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一种测定性能的自动化方法 果蝇 对时空温度变化的响应

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DOI：

10.3791/58350

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2018年10月12日

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1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen, 2Department of Cell Biology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Ruijsink Dynamic Engineering, 4Department of Psychology, University of Groningen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种自动测定运动能力的实验方案 果蝇 利用可编程温控实验平台，在时间和空间上实现快速且精确的温度变化，以研究温度变化的影响。

摘要

温度是一种普遍存在的环境因素，影响着物种的分布和行为。不同物种的 果蝇 果蝇根据其生理耐受性和适应能力，对温度变化具有特定的反应。 果蝇 果蝇也具有温度感知系统，该系统已成为理解变温动物温度信息神经处理基础的关键。本文介绍了一种温度可控的实验装置，能够实现快速、精确的温度变化，并具备时间和空间上的控制能力，可用于探究单个果蝇对温度变化的行为反应。将单个果蝇置于该装置中，接受预设的温度刺激，例如均匀渐进的升温过程以确定其反应规范，或同时施加空间分布的温度梯度以测定其温度偏好。系统可自动追踪个体果蝇的运动，从而量化其移动速度或位置偏好。该方法可用于在较宽的温度范围内快速量化果蝇的行为反应，以构建温度性能曲线 黑腹果蝇 或其它体型相似的昆虫。此外，该方法可用于遗传学研究，以量化突变体或野生型果蝇的温度偏好及反应。该方法有助于揭示热适应性物种形成及其神经机制的基础。

引言

温度是一种持续存在的环境因素，影响着生物体的功能和行为1。纬度和海拔的差异导致生物所暴露的气候类型不同，从而引起生物在温度响应方面的进化选择2,3。生物体通过形态学、生理学和行为学上的适应来应对不同的温度，以在特定环境中实现最佳表现4。例如，在果蝇Drosophila melanogaster中，来自不同地区的种群在温度偏好、体型大小、发育时间、寿命、繁殖力以及在不同温度下的行走能力方面均存在差异2,5,6,7。不同来源果蝇之间观察到的多样性部分归因于遗传变异和基因表达的可塑性8,9。类似地，来自不同地区的Drosophila物种在温度梯度中的分布不同，并且在耐受极端高温和低温的能力测试中表现出差异10,11

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方案

1. 果蝇培养基的制备

  1. 将1升自来水倒入2升的玻璃烧杯中，并加入一个磁力搅拌子。将烧杯置于磁力加热板上，加热至沸腾温度（300 °C）。
  2. 以500转/分钟的速度搅拌，并依次加入以下成分：10克琼脂、30克葡萄糖、15克蔗糖、15克玉米粉、10克小麦胚芽、10克大豆粉、30克糖蜜和35克活性干酵母。
  3. 当混合物剧烈起泡时，将加热板温度调低至120 °C，同时继续搅拌。
  4. 10分钟后，进一步将加热板温度降至30 °C，并持续搅拌，直至混合物冷却至48 °C。测量温度时，将温度计直接插入食物中，避免接触烧杯壁。
  5. 将2克对羟基苯甲酸甲酯溶解于10 mL的96%乙醇中，与5 mL的1 M丙酸一同加入混合物中，继续搅拌3分钟。
  6. 关闭加热板，将45 mL培养基倒入饲养瓶中，6.5 mL培养基倒入收集管中。

2. 果蝇的准备

  1. 将20只雄性和20只雌性果蝇放入含有45 mL果蝇培养基的培养瓶中。3至4天后，轻敲培养瓶使果蝇沉降，然后转移至新的培养瓶中。在经历三次换瓶后，弃去果蝇。
    1. 将培养瓶置于培养箱中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件，温度恒定为25 °C。
      注意：新一代果蝇将在十天后羽化。
  2. 使用二氧化碳垫对新羽化的果蝇进行麻醉，时间不超过4分....

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结果

温度可控的实验区域（图1A）由三块铜板组成，每块铜板的温度可通过可编程电路独立控制。每块铜板均配有温度传感器，可将实时温度反馈至可编程电路。电路通过启动电源来升高每块铜板的温度。被动式热电元件作为恒定加热源以维持设定温度，同时由风扇冷却的散热片提供持续冷却。温度变化幅度以非线性方式决定升温过程的速度：升高2 °C仅需0.1 s，而升高18 °C则需要4 s。连接至可编程电路的显示屏（图1C）可向用户显示各铜板上温度传感器测得的温度值。铜板周围环绕着一个由外围半导体持续加热至50 °C的铝环（图1B和 1C）。该铝环构成果蝇实验区（图1C）的边界，即放置果蝇的区域。果蝇实验区上方覆盖有硅化玻璃盖（图1A和 1C）.......

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讨论

本文介绍了一种自动化的温度可控实验装置（图1），可在时间和空间上实现精确的温度变化。该方法不仅可使单个Drosophila暴露于预设的渐进式升温过程（图2和图3），还可接受动态温度刺激，其中果蝇实验区域的每个单元均可被独立加热至不同温度（图4和 图5）。

这种温度可控的实验装置采用了一种创新的加热方法。与传统方法中使用热电Peltier元件直接改变瓷砖温度不同，该装置通过电流加热与铜质瓷砖相连的铜质块体，果蝇则被放置在顶部。铜质块体通过连接风扇的散热片持续冷却。在铜块加热至目标温度后，采用类似Peltier的元件维持其设定温度。由于这些元件并非主要的热源，所承受的热应力更小，从而延长了使用寿命，并实现了更快的温度变化。一个可编程电路协调.......

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作部分得到了格罗宁根大学行为与认知神经科学项目的奖学金、墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT）提供的研究生奖学金（授予Andrea Soto-Padilla）以及约翰·邓普顿基金会资助的关于时间研究项目的资助（授予Hedderik van Rijn和Jean-Christophe Billeter）。我们还感谢Peter Gerrit Bosma参与开发FlySteps追踪系统。

脚本 温度阶段，飞行步骤 和 FlyStepAnalysis 可在补充信息以及以下临时且公开的链接中找到：
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Arduino DueArduinoA000062软件 RUG
电子电路板Ruijsink Dynamic EngineeringFF-Main-02-2014
升压电源XP-Power 48. V 65 WECS65US48设定为 53 伏特
瓷砖加热电源XP-Power 15. V 80 WVFT80US15
冷却电源XP-Power 15. V 130 WECS130U515
帕尔帖元件Marlow IndustriesRC12-42 个元件，直流电源控制
散热片Fisher TechnikLA 9/150-230V振动隔离设计
温度传感器Measurement SpecialtiesMCD_10K3MCD1微型热敏电阻探头
铜块/瓷砖Ruijsink Dynamic EngineeringFF-CB-01-2014
铝环Ruijsink Dynamic EngineeringFF-RoF-02-2015
Tesa 4104 白色胶带 25 x 66 mmRS Components111-2300 白色导电胶带
红色 LEDLucky Ligtll-583vc2c-v1-4da波长介于 625 nm，20 mA 和 6 V
暖白光 LED 灯带LedstripkoningHQ-3528-SMD每米 60 个 LED
开关电源通用型T-36-12
Logitech c920Logitech Europe S.APN960-001055
QuickTime 播放器Apple Computer录制程序
轨迹分析软件R软件包：pacman
轨迹分析软件MATLAB
热成像仪FLIR T400sc
图表与统计分析软件Graph Pad Prism
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100ML硅化剂
果蝇培养瓶Flystuff32-1306 盎司果蝇品系培养瓶
FlypadFlystuff59-114
果蝇培养管Dominique Dutscher789008果蝇窄管 25x95 mm
培养箱SanyoMIR-154
磁力加热搅拌器Heidolph505-20000-00MR Hei-Standard
琼脂Caldic Ingredients B.V.010001.26.0
葡萄糖Gezond&wel1019155右旋糖/葡萄糖
蔗糖Van Gilse砂糖
玉米粉Flystuff62-100
小麦胚芽Gezond&wel1017683
大豆粉Flystuff62-115
糖蜜Flystuff62-117
活性干酵母Red Star
TegoseptFlystuff20-258100%

参考文献

  1. Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
  2. Rajpurohit, S., Schmidt, P. S.

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重印与许可

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