加的温度 (图 3) 来比较热性能的差异。所有物种的速度随着温度的增加而增加, 直到达到最大性能点, 之后它腐烂并消亡。然而, 每个物种都有一个特定的响应曲线, 具有具体的最大响应速度和热容差。以前的报告表明, 不同物种的果蝇在发育时间、长寿、生育力、身体尺寸、性传播和耐温度3、6、7 之间存在差异。 ,8,22。因此, 我们在温度梯度中对物种特定运动的描述增加了这一工作体。

温度控制的竞技场也可用于探索基于温度的调节实验的响应。这种方法最简单的形式是一种操作性条件反射调理范式, 在这种模式中, 苍蝇被训练喜欢竞技场的一侧而不是另一边, 通过预热将避免23、24、25的一侧。我们将单独的苍蝇暴露在中间的40摄氏度和一侧的瓷砖上, 同时将另一侧的瓷砖置于舒适的22摄氏度 (图 4)。野生型苍蝇迅速停止沿竞技场移动, 并保持在舒适的位置。相比之下, 经典的记忆突变体傻瓜一直在探索竞技场, 花费的时间比控制在舒适的位置要少。野生型苍蝇和傻瓜突变体的性能之间的差异变得更大时, 所有的瓷砖设置为22摄氏度, 并在治疗组之间进行比较。与野生型苍蝇相比,傻瓜突变体的训练和测试阶段的差异也更大 (图 4)。这些结果表明记忆在舒适的位置上的影响。

温度和位置的组合也有助于了解不同温度受体在动态温度变化过程中的作用。我们将单个d. 果蝇 Gr28b和TrpA1GAL4 突变体暴露于增加温度 (每六十年代增加2摄氏度), 同时在22摄氏度下提供舒适的位置 (图 5)。舒适的位置从左向右移动, 反之亦然, 每次迭代。结果表明, 周围温度受体Gr28b突变体表现为控制, 因为温度升高, 它们在舒适的位置上花费更多的时间。然而, 脑温度受体TrpA1GAL4 突变体不受温度升高的影响, 也不会改变其在竞技场中的位置。TrpA1GAL4 突变体曲线的增加和减少显示了苍蝇的效果, 在它变得舒适之前已经坐在舒适的位置, 在这个阶段仍然存在。TrpA1GAL4 曲线的峰和谷的一致性表明, 这些苍蝇仍然在大部分的实验;因此, 当他们的位置被认为是舒适的时候, 他们总是被计算在内。通过对录制视频的目视检查证实了这一结论。这些结果支持以前的生理学报告, 表明, 对快速和大变化的外围感知不依赖于Gr28b. d17和苍蝇有一个主要的中央机制, 以感知温度基于TrpA1 14,21。

图 1: 温度控制竞技场示意图.(a) 对温度控制的竞技场的横向看法。可编程电路将电源和温度传感器连接到铜瓦下的加热元件, 以控制其温度。瓷砖通过连接到风扇的散热片不断冷却。一个加热的铝环, 玻璃盖搁在瓷砖周围。(B) 热成像显示在24摄氏度 (顶部) 和侧面瓷砖在24摄氏度处设置的瓷砖, 中间瓷砖位于30摄氏度 (底部)。(C) 竞技场的顶部景色。相机记录铜砖、铝环和红色 led, 然后自动确定实验阶段。在方框的角落, 没有由相机记录的屏幕显示当前的瓷砖温度。(D) 光环: 在白纸盒内的两个暖白色 LED 条, 确保整个竞技场的恒定和对称照明。请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 2: 在开始温度协议之前, 苍蝇必须适应竞技场.(A) 单雄蝇被引入竞技场, 并允许在恒定的16摄氏度下探索1分钟, 之后气温开始增加。(B) 单飞蝇暴露于16摄氏度、20摄氏度或24摄氏度 (无组间差异; 双向方差分析 f (2570) = 4.156、p = 0.162) 在实验开始时的运动比5分钟 (双向 RM 方差分析 F (9570) = 7.803、p < 0.0001) 更高。数据是平均值和标准误差的平均 (± SEM) 20 处女女性苍蝇5到7天的测试超过多日。星号表示组之间有显著差异 (*** p < 0.0001;Tukey 的多重比较测试, p = 0.05)。请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 3: 5 个果蝇物种的运动, 暴露在逐渐增加的温度.从温带 (蓝色), 热带 (红色) 和世界性 (褐色)果蝇物种的单个雄性苍蝇暴露在上升的温度梯度 (每六十年代2摄氏度) 介于16和46摄氏度之间。前7分钟一直在22摄氏度, 允许苍蝇探索竞技场。物种差异显著 (双路 RM 方差分析 F (470) = 28.46, p < 0.001)。(a) 当引入竞技场时,果蝇(棕色; 填充圆圈) 更快。(b)亚库巴(红色; 空方块) 温度升高时速度更快。(c) D. 铃木(布朗; 填充正方形) 比其他国际大都会的飞行速度慢。(d) d. 拟果蝇(褐色; 空圆圈) 在d. 果蝇的最大点处衰变。每个点代表15个男性苍蝇5到7天的平均值 (± SEM) 测试了几天。符号所指示的意义 (♦ = 与所有的差异, p < 0.0001; † = 除d. 果蝇以外的所有差异, p < 0.0001; · = 与 d. 果蝇的差异, p < 0.01; 0.001;= 命名组之间的差异, p < 0.0001;Tukey 的多重比较测试, p = 0.05)。请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 4: 温度控制的竞技场可用于操作性条件反射调节.D.腹板应变 (野生型; 黑色边框) 和dnc1 (傻瓜; 红色边界) 突变体在22摄氏度后, 在中间和对面的侧瓦升温到40摄氏度 (训练, 无模式)。然后通过将所有切片设置为22摄氏度 (测试; 网格模式) 来测试加热区域的内存。苍蝇被限制在一半的实验中喜欢左边的瓷砖, 然后在另一半的右边平铺。在训练和测试过程中, 测量切片内总时间的百分比为22摄氏度, 以比较性能。组差异显著 (单向方差分析 F (376) = 23.23, p < 0.0001),傻瓜表现比野生型整体差。数据是平均 (± SEM) 20 处女女性苍蝇5到7天的测试超过几天。星号表示组之间的显著差异 (*** p > 0.0001; *** p > 0.001; ** p > 0.01;Tukey 的多重比较测试, p = 0.05)请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 5: 当提供舒适的位置时, 温度突变体对温度升高的响应.温度突变体Gr28b (绿色; 正方形) 通过增加舒适区域中的时间百分比 (双路 RM 方差 F (138) = 0.5107, p = 0.479), 以控制 (w1118、黑色、圆圈) 响应。TrpA1GAL4 突变体 (黄色; 三角形) 不同于控件 (w1118, 黑色), 因为它们不会增加舒适区域中的时间, 因为温度增加 (双向 RM 方差分析 F (138) = 1.670, p = 0.019)。数据是平均 (± SEM) 20 男性苍蝇5到7天的测试超过几天。TrpA1GAL4 与Gr28b和对照有显著差异 (p < 0.05;Tukey 的多重比较测试, p = 0.05)。请点击这里查看这个数字的更大版本.

作者声明他们没有竞争的经济利益。