Summary
Her presenterer vi en protokoll for å automatisk avgjøre Drosophila locomotor ytelse på skiftende temperaturer bruker en programmerbar temperatur-kontrollerte arena som gir rask og nøyaktig temperaturendringer i tid og rom.
Abstract
Temperaturen er en allestedsnærværende miljømessige faktoren som påvirker hvordan arter distribuere og oppfører seg. Ulike arter av Drosophila frukt fluer har bestemte svar til skiftende temperaturer sine fysiologiske toleranse og tilpasningsevne. Drosophila fluene har en temperatur sensing system som er blitt grunnleggende forståelse nevrale grunnlaget for temperatur på ectotherms. Vi presenterer her en temperatur-kontrollerte arena som tillater rask og presis temperaturendringer med timelige og romlig å utforske responsen av personlige flyr til skiftende temperaturer. Individuelle fluer plasseres i arena og utsatt for pre-programmert temperatur utfordringer, slik som uniform gradvis økning i temperaturen å avgjøre reaksjon normer eller romlig distribuert temperaturer samtidig å bestemme innstillinger. Enkeltpersoner spores automatisk, slik at kvantifisering av hastighet eller plassering foretrukket. Denne metoden kan brukes å kvantifisere raskt svar over en rekke temperaturen å avgjøre temperatur ytelse kurver i Drosophila eller andre insekter av samme størrelse. I tillegg kan det brukes for genetiske studier for å kvantifisere temperatur innstillinger og reaksjoner på mutanter eller vill-type fluer. Denne metoden kan hjelpe avdekke grunnlaget for termisk artsdannelse og tilpasning, samt nevrale mekanismene bak temperatur behandling.
Introduction
Temperaturen er en konstant miljømessige faktoren som påvirker hvordan organismer funksjon og oppføre seg1. Forskjeller i bredde og høyde lede til forskjeller i type klima organisme er utsatt for, som resulterer i evolusjonære utvalg for sine svar temperatur2,3. Organismer reagerer på forskjellige temperaturer gjennom morfologiske, fysiologiske og behavioral tilpasninger som maksimerer ytelsen under deres bestemt miljøer4. For eksempel i frukt fly Drosophila melanogasterhar bestander fra forskjellige regioner forskjellige temperatur innstillinger, kroppen størrelser, utviklingsmessige ganger, lang levetid, fruktbarhet og gangavstand ytelse ved forskjellige temperaturer2 ,5,6,7. Mangfoldet observert mellom flyr av ulike opphav forklares i del av genetisk variasjon og plast gene expression8,9. Tilsvarende Drosophila arter fra ulike områder distribuere annerledes blant temperatur graderinger og Vis forskjeller i motstand mot ekstrem varme og kalde tester10,11,12.
Drosophila har også nylig blitt modellen ønsker å forstå grunnlag genetiske og nevrale temperatur oppfatning13,14,15,16,17. Forstand, voksen fluer oppfatter temperatur gjennom kalde og varme eksterne temperatursensorer i antenner og temperatursensorer i hjernen13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. periferi receptors for varme temperaturer uttrykke Gr28b.d16 eller Pyrexia21, mens periferien kaldt reseptorer er preget av Brivido14. I hjernen behandles temperatur av neurons uttrykke TrpA115. Atferdsmessige studier av mutanter av disse er å forbedre vår forståelse av hvordan temperaturen behandles og gi innsikt i mekanismer som varierer blant populasjoner av Drosophila fra ulike regioner.
Her beskriver vi en temperatur-kontrollerte arena som gir rask og presis temperaturendringer. Etterforskerne kan forhåndsprogrammere disse endringene, som tillater for standardisert og repeterbare manipulasjoner uten menneskelig inngripen. Fluer registreres og spores med spesialisert programvare for å bestemme sin posisjon og hastigheten på ulike faser av et eksperiment. Det viktigste målet i denne protokollen er gangavstand hastigheten ved forskjellige temperaturer, fordi det er en økologisk relevante indeks fysiologiske ytelse som kan identifisere individuelle termisk tilpasningsevne5. Sammen med temperatur reseptor mutanter, kan denne teknikken hjelpe avslører mekanismer av termisk tilpasning på mobilnettet og biokjemiske nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Fly mat Medium
- Hell 1 L vann i en 2 liters glass kanne og legge en magnetic røre bar. Sette begeret på en magnetisk kokeplate ved 300 ° C til kokepunktet temperatur er nådd.
- Rør på 500 runder/min og legge følgende: 10 g av agar, 30 g av glukose, 15 g av sukrose, 15 g cornmeal, 10 g hvetespirer, 10 g av soyamel, 30 g sirup og 35 g av aktive tørr gjær.
- Når blandingen skum kraftig, skru ned kokeplate temperaturen til 120 ° C samtidig fortsette omrøring.
- Snu kokeplate temperaturen videre ned til 30 ° C etter 10 min og Fortsett omrøring til blandingen kjøler til 48 ° C. Måle temperaturen ved å sette inn et termometer direkte i maten uten å berøre veggene av begeret.
- Oppløses 2 g p-hydroxy-benzoic acid metyl ester i 10 mL av 96% etanol og legger den til mix, sammen med 5 mL 1 M propionsyre syre. Fortsett omrøring for 3 min.
- Deaktivere kokeplate og hell 45 mL av mat i oppdrett flasker og 6.5 mL av mat inn i samling hetteglass.
2. forberedelse av fluer
- Sted 20 mannlige og 20 kvinnelige flyr i oppdrett flaskene inneholder 45 mL av fly mat medium. Overføre fluene til nye flasker etter 3-4 dager ved å trykke dem ned og deretter tappe dem i frisk flaskene. Kaste fluene etter tre endringer.
- Plass flasker i inkubator under 12-h lys/12-h mørke sykluser med en konstant temperatur på 25 ° C.
Merk: En ny generasjon av fluer vil dra etter 10 dager.
- Plass flasker i inkubator under 12-h lys/12-h mørke sykluser med en konstant temperatur på 25 ° C.
- Bedøve nylig eclosed fluer på karbondioksid pads for maksimalt 4 min og samle dem i 2.5 x 9,5 cm fly oppdrett ampuller med 6,5 mL fly mat mediet bruker en pensel.
- Samle eneste virgin fluer og skille dem med sex i grupper på 20 fluer per oppdrett hetteglass.
- Plass hetteglass inne inkubatorer for 5-7 dager, endre fluene til nye flasker hver 2-3 dager og dager før eksperimenter.
3. ramme av lys
- Gjøre en treramme 10 cm lengde, 4 cm bredde, 4 cm høyde og 0,5 cm tykk.
- På hver av de korte kantene, lage en pyntebord av 4 cm lengde, 4 cm høyde og 1,5 cm bredde mot innsiden området treramme. La interne ansiktet grensen åpen.
- Bore to hull med 0,5 cm diameter i skjæringspunktet mellom en av langsider av treramme og på hver av kantlinjene på de korte kantene.
- Sted 10 cm av en varm hvit LED stripe inne hver av kantene på de korte kantene. Skrell baksiden av LED-List å umiddelbart lim den på plass.
Merk: For eksperimenter i som belysning må elimineres, varm hvit LED stripen kan erstattes for infrarød LED strimler. - Koble en ende av LED-List i en av kantlinjene til bytte strømforsyningen og den andre enden til LED stripen på motsatt grensen.
- Aktivere bytte strømforsyningen bekrefte at begge LED strimler aktiverer.
- Dekk den åpne siden av hver enkelt kantlinje med et hvitt papirark.
- Fest et annet stykke papir til hver av de interne fasene av langsider.
4. temperatur-kontrollerte Arena
- Slå på temperatur-kontrollerte arena (figur 1A og 1 C). Kontroller at viften starter og aluminium ringen starter oppvarming.
- Bruke en USB-kabel til å koble temperatur-kontrollerte arena kontroll datamaskinen som kjører skriptet TemperaturePhases med temperatur sekvensene.
- Åpne TemperaturePhases skriptet i kontroll datamaskinen og kontroller at temperaturen sekvensen er riktig satt opp (Video 1).
- Kontroller at varigheten av hver eksperimentelle fasen er satt til 60 s ved å kontrollere at "par. StimulusDur"er lik for 60 s.
- Kontroller at 1) nummeret til ønsket antall faser, 2) iterativ/på oppsett av indikativ rødt lys emitting diodene (lys), 3) 2 ° C temperaturøkning per fase, og 4) 16 ° C som starter temperaturen er alt riktig under "Start den eksperimentelle blokk"-delen.
Merk: Tillat fluene å acclimate til Fly Arena i 7 min på 16 ° C å unngå en kunstig økning av hastighet fra første eksperimentelle faser (figur 2). - Kjøre skriptet TemperaturePhases . Programvaren vil starte i 5 sekunder som bestemmes i "arena. Vent"og deretter stopper.
- Trykk på mellomromstasten på tastaturet kjøres eksperimentelle faser når et fly har blitt blåst inn i Fly Arena (trinn 5.3).
Merk: TemperaturePhases er gjeldende skriptet kontrollere boksen. Det er imidlertid mulig å opprette andre egendefinerte skript for å bruke denne som justerer kravene til forskjellige eksperimenter.
- Koble kameraet på arenaen opptak datamaskinen ved hjelp av kameraets USB-kabel.
- Åpne programmet videoopptak (se Tabell for materiale) i innspillingen datamaskinen ved å velge "fil | Nye filmopptak". En skjerm som viser bildet fra kameraet åpnes.
- Kontroller at kamerabildet fanger alle kanter på arenaen indikativ røde lysdioder.
- Starte innspillingen ved å trykke på den røde knappen i skjermens nedre kant viser kamerabildet når rammen av lys er satt rundt på arena (trinn 5.4).
Merk: små endringer i belysning kan påvirke nøyaktigheten av sporingskoden. Det anbefales å holde belysning av temperatur-kontrollerte arena konstant ved å feste plasseringen av apparatet.
5. temperaturen atferdsmessige eksperimenter
- Forberede Fly Arena (figur 1 c).
- Plass en strand av hvite ledende tapen på kobber brikkene, sikre alle kanter er dekket.
- Plasser oppvarmede aluminium ring rundt kobber flisene. Kanten av ringen passer perfekt rundt kobber flisene så det er alltid plassert på samme sted.
- Rengjør glasset dekke med et rent papir og plasser den på aluminium ringen, forlater et gap der et fly kan bli blåst i.
Merk: Før eksperimentene, pels glass dekselet med siliconizing agent å lage en glatt overflate. Bruk siliconizing agent for 24t og skyll den med vann før bruk.
- Kjøre skriptet TemperaturePhases (trinn 4.3.3) og åpne programmet videoopptak (trinn 4.5).
- Blåse fly fra oppdrett ampuller (trinn 2.2.2) inn i Arena Fly (f.eks., 1 mannlige fly i Figur 3).
- Ta ampuller med fluer settefiskanlegg, trykker den to ganger for å tvinge dem til å gå til bunnen, kan du overtrykke et fly med en munn aspirator, og Lukk ampullen og sette den tilbake i inkubator.
- Plass fly i arena gjennom gapet som har stått mellom glass cover og aluminium ring (trinn 5.1.3).
- Lukke gapet mellom glasset dekselet og aluminium ring ved å skyve glass dekselet til den når kanten av aluminium ringen så snart fly er introdusert til Fly Arena.
- Plass rammen av lys rundt på arena å sikre symmetrisk belysning.
- Merk plasseringen (f.eks., med et permanent markør) av rammen av lys rundt på Fly Arena (figur 1 c) slik at rammen er alltid plassert på samme sted.
- Starte innspillingen med programmet videoopptak (trinn 4.5.2) og trykk mellomromstasten på tastaturet til kontroll datamaskinen kjøres eksperimentelle faser (trinn 4.3.4).
- Etter at alle eksperimentelle faser er ferdig, lagrer video i MP4 eller AVI format og fjerne fly fra Fly Arena med munnen aspirator.
Merk: Slutten av eksperimentelle fasene kan bestemmes ved begge indikativ røde lysdioder er deaktivert eller TemperaturePhases skriptet stopper.- Stopp videoen innspillingen ved å trykke på stop-knappen i skjermens nedre kant i innspillingen programmet. Trykk "fil | Lagre som"lagre videoen.
6. video sporing og dataanalyse
- Bruk FlySteps sporing (Video 2) for å spore videoer.
- Åpne "configuration_file.ini" i mappen "FlyTracker".
- Angi plasseringen av video i "video_folder" og navnene på video i "video_files".
- Angi grenser Fly Arena i "arena_settings" basert på (x, y) pikselkoordinater flere steder i utkanten av arenaen.
- Angi plasseringen av indikativ røde lysdioder i "led_settings" basert på (x, y) pikselkoordinater hvor midten av lysdioder.
- Kontroller plasseringen av grenser Fly Arena ved å sette "debug" til "true" i "arena_settings", velge "Lagre" og kjører skriptet i terminalen. Et skjermbilde av videoen vises med et blått kvadrat dannet av koordinatene angitt i "arena_settings".
Merk: Denne plassen omgir området skal spores. - Endre "debug" i "arena_settings" til "false", klikk "Lagre" og kjører skjermen i terminalen igjen.
Merk: Dette starter det oppsporer forarbeide.
Merk: Fluer kan gå ut av sporing området til oppvarmet aluminium ringen. Dette skjer under de første sekundene av et eksperiment, som fluer stoppe berøre oppvarmet ringen og forbli sporing området.
Merk: Videoer kan spores med annen sporingsprogramvare eksperimentators ønsker.
- Bruk (x, y) plassering av hvert fly fra sporing til å beregne mål av interesse for temperatur ytelse. Egendefinerte skript (f.eks., FlyStepsAnalysis i utfyllende) kan brukes.
- Sammenligne temperatur ytelse kurver av ulike fly med gjentatte målinger (RM) analyse av varians (ANOVA) og post-hoc flere sammenligninger med statistisk programvare (se Tabell for materiale).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temperatur-kontrollerte arena (figur 1A) består av tre kobber brikker som temperaturen kan kontrolleres individuelt og en programmerbar krets. Hver kobber flis besitter en temperatursensor som gir tilbakemelding programmerbare krets. Kretsen aktiverer en strømforsyning for å øke temperaturen på hver brikke. Passiv termoelektrisk elementer fungere som konstant varmeelementene å opprettholde ønsket temperatur, mens en kjøleribbe avkjølt av en vifte gir konstant kjøling. Omfanget av temperatur endring bestemmer hastigheten på prosessen på en ikke-lineær måte. En økning på 2 ° C krever bare 0,1 s, og en økning på 18 ° C krever 4 s. En skjerm som er koblet til den programmerbare kretsen (figur 1 c) informerer brukeren om temperaturen målt av temperatursensorer i hver av flisene. Kobber flisene er omgitt av en aluminium ring stadig oppvarmet til 50 ° C (figur 1B og 1 C) av halvledere rundt periferien. Denne ringen danner kantene på Fly Arena (figur 1 c), området der flyr skal plasseres. Fly Arena er dekket av en silikoniserte glass cover (figur 1A og 1 C), som gir 3 mm høy plass som sikrer at fluer kan gå, men ikke fly. Ved siden av Fly Arena er to røde lysdioder (figur 1 c) som kan programmeres til å merke ulike eksperimentelle faser. For eksempel for resultatene som vises i figur 2A, hver LED er forbundet med en annen temperatur, mens i figur 2B, hver LED angir 60 s. FlySteps programvaren kan registrere når hver av indikativ lysene er på, og forskeren kan deretter bruke denne informasjonen automatisk finne eksperimentelle fasene basert på temperatur eller tid.
Temperatur-kontrollerte arena kan brukes til å sammenligne de atferdsmessige respons av fluer med forskjellig genetisk bakgrunn for dynamisk temperaturendringer. For eksempel kan flyr fra ulike arter bli utsatt for gradvis økende temperaturer (Figur 3) å sammenligne forskjeller i termisk ytelse. Hastigheten på alle arter øker når temperaturen øker fram et poeng av maksimal ytelse, etter som det forfalt og omkom. Hver art har imidlertid en bestemt respons kurve med bestemte maksimal respons hastighet og termisk toleranser. Tidligere rapporter har vist at Drosophila fra ulike arter varierer utviklingsmessige timing, lang levetid, fruktbarhet, organet dimensjoner, seksuell kommunikasjon og temperatur toleranse3,6,7 ,8,22. Dermed legger vår beskrivelse av artsspesifikke bevegelse i en temperaturgradient til denne kroppen arbeid.
Temperatur-kontrollerte arena kan også brukes til å utforske svaret condition eksperimenter basert på temperaturen. Den enkleste formen for denne tilnærmingen er en kan opereres forfatning paradigme som fluer er utdannet å foretrekke ene arenaen over den andre, ved oppvarming opp på siden som skal unngås23,24,25. Vi utsatt personlige flyr til 40 ° C i midten og en av side brikkene, mens den andre side-brikken på en komfortabel 22 ° C (Figur 4). Vill-type flyr raskt sluttet å flytte langs arena og forble i komfortable plasseringen. I kontrast, klassisk minne mutant Dunce holdt Utforsker arena og tilbrakte mindre tid enn kontrollene på behagelig sted. Forskjellene mellom av vill-type fluene og Dunce mutanter ble større da alle brikkene ble satt til 22 ° C og sammenligninger ble gjort mellom behandling. Dunce mutanter viste også større forskjeller mellom trening og testfasen sammenlignet med vill-type fluene (Figur 4). Disse resultatene tyder på en effekt av hukommelse på igjen i komfortable plasseringen.
Kombinasjonene av temperatur og beliggenhet er også nyttig for å forstå funksjonen av annen temperatur reseptorer under dynamisk temperaturendringer. Vi utsatt personlige D. melanogaster Gr28b.d og TrpA1GAL4 mutanter økende temperaturer (2 ° C øke hvert 60 s) samtidig som det gir en komfortabel beliggenhet på 22 ° C (figur 5). Hvor komfortabel forskjøvet fra venstre til høyre, og omvendt, per gjennomkøyring. Resultatene viser at periferi temperatur reseptoren Gr28b.d mutanter oppfører seg som kontrollen, de bruker mer tid på behagelig sted som temperaturen øker. Men hjernen temperatur reseptoren TrpA1GAL4 mutanter påvirkes ikke av økende temperaturer og endre ikke plasseringene i arenaen. Økning og nedgang i kurven TrpA1GAL4 mutanter viser effekten i fluer som allerede sitter på behagelig sted før det ble komfortable og forble det i den fasen. Konsistensen av topper og daler av kurven av TrpA1GAL4 foreslår at disse fluene forble fortsatt for det meste av eksperimentet. Derfor var de stadig telles når deres plassering var regnet komfortabel. Denne konklusjonen ble bekreftet av visuell inspeksjon av innspilte videoer. Disse resultatene støtte tidligere fysiologiske rapporter tyder på at periferi oppfatning av rask og store endringer ikke avhenger Gr28b.d17 og at fluene har en viktigste sentrale mekanismen fornuftig temperatur basert på TrpA1 14,21.
Figur 1: Diagram av temperatur kontrollert-arena. (A) en lateral visning av temperatur-kontrollerte arena. En programmerbar krets kobler en makt levere og temperatur sensorer til varmeelementer under kobber fliser å kontrollere temperaturen. Fliser er stadig avkjølt gjennom en kjøleribbe som er koblet til en fan. En oppvarmet aluminium ring som et glass cover hviler omgir flisene. (B) thermal imaging viser flisene satt til 24 ° C (øverst) og siden fliser på 24 ° C med en middels brikke på 30 ° C (nederst). (C) en ovenfra arenaen. Et kamera kobber fliser, aluminium ring, og røde lysdioder, så fastslår automatisk eksperimentelle faser. Et hjørne av boksen ikke registrert av kameraet, skjermbilde flis temperaturer. (D) lysringen: to varm hvit LED strimler i en trekasse dekket i hvitt papir sikre konstant og symmetrisk belysning av hele arena. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fluer må acclimate til arena før temperaturen protokollen. (A) enkelt mannlige fluer ble introdusert til arena og lov til å utforske i en konstant 16 ° C for 1 min, etter som temperaturen begynte å øke. (B) én fluer utsatt for 16 ° C, 20 ° C eller 24 ° C (ingen gruppe forskjeller; toveis VARIANSANALYSE F (2,570) = 4.156, p = 0.162) har en høyere bevegelse i begynnelsen av eksperimentet enn etter 5 min (toveis RM ANOVA F (9,570) = 7.803, p < 0,0001). Dataene er mener og standard feil av gjsnitt (± SEM) 20 jomfru kvinnelige fluer 5 til 7 dager gamle testet over flere dager. Stjerne angir betydelig forskjell blant grupper (*** p < 0,0001; Tukey er flere sammenligningen test, p = 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bevegelse av 5 Drosophila arter utsatt for gradvis økende temperaturer. Individuelle mann flyr fra tempererte (blå), tropisk (rød), og kosmopolitisk (brun) Drosophila arter ble utsatt for en økende temperaturgradient (2 ° C hver 60 s) mellom 16 og 46 ° C. De første 7 min var stadig på 22 ° C tillate fluer å utforske arena. Arter var signifikant forskjellig (toveis RM ANOVA F(4,70) = 28.46, p < 0,001). (a) D. melanogaster (brun; fylt sirkler) var raskere når introdusert til arena. (b) D. yakuba (rød; tomme firkanter) var raskere som temperaturen økt. (c) D. suzukii (brun, fylt firkantet) var tregere enn andre kosmopolitiske fluene på punktet for maksimal ytelse. (d) D. simulans (brun, tomme sirkler) var i forfall på det høyeste punktet på D. melanogaster. Hvert punkt representerer gjennomsnittet (± SEM) 15 mannlige fluer 5 til 7 dager gamle testet over flere dager. Betydning angitt av symboler (♦ = forskjell fra alle, p < 0,0001; † = forskjell fra alle unntatt D. melanogaster, p < 0,0001; • = forskjell fra D. melanogaster, p < 0.01; ¢ = forskjell fra D. melanogaster, p < 0,001; = forskjell mellom navngitte grupper, p < 0,0001; Tukey er flere sammenligningen test, p = 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: temperatur-kontrollerte arena kan brukes for kan opereres forfatning. D. melanogaster Canton-S belastning (vill-type, svart kantlinje) og dnc1 (Dunce, rød kantlinje) mutanter ble trent å foretrekke en lateral brikke på 22 ° C etter oppvarming midten og lateral fliser til 40 ° C i 4 min (trening, ikke mønster). Minnet om de oppvarmede områdene er testet ved å sette alle brikkene til 22 ° C (test, rutenettmønster). Fluer var betinget foretrekker fliser til venstre i halvparten av eksperimenter og fliser til høyre i andre halvår. Andelen totaltiden i ruten på 22 ° C treningen og testing ble målt for å sammenligne forestillinger. Grupper var signifikant forskjellig (enveis ANOVA F(3,76) = 23.23, p < 0,0001), med Dunce utføre verre enn vill-type generelt. Dataene er mean (± SEM) 20 jomfru kvinnelige fluer 5 til 7 dager gamle testet over flere dager. Stjernene angir betydning forskjellen blant grupper (*** p > 0,0001; *** p > 0,001; ** p > 0.01; Tukey er flere sammenligningen test, p = 0,05) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: svar temperatur mutanter økende temperatur når en beliggenhet finnes. Temperatur mutanter Gr28b.d (grønn; firkanter) reagerer som kontroller (w1118, svart, sirkler) ved å øke prosentandelen av tid i komfortable området som temperaturen øker (toveis RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0.479). TrpA1GAL4 mutanter (gul, trekanter) er forskjellig fra kontroller (w1118, svart), de ikke øke tiden i komfortable området som temperaturen øker (toveis RM ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0.019). Dataene er mean (± SEM) 20 mannlige fluer 5 til 7 dager gamle testet over flere dager. TrpA1GAL4 er signifikant forskjellig fra Gr28b.d og kontroll (p < 0,05; Tukey er flere sammenligningen test, p = 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi presentert en automatisert temperatur-kontrollerte arena (figur 1) som produserer nøyaktig temperaturendringer i tid og rom. Denne metoden kan eksponering av personlige Drosophila ikke bare til forhåndsprogrammert gradvis øker temperatur (figur 2 og Figur 3), men også dynamisk temperatur utfordringer som hvert panel fly arenaen ble oppvarmet uavhengig til en annen temperatur (Figur 4 og figur 5).
Temperatur-kontrollerte arena bruker en innovativ tilnærming til varme-prosessen. I stedet for å produsere temperaturendringer i flisene gjennom termoelektrisk Peltier varmeelementene brukes i tradisjonelle metoder, temperatur-kontrollerte arena bruker gjeldende for å varme opp en kobber masse med kobber flisene og fluene er plassert øverst. Kobber massen er stadig avkjølt av en kjøleribbe koblet til en fan. Peltier-liknende elementer brukes til å opprettholde ønsket temperatur masse kobber når det har blitt varmet opp. Fordi disse elementene ikke er de viktigste temperatur generatorene, lide mindre stress, som utvider sin levetid og tillater raskere temperaturendringer. En programmerbar krets som får tilbakemelding fra temperatursensorer under hver av kobber ruten, som kan også aktivere lav spenning strømforsyning, koordinerer oppvarming mekanismen. Forskere kan angi når og hvor temperaturendringer oppstå og bestemme intensiteten og retning av slike endringer. Videre tillater kopling metoden med spesialiserte sporing, som FlySteps, analyse av alle forhold rundt Drosophilas bevegelsen som den generelle hastigheten på visse temperatur eller tid i visse steder ( Figur 2, Figur 3, Figur 4, figur 5). Likevel må alle resultatene vurdere egenskaper iboende å fly som kan påvirke deres bevegelse. For eksempel hvis fluer ikke er tillatt å utforske arenaen og betale før du endrer temperaturen, hastigheten målingene kan være kunstig høye (figur 2). Fluer kan også la odorants som påvirker påfølgende fluer; Derfor glass dekselet må rengjøres og tape dekker brikkene må skiftes mellom fag. Gitt at bevegelse avslår som flyr alder26, er det viktig at fluer er standardisert for å unngå variasjon i resultatene. I vår arena, har fluer også vist centrophobism, foretrakk kantene over det midtre området. Forskere må kontrollere dette ved å endre plasseringen av komfortable områder for å hindre overestimating området preferanse.
De gjeldende egenskapene til arenaen og kravene til det oppsporer forarbeide kan begrense noen eksperimentelle prosedyrer. For eksempel inkluderer nær miljøet arenaen ikke tilgangspunkter som lukt kan bli introdusert, som hindrer studier der denne stimulans er viktig. Tilsvarende nødvendiggjør FlyStepts tracker videoer med ensartet bakgrunn, som begrenser muligheten for å legge til mat eller andre elementer fly's miljø. Arenaen kan tilpasses til å inkludere en kobling til en gassventilen og programvare utviklingen finnes som tillate flere objekter finnes. Fremtidige prosjekter kan utnytte disse mulighetene å tilpasse temperatur-kontrollerte arena eksperimentelle behov.
Endelig har vi vist i resultatene som ulike arter av Drosophila utføre annerledes som temperaturen øker (Figur 3), og at temperaturen mutanter reagerer ikke på samme måte som kontroller (figur 5). Dette viser at denne nye metoden kan brukes til å utforske Drosophilas termisk oppførsel og hvordan den påvirkes av naturlig utvalg og funksjonelle egenskaper. Til slutt, det illustrerer at vår metode kan hjelpe videre forståelse av termisk tilpasning og artsdannelse samt temperatur reseptorer samhandling med andre stimuli i fremtiden studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av et stipend fra Behavioural og kognitiv nevrovitenskap Program av universitetet i Groningen og graduate stipend fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) fra Mexico, gitt til Andrea Soto-Padilla og et stipend fra John Templeton grunnlaget for studiet av tiden tildelt Hedderik van Rijn og Jean-Christophe Billeter. Vi er også takknemlige til Peter Gerrit Bosma for sin deltakelse i utvikle FlySteps tracker.
Skriptene TemperaturePhases, FlySteps, og FlyStepAnalysis kan bli funnet som tilleggsinformasjon og i følgende midlertidige og offentlig tilgjengelig kobling:
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I.
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
