Summary
Burada zaman ve mekan içinde hızlı ve hassas sıcaklık değişiklikleri üretir programlanabilir bir ısı kontrollü arena kullanarak sıcaklık değiştirme Drosophila lokomotor performansını otomatik olarak belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Ne tür dağıtmak ve hareket etkiler her yerde bulunan bir çevre faktörü sıcaklığıdır. Drosophila meyve sinekleri farklı türler belirli yanıt-e doğru sıcaklık fizyolojik tolerans ve adaptasyon göre değiştirme hakkına sahiptir. Drosophila sinekler de sinir ectotherms içinde işleme sıcaklık temelini anlamak için temel haline gelmiştir sistem algılama bir sıcaklık sahip. Burada sıcaklık değişen bireysel sinekler yanıt keşfetmek için zamansal ve mekansal kontrolü ile hızlı ve hassas sıcaklık değişikliklerine izin ısı kontrollü bir arena mevcut. Bireysel sinekler arenada yer ve Tekdüzen kademeli sıcaklık tepki normları belirlemek için veya dağınık şekilde dağıtılmış sıcaklıklar artar tercihlerinizi belirlemek için aynı anda gibi hazır çekim sıcaklık sorunlar için maruz. Bireyler hız veya Konum tercihi miktar izin otomatik olarak izlenir. Bu yöntem hızlı bir şekilde yanıt geniş sıcaklık sıcaklık performans eğrileri Drosophila içinde belirlemek için veya diğer böcekler benzer boyutta üzerinden ölçmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu genetik çalışmalar için sıcaklık tercihleri ve mutantlar veya vahşi-türü sinekler tepkiler ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem termal türleşme ve adaptasyon gibi sinirsel mekanizmalar arkasında sıcaklık işleme temeli ortaya çıkarmak yardımcı olabilir.
Introduction
Nasıl organizmalar işlev ve1davranır etkiler sürekli bir çevre faktörü sıcaklığıdır. Enlem ve yükseklik farklılıkları türü organizma için onların yanıtları sıcaklık2,3için evrimsel seçimi hangi sonuçlar maruz kalan iklim farklılıkları yol. Organizmaların farklı sıcaklıklarda onların belirli ortamlarda4altında performansı en üst düzeye çıkarmak morfolojik, fizyolojik ve davranışsal uyarlamalar ile yanıt. Örneğin, meyve sineği Drosophila melanogaster, örneğin alınma olasılığını farklı bölgelerde farklı sıcaklık tercihleri, gövde boyutları, gelişimsel süreleri, uzun ömürlü, verimlilik ve yürüyüş performans farklı sıcaklıklarda2 var ,5,6,7. Farklı kökenleri sinekler arasında gözlenen çeşitlilik kısmen genetik varyasyon ve plastik gen ifade8,9tarafından açıklanmıştır. Benzer şekilde, Drosophila türler farklı alanlardan farklı sıcaklık degradeler arasında dağıtmak ve aşırı sıcak ve soğuk testleri10,11,12için direnç farklılıklar gösterir.
Drosophila de son zamanlarda sıcaklık algı13,14,15,16,17genetik ve nöral temeli anlamak için seçim modeli haline geldi. Genel olarak, Yetişkin sinekler anten soğuk ve sıcak periferik sıcaklık sensörleri ve sıcaklık sensörleri beyin13,14,15,16 üzerinden sıcaklık algıladıkları , 17 , 18 , 19 , 20. Gr28b.d16 ya da yüksek ateş21çevre reseptörleri sıcak hava için hızlı, çevre soğuk reseptörleri Brivido14tarafından karakterize edilmektedir. Beyinde, sıcaklık TrpA115ifade nöronlar tarafından işlenir. Mutantlar bu yollar üzerinde davranış çalışmaları sıcaklık nasıl işleneceğini bizim anlayış geliştirmek ve Drosophila farklı bölgelerdeki nüfus arasında değişir mekanizmaları içine anlayışlar verebilir.
Burada hızlı ve hassas sıcaklık değişiklikleri üreten ısı kontrollü bir arena açıklayın. Müfettişler bu değişiklikler için standart ve tekrarlanabilir sıcaklık manipülasyonlar insan müdahalesi olmadan sağlayan önceden programlayabilirsiniz. Sinekler kaydedilir ve onların konumu da bir deney farklı aşamalarında belirlemek için özel yazılımı ile izleniyor. Bu protokol için sunulan ana ölçüm yürüme hızı farklı sıcaklıklarda, bireysel termal adaptasyon5tanımlayabilirsiniz fizyolojik performans ekolojik ilgili dizin olduğu içindir. Sıcaklık reseptör mutantlar ile birlikte, bu teknik, hücresel ve biyokimyasal düzeyde termal adaptasyon mekanizmaları ortaya çıkarmak yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sinek gıda orta hazırlanması
- Musluk suyu 1 litre 2 L cam kabı dökün ve bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Kaynama sıcaklığı ulaşılana kadar kabı 300 ° c manyetik sıcak bir tabak koymak.
- Aşağıdakileri ekleyin ve karıştırın 500 mermi/dak: agar 10 g, 30 g glikoz, 15 g sükroz, 15 gr mısır unu, buğday tohumu 10 g, soya unu, 10 g, pekmez 30 g ve 35 g aktif Kuru Maya.
- Mix şiddetle köpükler, sıcak plaka sıcaklığı 120 ° c aşağı karıştırmaya devam ederken açmak.
- 10 dakika sonra daha da aşağı 30 ° C sıcak plaka sıcaklığına çevirmek ve mix soğur 48 ° C'ye kadar karıştırmaya devam Sıcaklık kabı duvarları dokunmadan bir termometre doğrudan gıda ekleyerek ölçmek.
- P-hidroksi-benzoic asit metil ester 2 g 10 mL % 96 etanol dağıtılması ve 5 mL 1 M propiyonik asit de birlikte karışıma ekleyin. 3 dk karıştırmaya devam.
- Sıcak plaka devre dışı bırakmak ve yetiştirme şişeleri ve 6.5 mL Koleksiyonu şişeleri maması içine yiyecek 45 mL dökün.
2. sinekler hazırlanması
- Yer 20 erkek ve 20 erkek sinek gıda orta 45 mL içeren yetiştirme şişelerde uçar. Sinekler yeni şişeler için onları aşağı dokunarak ve sonra onları taze şişe dokunarak tarafından 3-4 gün sonra transfer. Sinekler sonra üç değişiklikleri atmak.
- 25 ° c sabit sıcaklık ile 12 saat ışık/12-h karanlık devir altında kuluçka içinde şişe yerleştirin
Not: Sinekler yeni nesil eclose 10 gün sonra olacak.
- 25 ° c sabit sıcaklık ile 12 saat ışık/12-h karanlık devir altında kuluçka içinde şişe yerleştirin
- Yeni karbon dioksit yastıkları en fazla 4 dk eclosed sinek anestezi ve onları 2.5 x 9,5 cm sinek yetiştirme şişeleri bir fırça kullanarak sinek gıda orta 6.5 mL ile toplamak.
- Tek bakire sinekler toplamak veya seks tarafından şişe yetiştirme başına 20 Sineklerin Tanrısı gruplara ayırabilirsiniz.
- Şişeleri İnkübatörler içinde 5-7 gün, yeni tüpleri her 2-3 gün ve gün öncesine deneyler üzerinde sinekler yarayan için koyun.
3. çerçeve ışık
- 10 cm uzunluğunda, 4 cm genişlik, 4 cm yükseklik ve 0,5 cm kalınlığında ahşap bir çerçeve yapmak.
- Her kısa kenarlarının, 4 cm uzunluğunda, 4 cm yükseklik ve iç doğru 1,5 cm Genişlik bir kenarlık oluşturmak ahşap çerçeve alanı. İç yüzünü sınır açık bırakın.
- İki delik 0.5 cm çapında bir ahşap çerçeve uzun kenarlarının kesişim ve her kısa kenarları sınırlarında.
- Sıcak beyaz LED şerit içinde her biri kısa kenarları sınırlarında yer 10 cm. Hemen yere yapıştırmak için LED şerit arkası kabuğu.
Not: Hangi aydınlatma ihtiyaçlarını bertaraf edilmesi için sıcak beyaz LED şerit için kızılötesi LED yedek olabilir deneyler için şeritler. - Anahtarlama güç kaynağı ve LED şerit ters sınır onun diğer ucunu kenarlarından birini içinde LED şerit bir ucunu bağlayın.
- Her iki LED şeritler açmanızı doğrulamak için anahtarlama güç kaynağı açın.
- Beyaz bir kağıt parçası ile her sınır açık yan kapağı.
- Her biri uzun kenarları iç aşamaları için başka bir parça tutkal.
4. ısı kontrollü Arena
- Isı kontrollü arena (Şekil 1A ve 1 C) açın. Fan çalışmaya başlar ve alüminyum halka ısınmaya başlar emin olun.
- Isı kontrollü arena sıcaklık sıralarıyla TemperaturePhases komut dosyası çalıştıran denetim bilgisayara bağlanmak için USB kablo kullanın.
- TemperaturePhases komut dosyası kontrol bilgisayarı açın ve sıcaklık sıra (Video 1) düzgün ayarlandığından emin olun.
- Deneysel her aşama süresi 60'a ayarlanır onay "par. doğrulayarak s StimulusDur"60'a eşit s.
- Sayı 1) eşit aşamaları, 2) yinelemeli ON/OFF gösterge kırmızı ışık yayan diyotlar (LED'ler), 3) 2 ° C sıcaklık artışı faz, başına up sayısı istenen ve başlangıç sıcaklığı 4) 16 ° C "Başlat altında olan deneysel hepsi doğru kontrol blok"bölümü.
Not: uçar Fly yapay artış hızı ilk deneysel aşamaları (Şekil 2) sırasında önlemek için arenaya 7 dk. 16 ° c için alışmana izin. - TemperaturePhases komut dosyasını çalıştırın. Yazılım 5 "arenada. belirlenen saniye başlatılır Bekleyin"ve sonra dur.
- Bir sinek sinek arenaya (adım 5.3) şişmiş bir kez deneysel aşamada yayınlamaya başlamak için klavyenin boşluk tuşuna basın.
Not: TemperaturePhases kutuyu kontrol geçerli komut dosyasıdır; Ancak, farklı deneyler gereksinimleri için ayarlamak bu aygıtı kullanmak için diğer özel komut dosyaları oluşturma olanağı vardır.
- Kameranın üst kısmında arena kameranın USB kablosunu kullanarak kayıt bilgisayara bağlayın.
- Video kayıt programı açın (bkz. Tablo reçetesi) seçerek kayıt bilgisayardaki "dosya | Yeni film yazmak". Kameranın görüntü gösteren bir ekran açılır.
- Kamera görüntüsü arena ve gösterge kırmızı LED bütün kenarları yakalar emin olun.
- Ekranın alt kenarı ışıklar çerçevesinde arena (adım 5,4) etrafında ayarlandıktan sonra kamera görüntü gösterilen ortasında kırmızı düğmeye basarak kaydı başlatın.
Not: küçük değişiklikler aydınlatmada izleme doğruluğunu etkileyebilir. Bu ısı kontrollü arena aydınlatma cihazları konumunu düzelterek sabit tutmak için tavsiye edilir.
5. sıcaklık Davranışsal deney
- Uçmak Arena (Şekil 1 c) hazırlayın.
- Tüm kenarları kaplıdır sağlanması bakır fayans üstüne beyaz iletken teyp bir iplikçik yerleştirin.
- Yer bakır fayans çevresindeki ısıtmalı alüminyum halka. Her zaman aynı konumda yer alıyor böylece yüzük kenarına bakır fayans tam uydu.
- Cam kapak temiz bir mendil ile temiz ve hangi aracılığıyla bir sinek şişmiş içinde bir boşluk bırakarak Alüminyum Masa üstüne yerleştirin.
Not: daha önce deneyler, kaygan bir yüzey oluşturmak için siliconizing aracı ile cam kapak kat. Siliconizing temsilci 24 h için başvurun ve kullanmadan önce su ile durulayın.
- TemperaturePhases komut dosyası (adım 4.3.3) çalıştırın ve video kayıt programı (adım 4.5) açın.
- Anında bir yetiştirme flakon (adım 2.2.2) uçmak arenaya darbe (Örn., 1 erkek sinek Şekil 3' te).
- Kuluçka makinesi uçar bir şişe al, iki kez yukarıdan aşağıya doğru bir ağız aspiratör ile bir sinek yakalamak ve şişe kapatın ve kuluçka makinesi koy geri gitmek için zorlamak için dokunun.
- Cam kapak ve alüminyum ring (adım 5.1.3) arasında kalan Aralık ile arenada anında yerleştirin.
- Cam kapak ve alüminyum halka arasında sinek sinek arenaya tanıttı olarak alüminyum ring kenarına ulaşıncaya kadar cam kapak iterek kapatın.
- Simetrik aydınlatma sağlamak için bir yer ışıklar arena etrafında çerçeve.
- İşaretlemek (Örn., kalıcı bir kalem kullanarak) çerçeve ışık Fly çerçeve her zaman aynı konuma yerleştirilir emin olmak için Arena etrafında (Şekil 1 c).
- Video kayıt programı (adım 4.5.2) ile kayıt işlemini başlatmak ve deneysel aşamaları (adım 4.3.4) yayınlamaya başlamak için Denetim bilgisayar klavye üzerinde boşluk çubuğuna basın.
- Ne de olsa deneysel aşamaları .mp4 veya .avi formatında video kaydetmek yapılır ve ağız aspiratör ile uçmak Arena anında kaldırmak.
Not: Deneysel aşama sonuna TemperaturePhases komut dosyası durdurma veya her iki gösterge kırmızı LED devre dışı tarafından belirlenebilir.- Video kayıt programda ekranın alt kenarı ortasında Dur düğmesine basarak kaydı kes. Basın "dosya | Farklı Kaydet"video kaydetmek için.
6. video izleme ve veri analizi
- İzleme yazılımı (Video 2) FlySteps videoları izlemek için kullanın.
- "Configuration_file.ini" "FlyTracker" klasörünün içinde açın.
- "Video_folder" videoları konumunu ve belgili tanımlık video içinde "video_files" adını ayarlayın.
- "Arena_settings göre" Fly arenada sınırları belirtin (x, y) Arena kenarında birden çok nokta koordinatlarını piksel.
- Gösterge kırmızı LED "led_settings göre" olarak konumunu belirtin (x, y) LED'lerin merkezinin konumu koordinatlarını piksel.
- Uçmak Arena sınırları konumunu "debug" ayarlayarak "true" "arena_settings" "Kaydet"'i ve terminal komut dosyasını çalıştırma, iade edin. Ekran görüntüsü yakalama video "arena_settings" girilen koordinatlar oluşturduğu mavi kare ile gösterilir.
Not: Bu kare izlenmesi gereken alanı çevreleyinceye. - "Debug" "arena_settings" "false", "Kaydet" düğmesini tıklatın ve ekran terminalde bir kez daha çalıştırın.
Not: Bu izleme işlemi başlar.
Not: İzleme alanının üzerine ısıtılmış alüminyum halka dışında uçar yürüyerek ulaşabilirsiniz. Bu bir deney, hangi sonra sinek ısıtmalı yüzük dokunmayı kes ve izleme alanı içinde kalan ilk saniye sırasında olur.
Not: Deneyci'nın tercihlerine göre diğer izleme yazılımlarıyla videolar izlenebilir.
- Kullanım (x, y) faiz sıcaklık Performans ölçüsü hesaplamak için izleme yazılımı tarafından sağlanan her sinek konumunu. Özel komut dosyalarını (Örn., FlyStepsAnalysis ekolarak) kullanılabilir.
- Sıcaklık performans eğrileri tekrarlanan ölçüler (RM) varyans analizi (ANOVA) ve post-hoc istatistiksel yazılım kullanarak birden çok karşılaştırmaları kullanarak farklı sinek grupları karşılaştırın ( Tablo malzemelerigörmek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üç bakır taş olan sıcaklık ayrı ayrı programlanabilir bir devre kontrol edilebilir ısı kontrollü arena (Şekil 1A) oluşur. Her bakır döşeme için programlanabilir devre geribildirim veren bir sıcaklık sensörü sahiptir. Her döşeme sıcaklığını artırmak için bir güç kaynağı devre etkinleştirir. Pasif termoelektrik elemanları tarafından bir fan soğutmalı bir soğutucu sürekli soğutma sağlarken istenilen sıcaklık sürdürmek için sürekli ısıtma elemanları hareket. Ortam sıcaklığı işlemin hızını doğrusal olmayan bir şekilde belirleyen. 2 ° C lik bir artış sadece gerektirir 0.1 s ve 18 ° C lik bir artış gerektirir 4 s. Programlanabilir devre (Şekil 1 c) bağlı bir ekran sıcaklık sensörleri her çini tarafından ölçülen sıcaklık kullanıcıya bildirir. Bakır fayans sürekli yarı iletkenler etrafında çevre tarafından 50 ° C (Şekil 1B ve 1 C) için ısıtmalı bir alüminyum yüzüğü çevrilidir. Bu yüzüğü uçmak Arena (Şekil 1 c), sinekler yerleştirilecek olan alan kenarları oluşturur. Uçmak Arena sinekler yürümek ama sinek sağlar 3 mm yüksek alanı sağlayan bir silikonlu cam kapak ile (Şekil 1A ve 1 C) kaplıdır. Uçmak Arena yanındaki farklı deneysel aşamalarında işaretlemek için programlanmış iki kırmızı LED (Şekil 1 c) vardır. Örneğin, Şekil 2Agösterilen sonuçlar için her LED ilişkilidir farklı bir sıcaklık ile Şekil 2Biken, her LED 60 gösterir s. FlySteps yazılım her gösterge LED üzerinde ve araştırmacı daha sonra otomatik olarak sıcaklık veya saate göre deneysel aşamada belirlemek için bu bilgileri kullanabilirsiniz sonra kaydedebilirsiniz.
Isı kontrollü arena davranışsal yanıt sinekler farklı genetik alanlardan dinamik sıcaklık değişiklikleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, farklı türlerden sinekler için yavaş yavaş artan sıcaklıklar (termal performans farklılıkları karşılaştırmak için,Şekil 3) gösterilebilir. Sonra o çürük ve helak maksimum performans, bir noktaya ulaşmak kadar sıcaklık arttıkça bütün türlerin hızını artırır. Ancak, her tür belirli maksimum tepki hızları ve termal toleransları ile belirli yanıt eğrisi vardır. Önceki raporlar göstermiştir Drosophila farklı türlerden farklı gelişim zamanlaması, uzun ömürlü, verimlilik, gövde boyutları, cinsel iletişim ve sıcaklık toleransı3,6,7 arasında ,8,22. Böylece, bir sıcaklık değişimi species-specific hareket bizim açıklaması Bu eser vücuda ekler.
Isı kontrollü arena yanıt-e doğru sıcaklığına göre deneyler Klima keşfetmek için de kullanılabilir. En basit bu yaklaşım içinde sinekler bir tarafı diğer-ecek var olmak diğer tarafa ısınma tarafından üzerinden arenanın23,24,25kaçınılması tercih için eğitilmiş bir edimsel Klima paradigma şeklidir. Biz 40 ° c orta ve yan çinilerin bir bireysel sinekler rahat bir 22 ° C (Şekil 4) diğer yan döşeme bırakarak maruz. Vahşi-türü sinekler hızla arena hareket etmiyor ve rahat konumda kaldı. Buna ek olarak, klasik bellek mutant mankafa arena keşfetmek devam etti ve rahat konum denetimlerde daha az zaman harcadı. Tüm taşlar 22 ° C'ye ayarlanmış ve tedavi grupları arasında karşılaştırmalar yapılmıştır vahşi-türü sinekler performansını ve aptal mutantlar arasındaki farklar daha büyük oldu. Aptal mutantlar da vahşi-türü sinekler (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında eğitim ve test aşamaları arasında büyük farklılıklar gösterdi. Bu sonuçlar rahat konumda kalan üzerinde bir etkisi bellek öneririz.
Sıcaklık ve konumu da dinamik sıcaklık değişiklikleri sırasında farklı sıcaklık reseptörleri işlevini anlamak yararlıdır. Sıcaklıklar artan bireysel D. melanogaster Gr28b.d ve TrpA1GAL4 mutantlar maruz (2 ° C artırmak her 60 s) 22 ° C (Şekil 5) rahat bir konumda sağlarken. Rahat konum soldan sağa ve tersi, yineleme başına kaydırılır. Sıcaklık arttıkça rahat konumda daha fazla zaman harcamak gibi çevre sıcaklığı reseptör Gr28b.d mutantlar denetimi gibi davranır sonuçları göster. Ancak, beyin sıcaklık reseptör TrpA1GAL4 mutantlar sıcaklıklar artırarak etkilenmez ve konumlarına arenada değiştirmeyin. Artar ve TrpA1GAL4 mutantlar eğrisi azalma etkisi o orada rahat ve kaldı bu evre sırasında olmadan önce bu zaten rahat konumda oturuyorduk sinekler gösterir. Tepeler tutarlılığını ve TrpA1GAL4 eğrisi vadileri öneririz Bu sinekler hala deneme çoğu için kaldı; Bu nedenle, onlar konumlarını rahat kabul bir oldu sürekli sayıldı. Bu sonuç kaydedilen video görsel denetim tarafından doğrulandı. Bu sonuçları destek önceki fizyolojik raporları hızlı ve büyük değişiklikler o çevre algısı düşündüren Gr28b.d17 tarihinde bağlı değildir ve sinekler anlamda sıcaklık TrpA1 dayalı bir ana merkez mekanizmasına sahip 14,21.
Şekil 1: diyagramı sıcaklık kontrollü-Arena. (A) ısı kontrollü arena yanal bir görüntü. Programlanabilir bir devre ısıtma elemanları bakır taşı onların sıcaklık kontrol altında bir güç kaynağı ve sıcaklık sensörleri bağlanır. Fayans sürekli bir soğutucu fan için bağlı aracılığıyla soğuduktan. Bir ısıtmalı alüminyum halka üzerinde cam kapak aittir çini çevreler. (B) termal 24 ° C (üst) ve yan fayans 24 ° c ile 30 ° c (alt) orta taş ayarlamak fayans gösterilen görüntüleme. (C) A üstten görünüm Arena. Bir fotoğraf makinesi bakır çini, alüminyum halka ve kırmızı LED kaydeder, sonra deneysel aşamada otomatik olarak belirler. Bir ekran kamera tarafından kaydedilen değil kutunun köşesindeki şu kiremit sıcaklık görüntüler. (D) ışık halkası: iki sıcak beyaz LED şeritler beyaz kağıt kaplı ahşap kutu içinde tüm Arena sürekli ve simetrik aydınlatma sağlamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: sinekler sıcaklık Protokolü başlamadan önce arenaya alışmana gerekir. (A) tek erkek sinek arenaya tanıttı ve sonra artan sıcaklık başladı sürekli 16 ° c için 1 dakika, keşfetmek için izin. (B) tek 16 ° C, 20 ° C veya 24 ° C maruz sinekler (grup arasında fark; iki yönlü ANOVA F (2,570) 4.156, p = 0.162 =) daha yüksek bir hareket var 5 dk sonra deneme başında (iki yönlü RM ANOVA F (9,570) = 7.803, p < 0.0001). Ortalama ve standart hata değerlerin ortalamasının (± SEM) birden fazla gün içinde test 20 bakire kadın sinekler 5-7 gün eski verilerdir. Yıldız işareti gösterir gruplar arasında anlamlı bir fark (*** p < 0,0001; Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi, p = 0,05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Hareket yavaş yavaş artan sıcaklıklar maruz 5 Drosophila türlerin. Bireysel erkek ılıman (mavi), tropikal (kırmızı) uçar ve kozmopolit (kahverengi) Drosophila türler için artan bir sıcaklık gradyanı maruz (2 ° C her 60 s) 16 ve 46 ° c arasında İlk 7 min edildi sürekli 22 ° C sinekler arena keşfetmek izin vermek için. Türler önemli ölçüde farklı (iki yönlü RM ANOVA F(4,70) 28.46, p < 0,001 =). (a) D. melanogaster (kahverengi; daire dolu) daha hızlı arenaya tanıttığında yapıldı. (b) D. yakuba (kırmızı; boş kareler) artan sıcaklık daha hızlı oldu. (c) D. suzukii (kahverengi; dolu kare), maksimum performans noktasında diğer kozmopolit sinekler daha yavaş. (d) D. simulans (kahverengi; boş daireler) çürüme ö. melanogaster en yüksek noktada oldu. Her noktası 15 erkek sinek 5-7 gün eski birkaç gün içinde test (± SEM) ortalamasını temsil eder. Önemi sembollerle gösterilir (♦ fark--dan tüm p < 0,0001; = † D. melanogaster, dışında tüm farkı = p < 0,0001; • D. melanogaster, farkı = p < 0,01; ¢ fark D. melanogaster, p = < 0,001; adlandırılmış gruplar, p < 0,0001 arasındaki farkı =; Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi, p = 0,05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: ısı kontrollü arena-ebilmek var olmak kullanılmış için edimsel Klima. D. melanogaster Canton-S zorlanma (vahşi-type; siyah kenarlık) ve dnc1 (mankafa; kırmızı kenarlıkla) mutantlar edildi eğitimli yanal bir kiremit 22 ° c ile 40 ° C arasında 4 dk (eğitim, hayır için orta ısınma sonra ve yanal fayans karşısında tercih desen). Bellek ısıtmalı alanların sonra 22 ° C (test; ızgara desen) için tüm taşlar ayarlayarak mercek altına alındı. Sinekler sol yarısında deneyler Fayanslarda, sonra sağdaki diğer yarısında Fayanslarda tercih şartına. Toplam zamanın içinde çini eğitim ve sınama sırasında 22 ° C'de performansları karşılaştırmak için ölçüldü. Gruplar önemli ölçüde farklı (tek yönlü ANOVA F(3,76) 23.23, p < 0,0001 =), yaban tipi daha kötü genel olarak gerçekleştirmek mankafa ile. 20 bakire kadın sinekler 5-7 gün eski birkaç gün içinde test (± SEM) ortalaması verilerdir. Yıldız işaretlerini gösteren gruplar arasında anlamlı fark (*** p > 0,0001; *** p > 0,001; ** p > 0,01; Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi, p = 0,05) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: sıcaklık mutantların yanıt-e doğru artan sıcaklık rahat bir yerde sağlandığında. Sıcaklık mutantlar Gr28b.d (Yeşil; kareler) tepki denetimleri (w1118, siyah; daireler) sıcaklık arttıkça sürenin yüzdesi rahat alanında artırarak (iki yönlü RM ANOVA F (1,38) 0.5107, p = 0.479 =). TrpA1GAL4 (sarı; üçgenler) mutantız denetimlerden (w1118, siyah), farklı olarak onlar zaman rahat bölgede sıcaklık arttıkça artırmayın (iki yönlü RM ANOVA F (1,38) 1.670, p = 0,019 =). 20 erkek sinek 5-7 gün eski birkaç gün içinde test (± SEM) ortalaması verilerdir. TrpA1GAL4 Gr28b.d ve denetim (p < 0,05; önemli ölçüde farklıdır Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi, p = 0,05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada zaman ve mekan içinde hassas ısı değişiklikleri üreten bir otomatik ısı kontrollü arena (Şekil 1) sunulmuştur. Bu yöntem sadece sıcaklık (Şekil 2 ve Şekil 3) hazır çekim yavaş yavaş artar, aynı zamanda dinamik sıcaklık zorluklar içinde uçmak arena her parçasına sıcak olduğu için bireysel Drosophila pozlama sağlar farklı bir sıcaklık için bağımsız olarak (Şekil 4 ve Şekil 5).
Isı kontrollü arena Isıtma işlemi için yenilikçi bir yaklaşım kullanır. Geleneksel yöntemlerde kullanılan Peltier Termoelektrik Isıtma elemanları aracılığıyla kiremit sıcaklık değişiklikleri üreten, yerine bakır bir kitle bakır döşeme ile ısınmak için ısı kontrollü arena geçerli kullanır ve sinekler üst kısmında yer alır. Bakır kitle sürekli bir fan için bağlı bir soğutucu blok tarafından soğuduktan. Peltier benzeri öğeleri bu ısıtılan bir kez bakır kitle istenen sıcaklığını korumak için kullanılır. Bu öğelerin ana ısı jeneratörler olmadığından, onların ömrü uzatır ve daha hızlı sıcaklık değişikliklerine izin veren daha az stres, acı. Sıcaklık sensörleri her alçak gerilim güç kaynağı da etkinleştirebilirsiniz, bakır döşemenin altında geribildirim alır bir programlanabilir devre Isıtma mekanizması koordine eder. Araştırmacılar ne zaman ve nerede sıcaklık değişiklikleri ortaya ve şiddeti ve yönü bu tür değişiklikleri belirlemek belirtebilirsiniz. Ayrıca, yöntem ile özel kaplin takip yazılımı, FlyStepsgibi belirli sıcaklıklarda veya belirli konumları () içinde zaman, genel hızı gibi Drosophila'nın hareketi ile ilgili tüm yönleriyle analiz izin verir Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5). Yine de, tüm sonuçları özellikleri doğal onların hareket etkileyebilir davranış uçmak için düşünmek gerekir. Sinekler arena keşfetmek ve sıcaklık değiştirmeden önce yerleşmek için izin verilmiyor, örneğin, hız ölçümleri yapay olarak yüksek olabilir (Şekil 2). Sinekler sonraki sinekler etkiler odorants da bırakabilirsiniz; Bu nedenle, cam kaplama temizlenmesi gerekir ve teyp çini kapsayan konular arasında değiştirilmesi gerekir. Verilen bu yaş26sinekler gibi hareket azalır, sinekler varyasyon sonuçları önlemek yaş için standart önemlidir. Bizim arenada sinekler de centrophobism, kenarları orta alana tercih göstermiştir. Denemecileri bunun için site tercih overestimating önlemek için rahat alanlarda konumunu değiştirerek kontrol gerekir.
Arenanın geçerli özellikleri ve gereksinimleri izleme işleminin bazı deneysel prosedürler sınırı olabilir. Örneğin, yakın çevrenin Arena Bu uyarıcı önemli olduğu çalışmalar engelleyen erişim noktaları üzerinden kötü kokuları yok tanıttı, içermez. Benzer şekilde, FlyStepts ait diğer videolar ile Tekdüzen arka planlar, hangi sinek 's ortamına yiyecek veya diğer nesneleri ekleme olanağı sınırlar gerektirir. Arena bir gaz valfi bağlantı içerecek şekilde adapte olabilir ve yazılım gelişmeler var daha fazla nesne bulunması izin verebilir. Gelecekteki projelerde ısı kontrollü arena deneysel ihtiyaçlarınıza adapte bu olanakları yararlanmak olabilir.
Son olarak, sıcaklık (Şekil 3) artar ve sıcaklık mutantlar denetimleri (Şekil 5) aynı şekilde yanıt vermeyen Drosophila farklı türler farklı gerçekleştirmek sonuçlar göstermiştir. Bu bu yeni yöntem Drosophila'nın termal davranış ve nasıl doğal seleksiyon ve fonksiyonel özellikleri tarafından etkilendiğini keşfetmek için kullanılabileceğini gösterir. Son olarak, bizim yöntem daha fazla anlayış termal uyum yardımcı ve türleşme yanı sıra sıcaklık reseptörleri etkileşimler diğer bir çekim gücü ile gelecekte çalışmalar göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser kısmen tarafından burs davranışsal ve bilişsel sinirbilim programı Groningen Üniversitesi ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) Meksika, yüksek lisans burs verilen Andrea desteklenmiştir Soto Padilla ve Hedderik van Rijn ve Jean-Christophe Billeter saat çalışmanın John Templeton Vakfı Hibe. Biz de Peter Gerrit Bosma FlySteps ait diğer gelişmekte olan onun katılımı için müteşekkir vardır.
Komut dosyaları TemperaturePhases, FlySteps ve FlyStepAnalysis tamamlayıcı bilgiler olarak ve aşağıdaki geçici ve kamuya bağlantısında bulunabilir:
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?Token=c70159ad-4D92-443D-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I.
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
