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一种测定性能的自动化方法 果蝇 对时空温度变化的响应

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DOI：

10.3791/58350

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2018年10月12日

 ,  ,  ,  , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen, 2Department of Cell Biology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Ruijsink Dynamic Engineering, 4Department of Psychology, University of Groningen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种自动测定运动能力的实验方案 果蝇 利用可编程温控实验平台，在时间和空间上实现快速且精确的温度变化，以研究温度变化的影响。

摘要

温度是一种普遍存在的环境因素，影响着物种的分布和行为。不同物种的 果蝇 果蝇根据其生理耐受性和适应能力，对温度变化具有特定的反应。 果蝇 果蝇也具有温度感知系统，该系统已成为理解变温动物温度信息神经处理基础的关键。本文介绍了一种温度可控的实验装置，能够实现快速、精确的温度变化，并具备时间和空间上的控制能力，可用于探究单个果蝇对温度变化的行为反应。将单个果蝇置于该装置中，接受预设的温度刺激，例如均匀渐进的升温过程以确定其反应规范，或同时施加空间分布的温度梯度以测定其温度偏好。系统可自动追踪个体果蝇的运动，从而量化其移动速度或位置偏好。该方法可用于在较宽的温度范围内快速量化果蝇的行为反应，以构建温度性能曲线 黑腹果蝇 或其它体型相似的昆虫。此外，该方法可用于遗传学研究，以量化突变体或野生型果蝇的温度偏好及反应。该方法有助于揭示热适应性物种形成及其神经机制的基础。

引言

温度是一种持续存在的环境因素，影响着生物体的功能和行为1。纬度和海拔的差异导致生物所暴露的气候类型不同，从而引起生物在温度响应方面的进化选择2,3。生物体通过形态学、生理学和行为学上的适应来应对不同的温度，以在特定环境中实现最佳表现4。例如，在果蝇Drosophila melanogaster中，来自不同地区的种群在温度偏好、体型大小、发育时间、寿命、繁殖力以及在不同温度下的行走能力方面均存在差异2,5,6,7。不同来源果蝇之间观察到的多样性部分归因于遗传变异和基因表达的可塑性8,9。类似地，来自不同地区的Drosophila物种在温度梯度中的分布不同，并且在耐受极端高温和低温的能力测试中表现出差异10,11,12。

Drosophila 近来也已成为研究温度感知遗传与神经基础的首选模型13,14,15,16,17。总体而言，成年果蝇通过触角中的冷和热外周温度感受器以及大脑中的温度感受器来感知温度13,14,15,16,17,18,19,20。感知高温的外周受体表达 Gr28b.d16 或 Pyrexia21，而感知低温的外周受体则以 Brivido14 为特征。在大脑中，表达 TrpA115 的神经元参与温度信息的处理。针对这些通路突变体的行为学研究正在加深我们对温度信息处理机制的理解，并揭示了来自不同地区的 Drosophila 种群间机制的差异。

本文介绍一种可控制温度的实验装置，能够实现快速且精确的温度变化。研究者可预先编程设定这些温度变化，从而在无需人工干预的情况下完成标准化且可重复的温度调控。利用专用软件记录并追踪果蝇在实验不同阶段的位置和运动速度。本方案中主要的测量指标是果蝇在不同温度下的行走速度，因为该参数是反映生理机能的生态相关性指标，可用于评估个体的热适应能力5。结合温度受体突变体，该技术有助于揭示细胞和生化水平上热适应的机制。

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方案

1. 果蝇培养基的制备

  1. 将1升自来水倒入2升的玻璃烧杯中，并加入一个磁力搅拌子。将烧杯置于磁力加热板上，加热至沸腾温度（300 °C）。
  2. 以500转/分钟的速度搅拌，并依次加入以下成分：10克琼脂、30克葡萄糖、15克蔗糖、15克玉米粉、10克小麦胚芽、10克大豆粉、30克糖蜜和35克活性干酵母。
  3. 当混合物剧烈起泡时，将加热板温度调低至120 °C，同时继续搅拌。
  4. 10分钟后，进一步将加热板温度降至30 °C，并持续搅拌，直至混合物冷却至48 °C。测量温度时，将温度计直接插入食物中，避免接触烧杯壁。
  5. 将2克对羟基苯甲酸甲酯溶解于10 mL的96%乙醇中，与5 mL的1 M丙酸一同加入混合物中，继续搅拌3分钟。
  6. 关闭加热板，将45 mL培养基倒入饲养瓶中，6.5 mL培养基倒入收集管中。

2. 果蝇的准备

  1. 将20只雄性和20只雌性果蝇放入含有45 mL果蝇培养基的培养瓶中。3至4天后，轻敲培养瓶使果蝇沉降，然后转移至新的培养瓶中。在经历三次换瓶后，弃去果蝇。
    1. 将培养瓶置于培养箱中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件，温度恒定为25 °C。
      注意：新一代果蝇将在十天后羽化。
  2. 使用二氧化碳垫对新羽化的果蝇进行麻醉，时间不超过4分钟，并用毛笔将其收集至含有6.5 mL果蝇培养基的2.5 × 9.5 cm果蝇培养小管中。
    1. 仅收集处女蝇，并按性别分开，每管20只果蝇为一组。
    2. 将小管放入培养箱中培养5至7天，每隔2至3天或在实验前一天将果蝇更换至新的小管中。

3. 光源框架

  1. 制作一个长10 cm、宽4 cm、高4 cm、厚0.5 cm的木框。
  2. 在木框的每一条短边上，向木框内部区域制作一个长4 cm、高4 cm、宽1.5 cm的内向边框，边框的内侧面保持开放。
  3. 在木框的一条长边与两个短边边框的交界处，各钻一个直径为0.5 cm的孔。
  4. 在每条短边的边框内放置10 cm长的暖白色LED灯带。撕下LED灯带背面的保护层，立即将其粘贴固定。
    注意：在需要消除光照的实验中，可用红外LED灯带替代暖白色LED灯带。
  5. 将其中一个边框内LED灯带的一端连接至开关电源，另一端连接至对侧边框内的LED灯带。
  6. 打开开关电源，确认两条LED灯带均能正常点亮。
  7. 用一张白色纸张覆盖每个边框的开放侧。
  8. 将另一张纸粘贴至两条长边的内侧表面。

4. 温度可控实验环境

  1. 打开温控实验平台（图1A 和 1C），确保风扇开始运转，铝环开始升温。
  2. 使用 USB 线将温控实验平台连接至运行 TemperaturePhases 脚本的控制计算机，该脚本包含温度序列设置。
  3. 在控制计算机上打开 TemperaturePhases 脚本，并确认温度序列已正确设置（视频1）。
    1. 通过检查 "par.StimulusDur" 是否等于 60 秒，确认每个实验阶段的持续时间为 60 秒。
    2. 检查以下设置是否正确：1）阶段总数等于 所需实验阶段数；2）指示性红色发光二极管（LED）的循环开关设置；3）每个阶段温度升高 2 °C；4）起始温度为 16 °C，以上设置均应在 "Start the experimental block" 部分中确认。
      注意：让果蝇在 16 °C 下于果蝇实验平台中适应 7 分钟，以避免在初始实验阶段出现人为的速度升高现象（图2）。
    3. 运行 TemperaturePhases 脚本。软件将根据 "arena.Wait" 中设定的时间初始化 5 秒，随后停止。 
    4. 当果蝇被吹入果蝇实验平台后（步骤 5.3），按下键盘空格键以开始执行实验阶段。
      注意：TemperaturePhases 是当前用于控制设备的脚本；但也可根据其他实验需求创建自定义脚本以适配该装置。
  4. 使用相机的 USB 线将位于实验平台上方的相机连接至记录计算机。
  5. 在记录计算机上打开视频录制程序（参见 材料表），选择 "文件 | 新建视频录制"，此时将打开显示相机画面的窗口。
    1. 确保相机画面完整捕捉到实验平台的所有边缘以及指示性红色 LED。
    2. 当灯光框架已围绕实验平台设置完毕后（步骤 5.4），点击屏幕底部中央显示相机画面的红色按钮以开始录制。
      注意：光照的微小变化可能影响追踪的准确性。建议固定装置位置，以保持温控实验平台的照明恒定。

5. 温度行为实验

  1. 准备果蝇实验装置（图1C).
    1. 在铜瓦顶部贴上一条白色导电胶带，确保覆盖所有边缘。
    2. 将加热后的铝环放置在铜瓦周围。铝环的边缘与铜瓦完全贴合，因此始终放置在相同位置。
    3. 用干净的纸巾清洁玻璃盖，将其放置在铝环顶部，留出一个间隙，以便吹入果蝇。
      注意：实验前，用硅化剂处理玻璃盖片以形成光滑表面。硅化剂作用24小时后，使用前用水冲洗干净。
  2. 运行 温度相 脚本（步骤 4.3.3）并启动视频录制程序（步骤 4.5）。
  3. 将果蝇从培养管（步骤 2.2.2）吹入果蝇行为观测 arena例如，1只雄性果蝇 图3).
    1. 从培养箱中取出一个果蝇管，轻敲两次使果蝇沉至管底，用口吸管捕获一只果蝇，盖好管盖并将果蝇管放回培养箱。
    2. 将果蝇通过玻璃盖与铝环之间留出的缝隙（步骤5.1.3）放入实验区域。
    3. 在果蝇被引入果蝇竞技场后，立即推动玻璃盖，使其边缘与铝环边缘紧密贴合，以消除玻璃盖与铝环之间的间隙。
  4. 将光源框架放置在实验区域周围，以确保光照均匀对称。
    1. 标记位置（例如，使用永久性记号笔标记 Fly Arena 周围的灯光框架（图1C以确保框架始终放置在相同的位置。
  5. 启动视频录制程序（步骤 4.5.2）开始录制，然后按控制计算机键盘上的空格键以开始运行实验阶段（步骤 4.3.4）。
  6. 所有实验阶段结束后，将视频保存为 .mp4 或 .avi 格式，并用吸管将果蝇从 Fly Arena 中移除。
    注意：实验阶段的结束可通过两个指示性红色 LED 灯熄灭或通过 温度相 脚本停止。
    1. 通过按下录制程序屏幕底边中央的停止按钮，结束视频录制。按下 "文件 | 另存为" 以保存视频。

6. 视频追踪与数据分析

  1. 使用 FlySteps 追踪软件（视频 2）以追踪视频。
    1. 打开 "configuration_file.ini" 内部 "FlyTracker" 文件夹
    2. 设置视频的位置 "视频文件夹" 以及视频的名称在 "视频文件".
    3. 指定果蝇竞技场的边界 "arena_settings" 基于竞技场边缘多个点的 (x, y) 像素坐标。
    4. 指明指示性红色LED的位置 "led设置" 基于LED中心位置的（x，y）像素坐标。
    5. 通过设置检查 Fly Arena 边界的定位 "调试" 到 "是" 在 "arena_settings"，点击 "保存"，然后在终端中运行该脚本。输入坐标的视频画面截图将显示一个由输入坐标形成的蓝色方框 "arena_settings".
      注意：此方框围绕需追踪的区域。
    6. 改变 "调试" 在 "arena_settings" 到 "错误"，点击 "保存"，并在终端中再次运行该屏幕。
      注意：这将启动追踪过程。
      注意：果蝇可能会在实验开始后的最初几秒内爬出追踪区域，进入加热的铝环。此后，果蝇将停止接触加热铝环，并停留在追踪区域内。
      注意：可根据实验者的偏好，使用其他追踪软件对视频进行追踪。
  2. 利用追踪软件提供的每只果蝇的 (x,y) 坐标位置，计算温度表现相关的测量指标。自定义脚本（例如., FlySteps分析 在 补充材料）可以使用。
  3. 使用重复测量方差分析（RM ANOVA）比较不同果蝇群体的温度性能曲线 事后 使用统计软件进行多重比较（参见 材料表).

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结果

温度可控的实验区域（图1A）由三块铜板组成，每块铜板的温度可通过可编程电路独立控制。每块铜板均配有温度传感器，可将实时温度反馈至可编程电路。电路通过启动电源来升高每块铜板的温度。被动式热电元件作为恒定加热源以维持设定温度，同时由风扇冷却的散热片提供持续冷却。温度变化幅度以非线性方式决定升温过程的速度：升高2 °C仅需0.1 s，而升高18 °C则需要4 s。连接至可编程电路的显示屏（图1C）可向用户显示各铜板上温度传感器测得的温度值。铜板周围环绕着一个由外围半导体持续加热至50 °C的铝环（图1B和 1C）。该铝环构成果蝇实验区（图1C）的边界，即放置果蝇的区域。果蝇实验区上方覆盖有硅化玻璃盖（图1A和 1C）...

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讨论

本文介绍了一种自动化的温度可控实验装置（图1），可在时间和空间上实现精确的温度变化。该方法不仅可使单个Drosophila暴露于预设的渐进式升温过程（图2和图3），还可接受动态温度刺激，其中果蝇实验区域的每个单元均可被独立加热至不同温度（图4和 图5）。

这种温度可控的实验装置采用了一种创新的加热方法。与传统方法中使用热电Peltier元件直接改变瓷砖温度不同，该装置通过电流加热与铜质瓷砖相连的铜质块体，果蝇则被放置在顶部。铜质块体通过连接风扇的散热片持续冷却。在铜块加热至目标温度后，采用类似Peltier的元件维持其设定温度。由于这些元件并非主要的热源，所承受的热应力更小，从而延长了使用寿命，并实现了更快的温度变化。一个可编程电路协调...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作部分得到了格罗宁根大学行为与认知神经科学项目的奖学金、墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT）提供的研究生奖学金（授予Andrea Soto-Padilla）以及约翰·邓普顿基金会资助的关于时间研究项目的资助（授予Hedderik van Rijn和Jean-Christophe Billeter）。我们还感谢Peter Gerrit Bosma参与开发FlySteps追踪系统。

脚本 温度阶段，飞行步骤 和 FlyStepAnalysis 可在补充信息以及以下临时且公开的链接中找到：
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Arduino DueArduinoA000062软件 RUG
电子电路板Ruijsink Dynamic EngineeringFF-Main-02-2014
升压电源XP-Power 48. V 65 WECS65US48设定为 53 伏特
瓷砖加热电源XP-Power 15. V 80 WVFT80US15
冷却电源XP-Power 15. V 130 WECS130U515
帕尔帖元件Marlow IndustriesRC12-42 个元件，直流电源控制
散热片Fisher TechnikLA 9/150-230V振动隔离设计
温度传感器Measurement SpecialtiesMCD_10K3MCD1微型热敏电阻探头
铜块/瓷砖Ruijsink Dynamic EngineeringFF-CB-01-2014
铝环Ruijsink Dynamic EngineeringFF-RoF-02-2015
Tesa 4104 白色胶带 25 x 66 mmRS Components111-2300 白色导电胶带
红色 LEDLucky Ligtll-583vc2c-v1-4da波长介于 625 nm，20 mA 和 6 V
暖白光 LED 灯带LedstripkoningHQ-3528-SMD每米 60 个 LED
开关电源通用型T-36-12
Logitech c920Logitech Europe S.APN960-001055
QuickTime 播放器Apple Computer录制程序
轨迹分析软件R软件包：pacman
轨迹分析软件MATLAB
热成像仪FLIR T400sc
图表与统计分析软件Graph Pad Prism
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100ML硅化剂
果蝇培养瓶Flystuff32-1306 盎司果蝇品系培养瓶
FlypadFlystuff59-114
果蝇培养管Dominique Dutscher789008果蝇窄管 25x95 mm
培养箱SanyoMIR-154
磁力加热搅拌器Heidolph505-20000-00MR Hei-Standard
琼脂Caldic Ingredients B.V.010001.26.0
葡萄糖Gezond&wel1019155右旋糖/葡萄糖
蔗糖Van Gilse砂糖
玉米粉Flystuff62-100
小麦胚芽Gezond&wel1017683
大豆粉Flystuff62-115
糖蜜Flystuff62-117
活性干酵母Red Star
TegoseptFlystuff20-258100%

参考文献

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