Summary
Здесь мы представляем протокол автоматически определять опорно производительность дрозофилы на изменение температуры, с использованием программируемой температуры Арена, которая производит быстрой и точной температуры изменения во времени и пространстве.
Abstract
Температура является повсеместно экологический фактор, который влияет как видов распространять и вести себя. Различные виды фруктов мухи дрозофилы имеют конкретные ответы на изменение температуры согласно их физиологической терпимости и адаптируемость. Мухи дрозофилы также обладают температуры системы, которая стала основой для понимания нейронной основе температуры обработки в ectotherms. Мы представляем здесь температуры Арена, который позволяет быструю и точную температуру изменения с временных и пространственных управления для изучения реакции отдельных летит к изменению температуры. Индивидуальные мух помещаются на арене и подвергается запрограммированные температуры вызовы, такие, как единообразные постепенное увеличение температуры для определения нормы реакции или пространственно распределенных температур в то же время для определения предпочтений. Люди автоматически отслеживаются, позволяя количественная оценка скорости или расположение предпочтения. Этот метод может использоваться для быстро подсчитать ответ над большой диапазон температур для определения температурных кривых производительности в дрозофила или других насекомых, аналогичного размера. Кроме того она может использоваться для генетических исследований для количественного определения температуры предпочтения и реакции мутанты или одичал тип мух. Этот метод может помочь выявить основу тепловой видообразования и адаптации, а также нейронные механизмы за температуры обработки.
Introduction
Температура является постоянной экологический фактор, который влияет как организмы работать и вести себя1. Различия в широты и высоты приводят к различиям в типе климатов, подвергаются организма, что приводит к эволюционного отбора для их ответы на температуры2,3. Организмов реагировать на различные температуры через морфологические, физиологические и поведенческие адаптации, которые обеспечивают максимальную производительность в их конкретных условиях4. Например в плодовой мушки Drosophila melanogaster, население из разных регионов имеют различные температуры предпочтения, размеров тела, развития раз, долговечность, плодовитость и пешеходных производительность при разных температурах2 ,5,6,7. Разнообразие наблюдается между мух различного происхождения частично объясняется генетической изменчивости и пластиковые ген выражение8,9. Аналогичным образом дрозофила видов из разных областей по-разному распределить среди температурных градиентов и показать различия в сопротивление жары и холодные испытания10,,1112.
Дрозофилы также недавно стала модель выбора для понимания генетических и нейронных основы температуры восприятие13,14,,1516,17. Широко взрослых мух воспринимают температуры через холодные и горячие периферийных температурных датчиков в усики и датчики температуры в мозг13,14,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20. на периферии рецепторы для горячей температуры Экспресс Gr28b.d16 или пирексия21, то время как периферия холодной рецепторов характеризуются Brivido14. В головном мозге температура обрабатывается нейронов, выражая TrpA115. Поведенческие исследования на мутантов этих путей улучшение нашего понимания как обрабатывается температуры и дать понимание механизмов, которые варьируются среди популяций Drosophila из разных регионов.
Здесь мы описываем температуры Арена, который производит изменения быстрой и точной температуры. Следователи предварительно запрограммировать эти изменения, который позволяет для температуры стандартизированных и повторяемые манипуляции без вмешательства человека. Мух записываются и считано со специализированным программным обеспечением, чтобы определить их положение и скорость на различных этапах эксперимента. Основные измерения, представленные в настоящем Протоколе является пешеходной скорость при разных температурах, потому что это экологически соответствующий индекс физиологических производительности, который может идентифицировать отдельных тепловых адаптируемость5. Вместе с температурой рецептор мутантов эта техника может помочь выявить механизмы тепловой адаптации на клеточном и биохимических уровнях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка летать пищевой среды
- Налейте стакан стекло 2 Л 1 Л воды и добавьте магнитные перемешать бар. Поставил стакан на магнитной плитой на 300 ° C, до тех пор, пока температура кипения достигнута.
- Движение на 500 выстрелов/мин и добавьте следующее: 10 g агар, 30 г глюкозы, 15 г сахарозы, 15 г кукурузной муки, 10 г пшеничных зародышей, 10 г соевой муки, 30 г патоки и 35 g активных сухих дрожжей.
- Когда смесь энергично пены, поверните вниз плита температур до 120 ° C продолжая перемешивание.
- Свернув терморегуляцией температуры далее до 30 ° C после 10 минут, помешивая, пока смесь остывает до 48 ° C. Измерьте температуру, вставив термометр непосредственно в пищу не касаясь стены стакан.
- Растворите 2 g p гидрокси бензойная кислоты метилового эфира в 10 мл 96% этанола и добавить его в смесь, вместе с 5 мл 1 М пропионовой кислоты. Продолжить помешивая в течение 3 мин.
- Выключите конфорку и вылить 45 мл пищи в воспитании бутылки и 6,5 мл пищи в коллекции флаконов.
2. Подготовка мух
- Место 20 мужчин и 20 женщин мухи в воспитании бутылки, содержащие 45 мл среды покупать продукты питания. Передача мух в новые бутылки после 3 до 4 дней путем выстукивать их вниз и затем выстукивать их в свежий бутылки. Отказаться от мух после трех изменений.
- Поместите бутылки внутри инкубатор под 12-h свет/12-h темные циклы с постоянной температурой 25 ° c.
Примечание: Новое поколение мух будет Эклоз через десять дней.
- Поместите бутылки внутри инкубатор под 12-h свет/12-h темные циклы с постоянной температурой 25 ° c.
- Анестезировать недавно eclosed мух на двуокиси углерода колодки для максимум 4 мин и собрать их в 2,5 х 9,5 см летают воспитания флаконах с 6,5 мл летать пищевой среды с помощью кисти.
- Собирают только девственной мух и разделить их по признаку пола на группы 20 мух на воспитание во флаконе.
- Место флаконы внутри инкубаторы для 5-7 дней, изменив мух новых флаконах каждые 2-3 дня и в дни перед экспериментов.
3. рамка фары
- Сделать деревянную раму длиной 10 см, ширина 4 см, высота 4 см и толщиной 0,5 см.
- На каждом из короткого края, создание границы длиной 4 см, высота 4 см и шириной 1,5 см к внутренней области деревянной раме. Оставьте внутренних торцевых открыть границы.
- Два отверстия диаметром 0,5 см на пересечении одной из длинные края деревянной рамы и на каждой из границ на короткого края.
- Место 10 см теплый белый светодиодные полосы внутри каждой из границ на короткой кромках. Пил задней светодиодные полосы немедленно клеить его на месте.
Примечание: Для экспериментов, в которых освещение необходимо ликвидировать, теплый белый Светодиодная лента может быть заменен на инфракрасный светодиод полосы. - Подключите один конец светодиодные полосы в одну из границ импульсный источник питания и его другой конец светодиодные полосы на противоположной границы.
- Включите импульсный источник питания, чтобы убедиться, что оба светодиодные полосы включите.
- Обложка открытой стороне каждой границы с куском белой бумаги.
- Приклейте другой листок бумаги для каждого из внутренних фаз длинные края.
4. температуры Арена
- Включите температуры Арена (рис. 1A и 1 C). Убедитесь, что Вентилятор запускается и алюминиевое кольцо начинается разминка.
- Используйте USB-кабель для подключения температурного Арена на компьютер управления скрипта TemperaturePhases с последовательностями температуры.
- Откройте сценарий TemperaturePhases в управляющего компьютера и убедитесь, что температура последовательности правильно настроена (1 видео).
- Проверьте, что продолжительность каждой экспериментальной фазы равным 60 s, убедившись, что «пар. StimulusDur» равен 60 s.
- Проверьте, что равным 1) число желаемое число фаз, 2) итерационный ON/OFF set-up ориентировочные красный свет диоды (СИД), повышение температуры 3) 2 ° C на фазу, и 4) 16 ° C в качестве стартовой температуры все правильно под «начать экспериментальный блок» раздел.
Примечание: Разрешить мух, чтобы акклиматизироваться летать арену для 7 мин на 16 ° C, с тем чтобы избежать искусственного увеличения скорости во время первой экспериментальной фазы (рис. 2). - Запустите сценарий TemperaturePhases . Программное обеспечение будет инициализировать на 5 секунд, как это определено в «арене. Подождите» и затем остановить.
- Нажмите пробел клавиатуры, чтобы начать выполнение экспериментальной фазы после того, как был взорван летать летать арену (шаг 5.3).
Примечание: TemperaturePhases является текущий сценарий, контролируя поле; Однако это можно создать другие пользовательские сценарии для использования этого устройства, которые приспосабливаться к требованиям различных экспериментов.
- Подключите камеру на вершине Арена к записи компьютер с помощью USB-кабеля камеры.
- Откройте программу записи видео (см. Таблицу материалы) в записи компьютер, выбрав «файл | Новая видеозапись». Откроется экран показывая изображение от камеры.
- Убедитесь, что изображение камеры захватывает все края арены и ориентировочные красные светодиоды.
- Начните запись, нажав на красную кнопку в середине нижнего края экрана показаны изображение с камеры после кадра света вокруг арены (шаг 5.4).
Примечание: небольшие изменения в освещение может повлиять на точность отслеживания. Рекомендуется для поддержания постоянной освещение температуры Арена, фиксируя расположение аппарата.
5. Температура поведенческих эксперименты
- Подготовьте летать Арена (рис. 1 c).
- Поместите прядь белых проводящие ленты на вершине медных плиток, обеспечение того, что все углы покрываются.
- Место с подогревом алюминиевое кольцо вокруг медных плиток. Край кольца идеально подходит вокруг медного плитки, так что она всегда находится в том же месте.
- Очистите крышку стекла с чистой ткани и поместите его на вершине алюминиевое кольцо, оставляя разрыв, через который мухи могут быть ветром в.
Примечание: Перед эксперименты, пальто стеклянная крышка с siliconizing агента для создания скользкой поверхности. Применить siliconizing агент для 24 h и промойте его водой перед использованием.
- Запустите сценарий TemperaturePhases (шаг 4.3.3) и откройте программу записи видео (шаг 4.5).
- Удар лету от выращивания флакона (шаг 2.2.2) в арену летать (например., 1 кобель летать на рис. 3).
- Возьмите флакон мух от инкубатора, нажмите его дважды для того, чтобы заставить их пойти на дно, ловушка одной мухи с аспиратором рот и закройте флакон и положил его обратно в инкубаторе.
- Место лету на арене через пробел, который оставил между стеклянной крышкой и алюминиевое кольцо (шаг 5.1.3).
- Разрыва между стеклянной крышкой и алюминиевое кольцо, нажав стеклянную крышку, пока он не достигнет края алюминиевое кольцо как только лету вводится на арену, летать.
- Поместите кадр огней вокруг арены для обеспечения симметричных освещения.
- Марк местоположение (например., с помощью постоянного маркера) кадра света вокруг арены летать (рис. 1 c) для обеспечения, что кадр всегда размещается в том же месте.
- Начать запись с видео записи программы (шаг 4.5.2) и нажмите клавишу пробела на клавиатуре компьютера для запуска экспериментального этапа (шаг 4.3.4).
- После всех экспериментальных этапов сделали, сохранить видео в формате .mp4 или .avi и удалить лету от Fly Арена с аспиратором рот.
Примечание: В конце экспериментального этапа может быть определен как ориентировочные красные светодиоды, выключения или остановки скрипта TemperaturePhases .- Остановите запись, нажав кнопку Остановить в середине нижнего края экрана в программе записи видео. Нажмите «файл | Сохранить как», чтобы сохранить видео.
6. видео отслеживание и анализ данных
- Используйте FlySteps отслеживания программного обеспечения (2 видео) для отслеживания видео.
- Откройте «configuration_file.ini» внутри папки «FlyTracker».
- Задайте расположение видео в «video_folder» и имена видео в «video_files».
- Укажите границы летать арены в «arena_settings», основанный на (x, y) координаты пикселя нескольких точек на краю арены.
- Укажите местоположение ориентировочные красные светодиоды в «led_settings», основанный на (x, y) пиксельные координаты местоположения в центре светодиодов.
- Проверьте местоположение границ летают Арена, установив «Отладка» значение «true» в «arena_settings», нажав кнопку «Сохранить» и запуск сценария в терминале. Экран захвата видео появится синий квадрат, образованный координаты введены в «arena_settings».
Примечание: Этот квадрат окружает области, чтобы быть считано. - Измените «Отладка» в «arena_settings» на «false», нажмите «Сохранить» и еще раз запустить экран в терминале.
Примечание: Это будет начать процесс отслеживания.
Примечание: Мухи могут выйти из области отслеживания на подогревом алюминиевое кольцо. Это происходит в течение первых секунд эксперимента, после чего мух остановить трогательно подогревом кольцо и остаются внутри области отслеживания.
Примечание: Видео могут быть отслежены с другими отслеживания программного обеспечения согласно предпочтениям экспериментатора.
- Использование (x, y) местоположение каждого полета, предоставляемый отслеживания программного обеспечения для расчета меру интерес для температуры производительности. Пользовательские сценарии (например., FlyStepsAnalysis в дополнительных) могут быть использованы.
- Сравните производительность градуировки летать различных групп, используя повторные измерения (RM) дисперсионный анализ (ANOVA) и пост hoc несколько сравнений с использованием статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Температуры Арена (рис. 1A) состоит из трех меди плитки, температура которой может управляться индивидуально через программируемый цепи. Каждый медная черепица обладает температурный датчик, который дает обратную связь для программируемых цепи. Цепь активирует питания для повышения температуры каждой плитки. Пассивные термоэлектрические элементы выступать в качестве элементов постоянного нагрева для поддержания нужной температуры, в то время как теплоотвод охлаждается вентилятором обеспечивает постоянное охлаждение. Величина изменения температуры определяет скорость процесса в линейно. Увеличение 2 ° c требует только 0,1 s и увеличение числа 18 ° C требует 4 s. Экран подключен к программируемым цепи (рис. 1 c) информирует пользователя измерения температурных датчиков в каждом из плитки. Медные плитки окружены алюминиевое кольцо, постоянно нагревается до 50 ° C (рис. 1B и 1 C) полупроводников на периферии. Это кольцо образует края Fly Арена (рис. 1 c), район, в котором должны быть помещены мух. Fly Арена покрыта силицированного стеклянной крышкой (рис. 1A и 1 C), которая обеспечивает 3 мм высокой пространство, которое гарантирует, что мухи может ходить, но не летать. Рядом с Арена летать находятся два красных светодиодов (рис. 1 c), которые могут быть запрограммированы для обозначения различных экспериментальных этапов. Например, результаты, показанные на рисунке 2A, каждый светодиод ассоциируется с разной температуры, в то время как Рисунок 2B, каждый светодиод указывает 60 s. FlySteps программное обеспечение можно зарегистрировать, когда каждый из ориентировочного светодиодов на, и исследователь может затем использовать эту информацию для автоматического определения этапа экспериментальной основе температуры или времени.
Температуры Арена может использоваться для сравнения поведенческие реакции мух от различных генетических стола динамических температурных изменений. Например постепенно увеличивая температуры (рис. 3), чтобы сравнить различия в тепловой производительности могут подвергаться мух от разных видов. Скорость всех видов увеличивается с увеличением температуры до достижения точки максимальной производительности, после чего он сгнил и погиб. Однако каждый вид имеет особый ответ кривой с конкретными максимальной реакции скорости и тепловой допуски. Предыдущие доклады показали, что дрозофилы из разных видов отличаются среди развития сроки, долголетия, плодовитость, размеры тела, сексуальные связи и температура терпимости3,6,7 ,8,22. Таким образом наши описание вегетационных передвижения в градиента температуры добавляет этот орган работы.
Арена температуры может также использоваться для изучения ответ на принадлежности экспериментов на основе температуры. Простейшая форма такого подхода является оперантного кондиционирования парадигма, в которой обучаются мух предпочитают что одной стороне арены над другим, потепления вверх в сторону, которая будет избегать23,24,25. Мы подвергаемся отдельных мух до 40 ° C в середине и одна сторона плиток, оставляя другой стороне плитки в удобной 22 ° C (рис. 4). Одичал тип летит быстро перестал двигаться вдоль Арена и оставался в удобное расположение. В противоположность этому классический памяти мутант данс постоянно изучает Арена и провел меньше времени, чем элементы управления в удобное расположение. Различия между производительностью мух одичал типа и мутантов данс стал больше, когда все плитки были установлены до 22 ° C и сравнения были сделаны между группами лечения. Дурацкий мутантов также показали более различия между этапами обучения и тестирования по сравнению с одичал тип мух (рис. 4). Эти результаты показывают эффект памяти на оставшихся в удобное расположение.
Сочетания температуры и расположение также полезны для понимания функции рецепторов разной температуры во время динамических температурных изменений. Мы подвергаемся отдельным D. melanogaster Gr28b.d и TrpA1GAL4 мутантов, чтобы повышение температуры (2 ° C увеличить каждые 60 s) обеспечивая удобное расположение при 22 ° C (рис. 5). Удобное расположение смещается слева направо и наоборот, за итерацию. Результаты показывают, что на периферии температуры рецептора Gr28b.d мутантов ведут себя как элемент управления, как они тратят больше времени в удобное расположение как повышение температуры. Однако мозг температуры рецептора TrpA1GAL4 мутанты не страдают от увеличения температуры и не изменять их расположение на арене. Увеличение и уменьшение кривой TrpA1GAL4 мутантов показывают эффект в мух, которые уже сидели в удобное расположение, прежде чем он стал комфортно и оставался там в течение этого этапа. Последовательность пиков и долин кривой TrpA1GAL4 предположить, что эти мухи остается до сих пор для большинства эксперимента; Таким образом они постоянно были подсчитаны, когда их расположения был рассмотрен комфортно. Этот вывод был подтвержден визуального осмотра записанные видео. Эти результаты поддержки предыдущих физиологических сообщения о том, что восприятие периферии быстрых и больших изменений не зависит от Gr28b.d17 и что мух обладают основным центрального механизма в смысле температуры на основе TrpA1 14,21.
Рис 1: диаграмма температуры контролируется Арена. (A) боковой вид температуры Арена. Программируемый цепь соединяет датчики питания и температуры питания нагревательных элементов под медной черепицей контролировать их температуру. Плитки постоянно остынет через радиатор подключен к вентилятор. Подогревом алюминиевое кольцо, над которой лежит стеклянной крышкой окружает плитки. (B) тепловизионная показаны плитки на 24 ° C (вверху) и стороне плитки на 24 ° C с средней плитки при 30 ° C (внизу). Вид сверху (C) A арены. Камера записывает медных плиток, алюминиевое кольцо и красный светодиоды, а затем автоматически определяет экспериментальной фазы. Экран в углу окна, не записаны на камеру, отображает текущую температуру плитки. (D) кольцо света: два теплый белый LED полос внутри деревянный ящик, рассмотренные в документе обеспечить постоянную и симметричный освещение всей арены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: мухи должны акклиматизироваться на арену перед началом протокол температуры. (A) один мужской мух были введены на арену и позволило изучить на постоянной 16 ° C, за 1 мин, после чего температура начал расти. (B) одинарная мух, подвергается 16 ° C, 20 ° C или 24 ° C (не группы различия; двусторонний ANOVA F (2570) = 4.156, p = 0.162) имеют выше передвижения в начале эксперимента чем через 5 мин (двусторонний RM ANOVA F (9,570) = 7.803, p < 0.0001). Данные являются среднее и Среднеквадратичная ошибка среднего значения (± SEM) 20 девственной женщины мух 5 до 7 дней, проверены в течение нескольких дней. Звездочка указывает на значительную разницу между группами (*** p < 0,0001; Тьюки в множественные сравнения теста, p = 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Локомоции 5 видов дрозофилы , подвергается постепенно увеличивая температуры. Отдельные мужчины летит от умеренных (синий), тропического (красный), и космополитичный (коричневый) дрозофилы видов были подвержены увеличения градиента температуры (2 ° C каждые 60 s) между 16 и 46 ° C. Первые 7 мин были постоянно при 22 ° C разрешить мух для изучения на арене. Виды существенно отличались (двусторонний F(4,70) ANOVA RM = 28,46, p < 0,001). (a) D. melanogaster (коричневый; заполнены круги) был быстрее, когда представил на арену. (b) D. Якуба (красный; пустые квадраты) был быстрее, как температура увеличилась. (c) D. suzukii (коричневый, заполненный квадрат) был медленнее, чем другие космополитичный мух в точке максимальной производительности. (d) D. бахромчатая (коричневый; пустые кружки) был в упадке в максимальной точке D. melanogaster. Каждая точка представляет среднее (± SEM) 15 мужчин мух 5-7 дней старый испытания в течение нескольких дней. Значение обозначается символами (♦ = разница от всех, p < 0,0001; † = разница от всех, кроме D. melanogaster, p < 0,0001; • = отличие от D. melanogaster, p < 0,01; ¢ отличие от D. melanogaster, p = < 0,001; = разность между именем группы, p < 0,0001; Тьюки в множественные сравнения теста, p = 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Арена температуры могут быть использованы для оперантного кондиционирования. D. melanogaster кантон-S штамм (одичал тип; черные границы) и dnc1 (дурацкий; красная граница) мутанты были обучены предпочитают боковой плитки при 22 ° C после потепления в середине и напротив боковых плитки до 40 ° C на 4 мин (обучение, не шаблон). Память с подогревом областей затем проверяется, установив все плитки до 22 ° C (тест; сетка). Мухи были обусловлены предпочитают плитки в левой половине экспериментов, а затем плитки на право в другой половине. Процент общего времени внутри плитки при 22 ° C во время тестирования и обучения измерялась для сравнения выступлений. Группы были значительно отличаются (односторонний дисперсионный анализ F(3,76) = 23.23, p < 0,0001), с данс хуже чем одичал типа в целом. Данные являются среднее (± SEM) 20 Девственница женщина мух 5-7 дней старый испытания в течение нескольких дней. Звездочки показывают значимость разницу между группами (*** p > 0,0001; *** p > 0,001; ** p > 0,01; Тьюки в множественные сравнения теста, p = 0,05) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: ответ мутантов температуры на повышение температуры, когда предоставляется удобное расположение. Температура мутантов Gr28b.d (зеленый; квадраты) реагировать как элементы управления (w1118, черный, круги), увеличивая процент времени в районе комфортно как повышение температуры (двусторонний RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0.479). TrpA1GAL4 мутантов (желтый; треугольников) отличаются от элементов управления (w1118, черный), поскольку они не увеличивают время в районе комфортно как повышение температуры (двусторонний RM ANOVA F (1,38) = 1.670, p = 0,019). Данные являются среднее (± SEM) 20 мужчин мух 5-7 дней старый испытания в течение нескольких дней. TrpA1GAL4 значительно отличается от Gr28b.d и управления (p < 0,05; Тьюки в множественные сравнения теста, p = 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представили автоматизированный температуры Арена (рис. 1) которая производит точной температуры изменения во времени и пространстве. Этот метод позволяет воздействия отдельных дрозофилы не только для запрограммированных постепенное повышение температуры (рис. 2 и рис. 3), но и вызовы динамических температуры, в которые каждая плитка летать арены был нагрет самостоятельно для разной температуры (рис. 4 и Рисунок 5).
Температуры Арена использует новаторский подход к процесс нагрева. Вместо изменения температуры в плитки через термоэлектрические Пельтье нагревательные элементы, используемые в традиционных методов производства, температуры Арена использует текущий разогреть массу меди с медной черепицы, и мух находятся в верхней части. Постоянно меди масса охлаждается блок радиатора соединен с вентилятором. Пельтье как элементы используются для поддержания нужной температуры массы меди после того, как он нагревается. Потому что эти элементы не являются основным температуры генераторов, испытывают меньше стресса, который расширяет их жизни и позволяет быстрее изменения температуры. Программируемый цепи, которая получает обратную связь от температурных датчиков по каждому из меди плитка, которая может также активировать питания низкого напряжения, координирует Отопление механизм. Исследователи могут указать когда и где температура изменения происходят и определяют интенсивность и направление таких изменений. Кроме того сцепление метод с специализированными отслеживания программного обеспечения, таких как FlySteps, позволяет анализ всех аспектов, касающихся дрозофилы движения, такие как общая скорость при определенных температурах или время, затраченное в определенных местах ( Рисунок 2, рис. 3, рис. 4, рис. 5). Тем не менее все результаты должны учитывать характеристики присущи летать поведения, которые могут повлиять на их передвижение. Например, если мухи не допускаются для изучения Арена и урегулировать перед изменением температуры, скорость измерений может быть искусственно завышены (рис. 2). Мух можно также оставить отдушки, которые влияют на последующие мухи; следовательно должны быть очищены стеклянную крышку, и ленты, охватывающих плитки должно быть изменено между субъектами. Учитывая, что передвижения снижается, как мухи, возраст26, важно, что мухи являются стандартными для возраста, чтобы избежать изменения в результатах. В нашей арене мух также показали centrophobism, предпочитая краев средней площади. Экспериментаторы должны контролировать это, изменив расположение комфортабельные помещения для предотвращения переоценил сайт предпочтений.
Текущих характеристик арены и требований процесса отслеживания могут ограничить некоторые экспериментальные процедуры. Например закрыть среду арены не включать точки доступа, через которые может быть введена запахов, который предотвращает исследования, в которых этот стимул имеет важное значение. Аналогично FlyStepts трекер требует видео с единой стола, который ограничивает возможность добавления продуктов питания или других предметов к лету окружающей среды. Арена могут быть адаптированы к включить подключение к газовый клапан, и разработки программного обеспечения существуют, которые могут позволить больше объектов присутствовать. Будущие проекты могут воспользоваться эти возможности адаптировать температуры Арена специфическим потребностям экспериментальные.
Наконец мы показали результаты, выполняющих различные виды дрозофилы по-разному как повышение температуры (рис. 3), и что температура мутанты не отвечают в так же, как элементы управления (рис. 5). Это показывает, что этот новый метод может использоваться для изучения дрозофилы термического поведения и как она зависит от естественного отбора и функциональные характеристики. Наконец он иллюстрирует, что наш метод может помочь дальнейшее понимание теплового адаптации и видообразования, а также взаимодействия рецепторов температуры с других раздражителей в будущих исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана в части стипендию от поведенческих и когнитивных нейронаук программа Университета Гронингена и аспирантов стипендии от Consejo Nacional de науки y Tecnología (КОНАСИТ) из Мексики, предоставленных Андреа Сото-Падилья и Грант от Фонда Джон Templeton для изучения времени награждены Hedderik Ван Рейн и Жан-Кристоф Биллетер. Мы благодарны также Питер Gerrit Босма за его участие в разработке FlySteps tracker.
Скрипты TemperaturePhases, FlySteps и FlyStepAnalysis можно найти дополнительную информацию и временные и публично доступна по этой ссылке:
HTTPS://dataverse.nl/privateurl.XHTML?Token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25x95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I.
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
