Summary
本文介绍了小菜蛾赖诺酮受体 n 端域的蛋白表达、纯化、结晶和结构测定的方案.
Abstract
开发针对昆虫赖诺丁受体 (ryr) 的有效和高效杀虫剂在农业虫害防治领域引起了极大的兴趣。迄今为止, 几种针对害虫 ryr 的二胺类杀虫剂已经商业化, 年收入达20亿美元。但由于缺乏有关昆虫 ryr 的结构信息, 对 ryr 靶向杀虫剂作用方式的理解受到限制。这反过来又限制了对害虫中杀虫剂抗药性发展的理解。钻石返回蛾 (dbm) 是一种破坏世界各地十字花科作物的破坏性害虫, 据报道, 这种害虫对菱形杀虫剂也表现出抗药性。因此, 开发针对 dbm ryr 的新型杀虫剂, 特别是针对不同于传统二胺结合位点的地区, 具有十分重要的现实意义。在这里, 我们提出了一个协议, 从结构上描述 n 终端域的 ryr 从 dbm。x 射线晶体结构是通过分子置换求解的 2.84, 该分辨率呈β-树花药折叠图案和侧翼α螺旋。该协议可用于其他领域或一般蛋白质的表达、纯化和结构表征。
Introduction
ryanodine 受体 (ryr) 是特定的离子通道, 它介导ca 2 +离子在肌肉细胞中的肉瘤-质网膜 (sr) 的渗透。因此, 它们在激励收缩耦合过程中发挥着重要作用。在其功能形式中, ryr 组装成一个同型四聚体, 其分子质量为 gt;2 mda, 每个亚基由 ~ 5000个氨基酸残基组成。在哺乳动物中, 有三种等形式: ryr1-骨骼肌类型, ryr2-心肌类型和 ryr3-在不同的组织1中普遍表达。
在昆虫中只有一种类型的 ryr, 它表现在肌肉和神经组织2中。昆虫 ryr 更类似于哺乳动物 ryr2, 序列特征约为 47%3。拜耳 (氟苯二胺)、杜邦 (氯硝酸) 和先正达 (氰基吡鱼) 等主要公司开发并销售了针对舌再产的二铵杀虫剂。自最近推出以来, 二胺类杀虫剂已成为增长最快的杀虫剂类别之一。目前, 这三种杀虫剂的年销售额已超过20亿美元, 增长率自2009年以来超过 50% (阿特拉诺娃)。
最近的研究报告了在使用这些杀虫剂4、5、6、7、8几代之后昆虫抗药性的发展。来自钻石蛾 (dbm)、 plutella xylostella ( g4946e, i4790m) 的 ryr 跨膜域的抗性突变以及番茄叶矿工tuta aicuruta的相应位置表明该地区可能与二胺杀虫剂结合, 因为该地区是众所周知的关键是门控通道 4,8,9。尽管在这一领域进行了广泛的研究, 但二胺类杀虫剂的确切分子机制仍然难以捉摸。此外, 目前尚不清楚耐药突变是直接影响与二胺的相互作用还是同种异体的相互作用。
早期的研究报告了哺乳动物种的几个 ryr 域的结构, 以及 x 射线晶体学和低温电子显微镜分别为 10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21.但到目前为止, 还没有报道昆虫 ryr 的结构, 这使得我们无法了解受体功能的分子复杂性, 以及杀虫剂作用和杀虫剂抗药性的发展的分子机制。
在这篇手稿中, 我们提出了一个广义的协议的结构表征 n 端β-树箔域的 ryanodine 受体从钻石蛾, 一种破坏性的害虫感染世界各地的十字花科作物22。该结构是根据出版的兔子 ryr1 ntd 晶体结构23,24和低温 em 结构模型16,17,18, 19设计的。20,21. 这是为昆虫 ryr 报告的第一个高分辨率结构, 它揭示了通道门控的机制, 并为利用结构药物设计开发物种专用杀虫剂提供了一个重要模板。在结构阐明方面, 我们采用了 x 射线晶体学, 它被认为是在近原子分辨率下测定蛋白质结构的 "金标准"。虽然结晶过程是不可预测的和劳动密集型的, 这一步一步的协议将帮助研究人员表达, 纯化和表征昆虫 ryr 或任何其他蛋白质的其他领域或一般。
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Protocol
1. 基因克隆、蛋白质表达和纯化
- pcr 扩增与感兴趣的蛋白质相对应的 dna (dbm ryr 的残留量 1-205, genbank acc. no。afw97408) 和克隆到 pet-28a-hmt 矢量由连接独立克隆 (lic)25。该载体包含一个组氨酸标记、mbp 标记和 n-终点15处的 tev 蛋白酶裂解位点.
- 设计用于扩增目标基因的 lic 引物, 其与 lic 兼容的 5 ' 扩展:
正向 lic 底漆:
5 ' tactcacccatcatggggggggggg 3 '
反向 lic 底漆:
5 "ttaccccctcttatttgcgcgcgggggggc 3" - 将反应组分 (50μl) 组合在使用: 1μl 的 dna 模板 (100ngμμl), 1μl 的正向底漆 (10μm), 1μl 的反向底漆 (10μm), 0.5μl 的 dna 聚合酶 (neb), 5μl 的10x 反应缓冲液, 1μl 的 dntp (25mm), 40.5μl 的 rnase 游离 ddh2o.
- 将反应混合物放入 pcr 机器中, 并运行以下程序。
- 在95°c 下孵化 3分钟, 然后运行30个周期 (95°c 30秒, 58°c 15秒, 72°c 1分钟)。在72°c 下孵化 5分钟, 然后在4°c 下保持。
- 在2% 琼脂糖凝胶上运行整个反应混合物 (50μl), 并用凝胶提取试剂盒提取。遵循制造商的协议。
- 与连接无关的克隆 (lic)
- 执行 spi 消化 (60μl): 20μl 的载体 dna (50ngμl)、10x 反应缓冲液的6μl、sspi 的4μl 和30μl 的 ddh 2o 在37°c 时培养 3小时, 在1% 琼脂糖凝胶上运行整个反应混合在1% 琼脂糖凝胶凝胶凝胶中, 并与凝胶提取试剂盒提取.遵循制造商的协议。
- 对载体进行 t4 dna 聚合酶处理并插入 dna。结合以下方法: 5μl 的载体或插入 dna (50 ng/μl), 10xl t4 dna 聚合酶缓冲液、1μl 的 dgtp (25 mm) 为载体, 1μl 的 dctp (25 mm) 用于插入 dna, 1μl 的 dGTP (100 mm), 0.4 微米的 t4 dna 聚合酶 (lic 合格)在室温下培养反应 40分钟, 在75°c 时热失活酶20分钟。
注: lic 载体和插入 dna 必须在不同的反应中进行处理。 - 执行 lic 退火反应。结合以下方法: t4 处理插入 dna 2μl, t4 处理的 lic 载体 dna 2μl。在室温下孵化反应10分钟。
- 设计用于扩增目标基因的 lic 引物, 其与 lic 兼容的 5 ' 扩展:
- 利用该重组质粒转化 bl21 (de3)大肠杆菌细胞。
- 在冰上解冻有能力的细胞 (微离心管中的 50μl)。
- 在试管中加入约 1μl (50 纳克) 的质粒。轻轻闪烁 2-3次管, 将细胞和 dna 混合。将管子放在冰上20分钟。
- 在42°c 时热冲击 40度. 将管再次放在冰上 2分钟. 将室温 lb 介质加入1毫升的室温 lb 介质。
- 将混合物管放在37°c 的250转/分振动台中, 时间为 45分钟. 将混合物的150–200μl 扩散到选择板上。反转板, 在37°c 下孵育过夜。
- 选择单个菌落, 在37°c 过夜时培养含有50μgml 卡那霉素的 100 ml 2yt 培养基中的细胞。第二天早上, 接种含有50μgml 卡那霉素的1升2yt 培养基, 其中含有10毫升的隔夜培养物, 并在37°c 的振动筛孵化器中孵育 250 rpm, 直到 od600达到 ~ 0.6。此后诱导与 iptg 的培养到 0.4 mm 的最终浓度, 并在30°c 下再生长5小时。
- 在4°c 条件下, 以 8, 000 x 克离心10分钟的速度收集细胞, 收集细胞并在 40 ml 裂解缓冲液中重新悬浮每10克细胞 (10 mm hepes ph 7.4, 250 mm kcl, 10mm β-硫醇, 25μml 溶菌酶, 25μgml dnase, 1 mm 永磁同步电机)。
- 以65% 的振幅用声纳破坏它, 8分钟, 1秒开, 1分钟关闭。在4°c 下, 以 40, 000 x克离心 30分钟, 取出细胞碎片。通过0.22μm 过滤器对上清液进行过滤, 并将其加载到样品回路中。
- 纯化融合蛋白, 裂开标签, 重新纯化目标蛋白。
- 使用 ni-nta 柱纯化融合蛋白 (结合缓冲液:10 mm hepes ph 7.4, 250 mm kcl; 洗脱缓冲液:10 mm hepes ph 7.4, 250 mm kcl, 500 mm 咪唑), 并通过净化系统进行纯化, 线性梯度为 20–250 mm 咪唑。
- 在4°c 下, 用 tev 蛋白酶 (1:50 比) 在夜间清除洗脱的目标蛋白。
- 使用直链淀粉树脂柱 (结合缓冲液:10 mm hepes ph 7.4、250 mm kcl; 洗脱缓冲液:10 mm hepes ph 7.4、250 mm kcl、10 mm maltose) 和 ni-nta 色谱去除标签和 tev 蛋白酶, 纯化裂解反应混合物。目标蛋白将在这两列的流经部分。
- 将样品透析为透析缓冲液 (10 mm tris-hcl ph 8.8, 50 mm kcl, 10 mm β-硫醇, 以降低盐浓度)。在阴离子交换柱上纯化样品 (绑定缓冲区:10 mm tris-hcl ph 值 8.8, 10 mm β-硫醇; 洗液缓冲液:10 mm tris-hcl ph 值 8.8, 1 m kcl, 10 mm β-硫醇) 在洗脱缓冲液中的线性梯度为 20-500 mm kcl。
- 作为纯化过程中的最后一步, 使用离心式浓缩器 (10kda mwco) 浓缩蛋白质, 并注入 superdex 200 26/600 凝胶过滤柱, 以检查均匀性。
- 通过在 15% sds page 上运行该蛋白来检查其纯度。
请注意:所有色谱柱都在蛋白质净化系统上运行, 结合流量为 2 mL/min, 洗脱流量为 4 mL/min, 但在 1 ml/min 时过滤。
2. 蛋白质制备与结晶
- 使用离心式选矿厂 (10kda mwco) 将纯化后的蛋白质样品浓缩到 10mgml, 并在储存在-80°c 之前将缓冲液交换到结晶缓冲液。
- 采用295-k 的坐滴蒸汽扩散方法, 使用96井格式的自动液体处理机器人系统, 采用多个结晶试剂盒, 进行结晶筛选 (12:1 比、200升蛋白质和200升储层缓冲液)。
请注意:我们使用了分子尺寸和汉普顿研究的试剂盒以及鹰头狮自动液体处理系统。 - 密封96孔结晶板, 防止蒸发, 并使蛋白质下降与储层缓冲液的平衡。然后将板材保存在晶体孵化器中的18°c。
- 使用光学显微镜定期检查96孔板, 以监测晶体的形成和生长。
- 要区分蛋白质晶体和盐晶体, 请使用蛋白质染料。在目标滴中加入1μl 染料。等待约 1小时, 并在显微镜下观察。蛋白质晶体会变成蓝色。
- 使用正结晶条件 (1.5 m 硫酸铵, 0.1 m tris ph 8.0) 在24孔板中使用悬挂滴蒸汽扩散法进一步优化晶体。
- 将 ph 值从7.0 优化为 8.5, 每步 0.5 ph 单位间隔。每步 0.1 m 的时间间隔, 优化硫酸铵浓度从 1.2 m 到 1.7 m。(在我们的例子中, 生产大型板状晶体的最佳条件是 0.1 m hepes ph 7.0 和 1.6 m 硫酸铵)
3. 晶体安装、x 射线数据采集和结构测定
- 用含有20% 甘油的储液作为低温保护剂, 将晶体安装在低温中, 在液氮中冷却闪冷。将水晶放入 unipuck 存放和运输。
- 使用 rigaku 内部 x 射线衍射仪的预屏幕蛋白质晶体。选择具有最高分辨率的同步加速器设施数据收集最佳数据 (我们的数据集是从上海同步辐射设施的 bl17u1 收集的)。
- 使用波束线控制软件 bluice26安装和中心的晶体通过自动或手动居中功能。执行测试曝光以确定数据收集策略, 包括起始角度、曝光时间、探测器距离、帧宽度和数字。
- 相应地收集数据集 (我们收集了180帧, 曝光时间为 1秒, 帧宽度为 1°, 探测器距离为 350 mm)。
- 使用 hkl2000 第27套索引、集成和扩展数据集.首先实现峰值搜索功能, 找到衍射点, 然后对衍射点进行索引, 选择合适的空间群。在峰值集成之后, 使用适当的错误模型缩放数据集并保存输出. sca 文件。
- 通过在 phenix29中使用 phaser28进行分子置换来解决相位问题。
- 通过 xtriage30计算不对称单位中蛋白质分子的可能拷贝数。
- 利用文献中的已知结构或结构预测服务器 (如 phyre231) 生成的模型 (我们使用兔子 ryr1ntd)寻找具有高序列标识和结构相似性的适当结构模板作为目标蛋白。一个搜索模型, pdb id 2xoa)。
- 运行 phaser 使用衍射数据文件, 模板结构文件和蛋白质序列文件, 找到解决方案。
- 在 phenix29中执行自动生成32 , 使用 phaser 的输出文件和目标蛋白中的序列文件生成初始模型。
- 使用整理33将结构构建到修改后的实验电子密度中, 并在迭代周期中使用 phenex. 细化34进行细化.
- 使用 phenix18中的验证工具验证最终模型。
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Representative Results
净化
dbm ryr 的 n 端域被表示为具有六角蛋白标记、mbp 标记和 tev 蛋白酶裂解位点的融合蛋白。我们遵循五步纯化策略, 以获得一种高度纯的蛋白质, 适合结晶目的。首先, 用 ni-nta 柱 (histrap hp) 从细胞裂解液的可溶性组分中纯化了融合蛋白。其次, 对融合蛋白进行 tev 蛋白酶裂解, 用直链淀粉树脂柱去除六角蛋白 mbp-多重症, 然后采用镍-nta 色谱。此外, 该蛋白质通过阴离子交换柱 (q sephose hp) 纯化, 最后由凝胶过滤柱 (superdex 20026/600) 纯化。使用2yt 培养基培养1升细菌的纯化蛋白的最终产率为 ~ 4 毫克。纯化后的蛋白质在 sds-page 上呈单带, 为 ~ 21 kda (图 1)。凝胶过滤柱的洗脱量证实, 纯化后的 ryr ntd 是单体 (图 1)。
结晶
96孔板的初始结晶筛选在几个条件下产生晶体。选择这些条件对24个井板进行晶体优化。形成高质量板状晶体的最佳条件是 0.1 m hepes ph 7.0 和 1.6 m 硫酸铵 (图 2)。
结构确定
在上海同步辐射设施的波束线 bl17u1 上, 得到的晶体被衍射至2.84。在空间组p61 中, 用单元细胞参数 a = 170 0.13, b = 170.13, c = 51.7 63, αβ = 90.00 °, γ= 120°。在 phenix 中, 采用了分子置换技术作为搜索模型。在 phenix 中对结构进行了进一步完善, 最终进行了 r 工作, 分别不超过 21.63% 和 24.52%。表 1列出了数据收集和优化统计信息。图 3显示了覆盖残留量 1-205 (pdb id 5y9v) 的 dbm ryr ntd 的解决结构。
图1:sds-page 和凝胶过滤色谱图,代表 dbm ryr ntd 35 的纯化.sds page (15%) 在五步纯化策略之后, 将纯化后的 dbm ryr ntd 作为单波段。左车道显示标准蛋白标记 (pm)。使用 superdex 200 26/600 柱获得的凝胶过滤色谱显示洗脱峰值为 240 ml, 对应于蛋白质的单体形式。请点击这里查看此图的较大版本.
图2。dbm ryrntd 35的结晶。在光镜下观察, 用蒸汽扩散法产生的 dbm ryr ntd 晶体。结晶条件为 0.1 m hepes ph 7.0 和 1.6 m 硫酸铵。刻度栏 = 200μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: dbm ryr ntd (pdb id 5y9v)的结构 35。从两种观点中解决了蛋白质的结构。对辅助结构元素进行标记。β链显示为紫色。α螺旋和一个 310螺旋显示为蓝色。循环显示为白色。nt 和 ct 分别表示蛋白质的 n 端和 c 端。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1: dbm ryr ntd 晶体35的数据收集和完善统计数据.请点击此处下载此表格.
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Discussion
本文描述了 dbm ryr ntd 的重组表达、纯化、结晶和结构的确定过程。对于结晶, 一个关键的要求是获得高溶解度、纯度和均匀性的蛋白质。在我们的协议中, 我们选择使用 pet-28a-hmt 矢量, 因为它包含一个六氨酸标记和 mbp 标记, 这两个标记都可用于纯化, 以获得更高的折叠纯度。此外, mbp 标记有助于目标蛋白的溶解度。我们通过连续五个步骤纯化蛋白质, 得到了高度纯净、适合结晶的蛋白质。采用自动液体处理系统进行结晶筛选。与传统的手动下拉设置筛选相比, 自动化系统使用的样品量非常小, 节省了时间和精力。由于液体处理的准确性, 它还提高了重现性。晶体在内部进行了筛选, 并在同步加速器进行数据收集, 因为它提供了强度更高、发散更小的 x 射线, 从而产生高质量的数据。分子置换是我们的首选, 因为类似的结构模板可在数据库中。另一种方法是使用实验阶段, 包括 mad、sad、mir等.
在求解 dbm ryr ntd 结构时, 从 xtriage 30 获得的 matthews 系数表明, 非对称单元 (asu) 很可能含有四个溶剂含量为46% 的单体, 概率为 49%.然而, 我们在 asu 中找不到有四个分子的正确解决方案。随后寻找两个、三个、五个、六个分子的运行也失败了。最终, 我们在 asu 中只找到了一个分子的正确溶液, 该分子的概率只有 4%, 溶剂含量超过86%。我们解决了这个结构后, 确定了高含水量。因此, 极端高的溶剂含量确实存在, 这取决于蛋白质包装的内在方式。
虽然 x 射线晶体学是蛋白质结构测定的黄金标准, 但具有大紊乱或灵活区域的蛋白质和一些亲和力较弱的大型蛋白质复合物具有挑战性。蛋白质工程方法, 包括环路截断、表面熵减少和交联, 可能会提高获得更好的蛋白质晶体的机会。除了揭示高分辨率蛋白质结构外, x 射线晶体学还可用于研究蛋白质-农药的相互作用, 这将有助于我们进行基于结构的农药设计。qi等人发现, 不同的二胺家族可能会与36物种不同的不同地点结合在一起。利用我们的策略, 可以确定来自多个物种的 ryr 结构, 并确定导致观测物种特异性的独特元素。总体而言, 该协议可适用于任何蛋白质或蛋白质域的表达、纯化、结晶和结构测定。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究的资金由以下机构提供: 国家重点研究和发展计划 (2017yfd0201400, 2017YFD0201400)、中国国家自然科学基金 (13320103922, 31230061) 和国家基础研究项目 (973)中国 (2015cb856500, 2015cb856504)。我们感谢上海同步辐射设施 (ssrf) 波束线 bl17u1 的工作人员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop - 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
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