Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

فصل البكتيريا بمقدار كبسولة استخدام تدرج كثافة متقطع

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58679
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Wellcome Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, 2Department of Medicine, University of Cambridge

Summary

ونحن تثبت استخدام التدرجات كثافة متقطع لفصل السكان البكتيرية استناداً إلى إنتاج كبسولة. يتم استخدام هذا الأسلوب لمقارنة كمية كبسولة بين الثقافات، وعزل طفرات مع النمط الظاهري كبسولة محددة، أو لتحديد المنظمين كبسولة. الموصوفة هنا هو الأمثل وتشغيل المقايسة.

Abstract

كبسولة عامل فوعة رئيسية في العديد من الأنواع البكتيرية، والتوسط للتهرب من المناعة ومقاومة الإجهادات الجسدية المختلفة. حين تتوفر العديد من الطرق لقياس ومقارنة إنتاج كبسولة بين سلالات مختلفة أو طفرات، لا يوجد أي أسلوب المستخدمة على نطاق واسع لفرز البكتيريا على أساس أنها تنتج عن كم كبسولة. قمنا بتطوير طريقة لفصل البكتيريا بمقدار كبسولة، استخدام تدرج كثافة متقطع. يتم استخدام هذا الأسلوب لمقارنة مقادير كبسولة شبه كمي بين الثقافات، لعزل طفرات مع تغيير الإنتاج الكبسولة، وتنقية capsulated البكتيريا من عينات معقدة. هذا الأسلوب يمكن أيضا أن يقترن التسلسل ينقول-الإدراج لتحديد الجينات المشتركة في تنظيم كبسولة. ويتجلى الأسلوب هنا، بالتفصيل، بما في ذلك كيفية تحسين شروط التدرج لأنواع بكتيرية جديدة أو السلالة، وكيفية بناء وتشغيل التدرج الكثافة.

Introduction

العديد من الأنواع البكتيرية تنتج كبسولة السكاريد، الذي يحمي الخلية البكتيرية من مختلف الضغوط المادية والاعتراف وقتل قبل النظام المناعي. في الكلبسيله الرئوية، إنتاج كبسولة شرط مطلق للعدوى1،2. كبسولة K. الرئوية يتوسط مقاومة الببتيدات المضادة للميكروبات، والمقاومة لقتل مكملاً بوساطة، ومنع البلعمه، وقمع ل الاستجابة المناعية الفطرية3. فائض إنتاج كبسولة يرتبط بزيادة الفوعة والعدوى المكتسبة في المجتمع (بدلاً من المستشفيات)4.

وتتوفر مجموعة من الاختبارات الكمية والنوعية للتحقيق في إنتاج كبسولة. للأنواع الكلبسيله ، وتشمل هذه السلسلة اختبار5، التي يتم سحبها مسواك تطرق إلى مستعمرة صعودا ويقاس طول السلسلة تنتجها، وموكوفيسكوسيتي الإنزيم6، الذي ينطوي على الطرد المركزي بطيئة من ثقافة متبوعاً بقياس الكثافة البصرية للمادة طافية. هذه الأساليب هي بسيطة وسريعة، ولكن تفتقر إلى الحساسية عند استخدامه في الكلاسيكية الكلبسيله سلالات بدلاً من سلالات إفراز كبسولة. هو أسلوب آخر للقياس الكمي كبسولة مقايسة حمض uronic، الذي يمثل تحديا من الناحية التقنية ويتطلب استخدام حامض الكبريتيك تركيز1. وأخيراً، كبسولة مرئياً مباشرة عن طريق الفحص المجهري (الشكل 1A). من هذه الأساليب، إلا مجهرية تسمح للمستخدم لمراقبة الدول كابسوليشن مختلفة داخل مجموعة واحدة من سكان، وأيا من هذه الأساليب تمكن الفصل المادي للبكتيريا كابسولاتيد وغير كابسولاتيد.

تستخدم بشكل روتيني في بيولوجيا الخلايا لتنقية الخلية حقيقية النواة مختلف أنواع7فواصل مبنية على الكثافة بالطرد المركزي التدرج، ولكن نادراً ما تستخدم في الأبحاث الميكروبيولوجية. التحليل موكوفيسكوسيتي الكلبسيله يستند إلى ملاحظة أن البكتيريا capsulated عاليا يستغرق مزيدا من الوقت بيليه بالطرد المركزي، ونحن مسبب أن هذا قد يكون بسبب انخفاض الكثافة الإجمالية من الخلايا كابسولاتيد. الأسلوب هو موضح هنا وضعت لفصل السكان K. الرئوية فعلياً بمقدار كبسولة، استخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي (الشكل 1). وكان تطبيق هذا الأسلوب بنجاح العقدية الرئوية، مما يشير إلى أنها تنطبق على الأنواع البكتيرية الأخرى. فصل الكثافة--التدرج من مكتبة متحولة ينقول مشبعة مقترنة بالتسلسل ينقول-الإدراج (الكثافة--تراديسورت) وقد استخدمت لتحديد الجينات المشاركة في الإنتاج والتنظيم كبسولة8. وبالمثل، كان استخدام هذا الأسلوب بالاقتران مع عشوائي رئيس الوزراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من مستعمرات فردية لعزل غير كابسولاتيد الرئوية ك. المسوخ. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لمقارنات سريعة لإنتاج كبسولة بين مختلف قطاعات السكان والظروف، أو لتنقية البكتيريا كابسولاتيد من العينات المعقدة (الشكل 1B). وأخيراً، هناك خيار للاعتداء الأخرى تعمل التي تؤثر على كثافة، مثل حجم الخلية أو التجميع.

يوضح كيفية تحسين الإجراءات الخاصة أنواع بكتيرية جديدة أو سلالة هذه المخطوطة ويدل على تشييد وتشغيل التدرج كثافة متقطع لفصل البكتيريا فرط كابسولاتيد وكابسولاتيد وغير كابسولاتيد.

Protocol

ملاحظة: ضمان الالتزام أي تقييمات المخاطر المطبقة على السلالات البكتيرية إلى عند استزراع ومناولة العينات. كن على علم أن إنشاء تدرجات كثيرة جداً في وقت واحد يمكن أن يؤدي إلى الاضطرابات العضلية الهيكلية بسبب الضغط على مفاصل من بيبيتينج بطيئة المعنية. خطة العمل واتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الإصابة.

1-إعداد السلالات البكتيرية أو مكتبات متحولة

  1. متواصلة من سلالات لفحصها في لوحات أجار المناسبة. هذه لوحات الأسهم للتجربة.
    1. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في درجة الحرارة المطلوبة لتحقيق واحد من المستعمرات. لهذه التجربة، والثقافة K. الرئوية (سلالات نتوه-K2044 و ATCC43816) على أجار مرق (رطل) لوريا في 37 درجة مئوية، و الرئوية. س. (نوع البرية 23F و 23F Δcps) على أجار الدم في جرة هوميديفيد شمعة في 37 درجة مئوية.
  2. اختيار مستعمرة واحدة من صفيحة الأوراق المالية (الخطوة 1، 1) لتطعيم 10 مل من مرق المناسبة باستخدام حلقة عقيمة أو عصا كوكتيل. لفحص عشوائي مكتبات متحولة، تطعيم المرق مع 10 ميليلتر من رصيد المكتبة متحولة عشوائية (مكتبة تراديس).
    1. احتضان سلالات K. الرئوية في وسائل الإعلام رطل ملح منخفضة عند 37 درجة مئوية مع الهز، وضغوط الرئوية. س. في الدماغ القلب ضخ (بهي) وسائط الإعلام، بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية.
    2. نقل الثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في مقاعد البدلاء-أعلى أجهزة الطرد مركزي لمدة 10 دقيقة في 3,200 س ز في أرجوحة من الدلاء مع إدراج أنبوب 15 مل وأغطية ضيقة الهباء الجوي.
    3. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 2 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
      ملاحظة: التخلص من طافية عبر مسار النفايات البيولوجية السائلة المناسبة في المختبر. وغرض الخطوات الطرد المركزي واستثارة (1.2.2 و 1.2.3) هو التركيز البكتيريا للتصور سهلة على التدرج. الثقافات البكتيرية يمكن تحميله مباشرة على التدرج إذا فضلت. سلالات كابسولاتيد بشكل كبير قد لا تشكل بيليه ضيق. في حالة حدوث ذلك، إزالة المادة طافية قدر ممكن دون إزالة أي من الخلايا البكتيرية، إضافة 1 x برنامج تلفزيوني لوحدة تخزين نهائي من 5 مل وريسوسبيند بيليه. مواصلة البروتوكول مع الخطوة 1.2.5.
    4. للحصول على سلالات غير مخاطي، انتقل إلى الخطوة 2.
    5. الطرد المركزي في الأنابيب كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.
    6. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 2 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. الخلايا الآن جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة: كثافة تعليق الخلية البكتيرية ليست حرجة ولكن يجب أن يكون كافياً للتصور في التدرج. OD الحد أدنى600 (الكثافة البصرية 600 nm) 4 من المقترح.

2-إعداد اختبار التدرج المصغر وتخفيف التدرج

  1. إعداد تخفيف التدرج.
    ملاحظة: تركيزات الدقيق من الكثافة المتدرجة المتوسطة (مثلاً، بيركول) المطلوبة في التدرجات الكثافة لتحقيق فصل جيدة سوف تختلف تبعاً لظروف الإجهاد والنمو البكتيرية المستخدمة. يتم إجراء الاختبارات التدرج المصغر أولاً، تحديد التركيزات التي سوف تعطي أفضل فصل. وهذه تشمل 500 ميليلتر من إضعاف واحد في أنبوب 2 مل. إذا كان سيتم المستخرجة من التدرج البكتيريا وسوبكولتوريد للتطبيقات المصب، وينبغي تنفيذ هذه الخطوات تحت ظروف معقمة.
    1. تجمع بين الكثافة المتوسطة التدرج مع برنامج تلفزيوني x 1 جعل تخفيف متدرج الكثافة. جعل تخفيف من 20%، 30%، 40%، 50%، 60%، 70%، و 80% (مثل، 2 مل كثافة متوسطة متدرجة بالإضافة إلى 8 مل من برنامج تلفزيوني 1 x = 10 مل من 20% كثافة متوسطة الانحدار).
    2. الكوة ميليلتر 500 من 20 ٪ تمييع التدرج في أنبوب 2 مل لكل سلالة اختبارها (مثل، سلالات 4 = 4 أنابيب تحتوي على 500 ميليلتر لتمييع التدرج 20%).
    3. كرر الخطوة 2.1.2 لبقية تخفيف التدرج.
  2. تطبيق البكتيريا على التدرج.
    1. تطبيق 100 ميليلتر من الخلايا البكتيرية أعد الخطوات 1.2.3 و 1.2.6 إلى الجزء العلوي من كل تمييع التدرج اتباع الخطوات التالية.
      1. 100 ميليلتر من الخلايا باستخدام ماصة ميليلتر 200 ووضع طرف الماصة على جانب الأنبوب الموجود أسفل غضروف التدرج المصغر.
      2. نضح الخلايا البكتيرية على التدرج ببطء شديد حتى أن تشكل طبقة أعلى التدرج، دون أي خلط للواجهة.
      3. كرر الخطوات 2.2.1.1–2.2.1.2 لجميع سلالات لفحصها.
    2. استخدام دوار زاوية ثابتة مع غطاء ضيق الهباء الجوي، الطرد المركزي أنابيب معدّة في ميكروسينتريفوجي لمدة 10 دقائق في س 8,000 ز.
    3. بعد الطرد المركزي، نقل الأنابيب برف لتصور تمييع التدرج الحد الأدنى المطلوب للاحتفاظ بالخلايا فقط فوق طبقة التدرج بعد الطرد المركزي.
    4. إذا كانت النتائج غير واضحة، كرر الاختبار المتدرجة مصغرة مع زيادات بكثافة 5% تخفيف المتوسطة التدرج أعلاه وأدناه التركيزات المحددة في الخطوة 2.1.1 (مثل، 25% و 35% تخفيف ينبغي اختبار إذا كانت النتيجة 30% غامضة).
      ملاحظة: انظر الشكل 2ألف للنتائج النموذجية في تخفيف كثافة واحدة متوسطة متدرجة.
    5. استخدام النتائج من الخطوات 2.2.3–2.2.4 لتحديد تخفيف التدرج مثالية استخدامها لفصل الخلايا في نطاق أوسع التدرجات متقطع.

3-إعداد الخلايا للتجربة الرئيسية

  1. إعداد جديدة من الثقافات بين عشية وضحاها بتطعيم 10 مل مرق المناسبة كما هو موضح في الخطوة 1.2.
    1. احتضان ثقافات بين عشية وضحاها في الظروف المناسبة كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.
    2. بيليه ثقافة بين عشية وضحاها كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.
  2. تغسل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
  3. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. إذا كان الضغط مخاطي ولا بيليه بسهولة، ريسوسبيند بيليه في تصل إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني أو الوسائط المتبقية. الخلايا الآن جاهزة للاستخدام.

4-إعداد التدرجات كثافة متقطع

ملاحظة: يرد وصف طريقة بديلة لإعداد التدرج من أسفل (أكثر تركيزاً) إلى الأعلى (الأقل تركيز) استخدام ماصة في الخطوة 7.

  1. ماصة 1 مل تمييع التدرج مخفف الأكثر كثافة في روبلين 5 مل الجولة أنبوب أسفل لتشكل طبقة أعلى، مخفف آخر، التدرج.
    ملاحظة:     سيتم إضافة الطبقات اللاحقة لتخفيف الانحدار أكثر تركيزاً أدناه هذه الطبقة باستخدام إبرة، حتى لا يؤدي إلى الإخلال بالطبقات. ينصح سنتين كحد أدنى وأقصى قدر من ثلاث طبقات متدرجة لكل 1 مل لقوى الانفصال والتصور سهلاً للبكتيريا.
    1. استخدام المحاقن القابل للصرف 1 مل بإبرة 1.5 بوصة المرفقة، أخذ 1 مل من القادم تتركز أكثر كثافة التدرج متوسطة تمييع في المحاقن. تجنب تناول أي من الهواء، كما يمكن تعطيل فقاعات طبقات متدرجة.
    2. ضع نهاية إبرة في الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على الطبقة الأولى. نضح محتويات حقنه ببطء شديد لتجنب الاختلاط في الواجهة.
      ملاحظة: سوف ترتفع واجهة لتخفيف اثنين كما هو إضافة تمييع التدرج أكثر تركيزاً. نلاحظ الواجهة بعقد تصل إلى الضوء أو خارج إطار. إذا لوحظ عدم وجود واجهة متميزة، تجاهل التدرج والبدء من جديد.
      1. إزالة الإبرة من التدرج بلطف جداً حتى لا يؤدي إلى الإخلال بالربط بين تخفيف الانحدار المختلفة. ضع الأنبوبة في رف مناسب ليبقيه منتصبا.
    3. إذا كان استخدام تخفيف ثلاثة مختلفة، كرر الخطوات 4.1.1–4.1.2.1 حيث يكون تمييع الأكثر كثافة في الجزء السفلي. إذا كان قد تم بنجاح إنشاء التدرج، سيكون هناك ثلاث طبقات متميزة مع لا خلط في الواجهات.

5-إضافة خلايا المعدة للتدرجات والفصل بالطرد المركزي

  1. إضافة 600 ميليلتر من خلايا المعدة من الخطوة 3، 3 إلى الأعلى من التدرج في الأنبوب ببطء شديد ودون خلط الواجهة، كما هو موضح في الخطوة 2، 2.
  2. ضع الأنابيب في محولات الأنبوبة وتزن محولات مجتمعة والأنابيب التأكد من أنها متوازنة.
    1. وضع محولات الأنبوبة في دوار زاوية ثابتة داخل مقاعد البدلاء-أعلى أجهزة الطرد مركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 3,000 س ز.
    2. بعد الطرد المركزي، بعناية إزالة الأنابيب ووضعها في رف مناسب، وتصوير النتائج كسجل.
  3. استرداد الكسور البكتيرية uronic حمض التقدير الكمي أو استخراج الحمض النووي عن طريق اتباع الخطوة 6.
    1. إذا كانت التطبيقات المتلقين للمعلومات غير مطلوبة، التخلص من العينات/التدرجات عبر مسار النفايات البيولوجية السائلة المناسبة في المختبر.
      ملاحظة: من المهم التحقق من الفصل للأنواع/سلالات جديدة من البكتيريا. كسور الفردية من التدرج ينبغي أن تدرسها مجهرية، بتحليل حمض uronic (الخطوة 8)، أو المقايسة الكمية مناسبة أخرى لتأكيد النمط الظاهري كبسولة من كل جزء. إذا كان الهدف فصل استناداً إلى التجميع أو حجم الخلية، ينبغي استخدام فحوصات مناسبة مستقلة.

6-استعادة عينة الكسور وثمرة الاختياري خطوة

  1. استرداد الكسور من تدرج عن طريق إزالة وتجاهل أي سائل من إضعاف أعلى إذا كان لا جزء البكتيرية غير موجود داخل تلك الطبقة.
    1. لإزالة الجزء العلوي، استخدام ماصة P200 لطف تمرير تلميح الماصة عن طريق التدرج للكسر، ويستغرق الكسر. مكان الكسر في أنبوب 1.5 مل والتسمية على نحو ملائم.
    2. لاسترداد كسور أخرى، لا تزال تستخدم ماصة P200، تضاف نصيحة بلطف من خلال التدرج للكسر واسترداد الكسر إلى أنبوب جديد 1.5 مل. إزالة الزائدة التدرج كالكسور السفلي أسفل التدرج اللوني يتم الوصول إليها.
    3. إذا كان استخراج الحمض النووي من جزء صغير يحتوي على أرقام الخلية منخفضة للغاية المطلوبة (على سبيل المثال، للكثافة--تراديسورت)، ثقافة فرعية الكسر باتباع البروتوكول من الخطوة 6.2 لثمرة اختيارية للحصول على المزيد من الخلايا.
      ملاحظة: سيكون هناك مستوى منخفض من المرحل من الخلايا في الجزء العلوي من التدرج في انخفاض الكسور، كالكسور يتم إزالتها من أعلى إلى أسفل. تصغير هذا العمل بعناية حتى لا يؤدي إلى خلط التدرج، باستخدام إبرة لإزالة الكسور أقل، وعن طريق إجراء إعادة تنقية العينات وفرة منخفضة جداً حيث المرحل قد تؤثر على النتائج.
  2. نقل الخلايا من الكسر منخفضة-وفرة تعافي في خطوات 6.1.1–6.1.2 في 5 مل من السائل من وسائط الإعلام المناسبة. وضع في حاضنة وتنمو ح 2 في 37 درجة مئوية.
    1. بعد 2 ساعة من النمو أو عندما وصلت العينة OD600 1، نقل الثقافة إلى أنبوب 15 مل. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في س 3,200 ز في أجهزة الطرد مركزي مع سوينغ الدلاء والأغطية ضيق الهباء الجوي. تجاهل المادة طافية
    2. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من 1 x PBS.
  3. إعداد تدرج طازجة واحد-تركز كثافة في أنبوب البولي بروبلين 5 مل. استخدام تركيز التدرج من فوق مكان الكسر في الانحدار الأصلي (على سبيل المثال، لتنقية متحولةسليا Δ هو مبين في الشكل 2د، ستستخدم نسبة 15% الكثافة المتوسطة التدرج).
    ملاحظة:     هذه الخطوة إعادة تنقية اختيارية.
    1. تطبيق الخلايا إلى الأعلى من التدرج وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوات 2.2 و 5.1.
    2. إزالة الأنابيب من أجهزة الطرد المركزي وطرأت رف مناسب. صورة التدرج واسترداد الكسر لاستخراج الحمض النووي كما هو موضح في 6.1 – 6.1.2.
      ملاحظة: النموذج جاهز الآن لاستخراج الحمض النووي أو التطبيقات الأخرى المتلقين للمعلومات.

7-أسلوب بديل لإعداد التدرج من أسفل (أكثر تركيزاً) إلى الأعلى (الأقل تركيز) استخدام ماصة

  1. استخدام تخفيف التدرج تحديد في الخطوة 2.2.3. استخدام ماصة ميليلتر 1,000، إضافة 1 مل تمييع التدرج الأكثر كثافة إلى أنبوب 5 مل.
    1. استخدام ماصة 200 ميليلتر، إضافة 200 ميليلتر لتمييع التدرج التالي كثيفة ببطء شديد إلى أعلى طبقة في الأنبوب، حتى لا يؤدي إلى خلط في الواجهة. إضافة آخر 200 ميليلتر وثم في النهائي 600 ميليلتر. إضافة عدة وحدات تخزين أصغر يعطي السيطرة على سرعة بيبيتينج أكثر ويمنع الاختلاط في الواجهة. إذا كانت الواجهة يمزج، تجاهل والبدء من جديد.
    2. كرر الخطوة 7.1.1 مع تركيز التدرج الثالث، الأقل كثافة إذا كان يجري استخدام تخفيف الثلاثة. الآن يجب أن يكون الأنبوب التدرجات مل 2 أو 3 مل تبعاً للنتائج التي تسفر عنها خطوة 2.2.3.
    3. انتقل إلى الخطوة 5 من البروتوكول لإضافة خلايا وتستمر التجربة.

8-قياس مقدار كبسولة بمقايسة حمض Uronic

  1. ضبط OD600 لكل جزء تم استردادها إلى 4.0 بتمييع مع برنامج تلفزيوني. المضي قدما في التحديد الكمي للأحماض uronic نشرت سابقا1.

Representative Results

وتظهر نتائج الممثل في الشكل 2. النتيجة بالضبط أن نتوقع سيتوقف على الأنواع البكتيرية، إنشاء التدرجات الكثافة، وما إذا كان المستخدم هو دراسة سلالة واحدة أو مجموعة من المسوخ. سيتم ترحيل معظم السلالات إلى موقع واحد ضمن تدرج، كما هو مبين في الشكل 2 ألف و 2D. تطبيق الطريقة إلى مكتبة متحولة بكتيرية سوف تؤدي إلى فرقة رئيسية أعلاه التدرج، عصابة أقل كثافة توزيعها عن طريق الطبقة العلوية من التدرج، وكسر أكابسولار طفيفة في الجزء السفلي (الشكل 2ب). تختلف هذه الكسور في كبسولة المبلغ كما هو موضح بفحص للأحماض أورونيك (الشكل 2ب). النتائج ينقول الإدراج تسلسل من كسور الفردية في الترجمة واضحة من طفرات محددة داخل مختلف الكسور التدرج، كما هو مبين على محور التركيب الحيوي كبسولة من ATCC43816 الرئوية ك. (الشكل 2-ج). نتائج تمثيلية لثقافات نقية الرئوية ك. نتوه-K2044 و الرئوية. س.، والتركيب الحيوي كبسولة مختلفة أو طفرات تنظيمية، مبينة في الشكل 2د.

Figure 1
الشكل 1 : التخطيطي أسلوب الطرد المركزي الكثافة لفصل البكتيريا على أساس كبسولة، وتطبيقاتها- (أ) صورة الميكروسكوب الإلكتروني capsulated الكلبسيله الرئوية الخلية. الكبسولة مرئياً كطبقة كثيفة على السطح الخارجي للخلية. (ب) تطبيقات كثافة استخدام الطرد المركزي للدراسة من البكتيريا كابسولاتيد. (Bi) يمكن استخدامها لإنشاء الكسور عالية ومنخفضة، ولا كبسولة من مكتبة متحولة ينقول كثافة الفصل وتليها ينقول الإدراج التسلسل لتحديد الجينات التي تؤثر على إنتاج كبسولة. (Bii) تنقية للبكتيريا كابسولاتيد من عينة معقدة. (بيي) استخدام الفصل القائم على كثافة لمقارنات سريعة كبسولة المبلغ بين العينات. يسمح هذا الأسلوب أيضا تصور إنتاج كبسولة المتباينين في سكان الجرثومي، كما هو مبين في (بيي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : نتائج الممثل. (أ) مثال للإخراج من اختبارات التدرج المصغر. اثنين مختلفة تم فصل سلالات K. الرئوية في 1 مل من 15% الكثافة المتوسطة التدرج. يتم الاحتفاظ هايبرموكوفيسكوس سلالة نتوه-K2044 فوق الطبقة المتوسطة الكثافة التدرج، حين ترتحل ATCC43816 (مما يجعل أقل كبسولة) إلى الجزء السفلي من الطبقة. (Bi) استخدام التدرج الكثافة لفصل مكتبة ينقول متحولة إلى ثلاثة كسور. علما بأن الكسر أسفل تحتوي على نسبة منخفضة من طفرات وهو غير مرئي على هذه الصورة. (Bii) التحقق من صحة المبالغ كبسولة مختلفة في الأعلى والأوسط، وكسور أسفل باستخدام مقايسة للأحماض أورونيك. خلايا من أسفل الأعلى والأوسط والمتضخمة الكسور كانت معزولة وحراكه في برنامج تلفزيوني ل التطوير التنظيمي600 4، ثم كبسولة السكريات المستخرجة والأحماض أورونيك قياس1. (ج) نتائج المثال الكثافة--تراديسورت. يتم عرض مواقع طفرة حددت بخطوط زرقاء فوق الرسم التخطيطي كروموسوم. ويمكن تحديد طفرات تفتقر إلى كبسولة كتلك التي تكون موجودة في مكتبة الإدخال ولكن تنضب في الأجزاء العليا بينما يجري التخصيب في الجزء السفلي، كما هو موضح هنا ل المكان الحيوي كبسولة8. (د) مثال لاستخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لمقارنة كمية كبسولة بين نوع البرية وسلالات متحولة الرئوية ك. نتوه-K2044 و الرئوية س. 23F. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

كبسولة عامل فوعة هامة في العديد من أنواع الجراثيم بما في ذلك الرئوية ك.3، العقدية الرئوية9و راكدة10والأنواع11 نيسريه. على الرغم من أن هناك أساليب مختلفة للقياس الكمي والتصور كبسولات البكتيرية، في الوقت الحاضر هناك أي أسلوب يستخدم على نطاق واسع لفصل الخلايا كابسولاتيد وغير كابسولاتيد جسديا. في هذه المقالة، قد أثبتنا وسيلة قوية للانفصال على أساس كبسولة سكان الجرثومي، مع العديد من التطبيقات المحتملة بالاقتران مع مختلف البروتوكولات المنبع أو المصب.

وجود كبسولة السطحية يمكن أن تقلل من كثافة الخلايا البكتيرية، التي تسمح بفصل بكثافة التدرج الطرد المركزي (الشكل 2د). ونحن قد التحقق من صحة هذا الأسلوب في الرئوية ك. نتوه-K204412 و ATCC4381613 فضلا عن العقدية الرئوية 23F14 وبه Δcps متحولة15. يستخدم هذا الأسلوب بيركول16 كما يمكن أن تكون المكونات الرئيسية للتدرج الكثافة، وهو تعليق جزيئات السليكا الغروية المغلفة له اللزوجة منخفضة ولا سمية تجاه البكتيريا-من حيث المبدأ، مواد أخرى تفي بهذه المعايير يستخدم لإنشاء التدرج الكثافة.

يمكن أن يكون تحديا لضمان أن لا تخلط طبقات مختلفة الكثافة عند بناء كثافة التدرجات، وإذا كان يحدث خلط، طريقة فصل لا تعطي النتائج نظيفة. أدرجنا اثنين من الأساليب البديلة لصب التدرجات، باستخدام إبرة أو ماصة – وكلاهما فعال، والطريقة التي يجب استخدامها هي ببساطة مسألة تفضيل. لجميع الخطوات التي تنطوي على بيبيتينج مادة (أما تعليق بكتيرية، أو طبقة تدرج أكثر مخفف) فوق طبقة متدرجة، بيبيتينج متعددة مختبرين من أحجام أصغر يمكن جعله أسهل لتحقيق واجهة حادة دون أي خلط الطبقات.

حد من هذا البروتوكول أنه لا يمكن ضمان أدائها مع غيرها من الأنواع البكتيرية. ولذلك، من الأهمية بمكان عند دراسة أحد الأنواع البكتيرية الجديدة أو سلالة للتحقق من صحة الفصل القائم على كثافة استخدام أسلوب التقدير الكمي كبسولة إضافية ومستقلة. تصور البكتيريا الموجودة في كل جزء من الفحص المجهري مع البقع كبسولة المناسبة هو أسلوب الموثوق بها التي هي بروتوكولات مفصلة متاحة17. بدلاً من ذلك، يمكن قياسها كمياً الكبسولات المحتوية على الأحماض أورونيك (مثل الإشريكيّة القولونية و الرئوية ك.) قبل مقايسة محددة كما هو مبين في الشكل 2ب1. اختبار موكوفيسكوسيتي المستندة إلى استخدام الطرد المركزي ليست مناسبة كأسلوب للتحقق مستقل، كما يعتمد هذا التحليل أيضا على كثافة الخلايا البكتيرية.

تقييد آخر لهذا الأسلوب هو أن إنتاج كبسولة حساسة جداً لظروف الثقافة، وحتى التغيرات الصغيرة إلى المتوسطة النمو، درجة الحرارة، أو تهوية قد تؤثر على نتائج هذا الفحص. وللحد من هذه المشكلة، الباحثين يمكن استخدام متوسط نمو محددة أو وسيلة معقدة دفعة متسقة وإبقاء كافة المعلمات الأخرى النمو متطابقة بين التجارب وتشمل سلالات المراقبة المناسبة لتمكين تفسير نتائج غير متوقعة . بعض كبسولات البكتيرية هشة ويمكن القص بعيداً عن الخلية عندما يتم بيبيتيد الثقافات. لتجنب إمالة كبسولات، ينبغي فصل الثقافات وحراكه ليس أكثر من مرتين أثناء التحضير للتحميل على التدرج. إذا كان فقدان الكبسولة أثناء تركيز الثقافات ما زالت إشكالية، الثقافات البكتيرية يمكن تطبيقها على تدرج كثافة مباشرة، مع حجم أكبر من تعليق البكتيرية وأضاف إذا لزم الأمر للتصور.

التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب يتم تطبيقها على الأنواع البكتيرية الأخرى، واستخدام هذا الفصل بالاقتران مع مختلف التكنولوجيات المنبع والمصب. بالإضافة إلى8من الكثافة--تراديسورت، فإننا نقترح أن كثافة الفصل التدرج من البكتيريا كابسولاتيد يمكن أن تستخدم لعزل طفرات مع كبسولة محوره، لتنقية الخلايا كابسولاتيد من الثقافات المختلطة أو العينات المعقدة، وعلى التنميط السريع لإنتاج كبسولة في سلالات متعددة. وأخيراً، يمكن استخدام هذه التكنولوجيا لدراسة أخرى تعمل البكتيرية مثل التجميع.

Disclosures

المؤلفين قد أية مصالح مالية الكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر وانغ جين-المدينة وسوزانا سولتر لتوريد السلالات، وأعضاء الفريق برخيل لإجراء مناقشات مفيدة. تم تمويل هذا العمل من معهد سانغر ويلكوم (منحة ويلكوم 206194)، والسير هنري ويلكوم زمالة ما بعد الدكتوراه إلى F.L.S. (منحة 106063/A/14/Z). ويدعم "سنهم دكتوراه معهد سانغر ويلكوم" M.J.D..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets Eppendorf 5810 718.007
Adapters for 15 mL tubes Eppendorf 5810 722.004
Fixed andgle rotor F-34-6-38 Eppendorf 5804 727.002
2.6 to 7 mL tube adapter Eppendorf 5804 739.000
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 Eppendorf 5424 000.460
2 mL tubes Eppendorf 0030 120.094
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086
5 mL polypropylene round bottom tube Falcon 352063
1 mL disposable syringe Luer slip Becton Dickinson 300013
AGANI Needle 21G Green x 1.5" Terumo AN 2138R1
P1000 pipette and tips
P200 pipette and tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Favre-Bonté, S., Licht, T. R., Forestier, C., Krogfelt, K. A. Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infection and Immunity. 67 (11), 6152-6156 (1999).
  2. Bachman, M. A., et al. Genome-wide identification of Klebsiella pneumoniae fitness genes during lung infection. mBio. 6 (3), 1-9 (2015).
  3. Paczosa, M. K., Mecsas, J. Klebsiella pneumoniae: Going on the offense with a strong defense. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. 80 (3), 629-661 (2016).
  4. Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., Russo, T. A. Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae. Virulence. 4 (2), 107-118 (2014).
  5. Fang, C. -T., Chuang, Y. -P., Shun, C. -T., Chang, S. -C., Wang, J. -T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae. strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. The Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 697-705 (2004).
  6. Lai, Y. -C., Peng, H. -L., Chang, H. -Y. RmpA2, an activator of capsule biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43, regulates K2 cps gene expression at the transcriptional level. Journal of Bacteriology. 185 (3), 788-800 (2003).
  7. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), 1-10 (2014).
  8. Dorman, M. J., Feltwell, T., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. The capsule regulatory network of Klebsiella pneumoniae defined by density-TraDISort. , (2018).
  9. Geno, K. A., et al. Pneumococcal capsules and their types: Past, present, and future. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 871-899 (2015).
  10. Weber, B. S., Harding, C. M., Feldman, M. F. Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond. Journal of Bacteriology. 1986 (6), 880-887 (2016).
  11. Mubaiwa, T. D., Semchenko, E. A., Hartley-Tassell, L. E., Day, C. J., Jennings, M. P., Seib, K. L. The sweet side of the pathogenic Neisseria.: The role of glycan interactions in colonisation and disease. Pathogens and Disease. 75 (5), 1-9 (2017).
  12. Wu, K. -M. M., et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiellapneumoniae. NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. Journal of Bacteriology. 191 (14), 4492-4501 (2009).
  13. Broberg, C. A., Wu, W., Cavalcoli, J. D., Miller, V. L., Bachman, M. A. Complete genome sequence of Klebsiellapneumoniae. Strain ATCC 43816 KPPR1, a rifampin-resistant mutant commonly used in animal, genetic, and molecular biology studies. Genome Announcements. 2 (5), (2014).
  14. Croucher, N. J., et al. Role of conjugative elements in the evolution of the multidrug-resistant pandemic clone Streptococcuspneumoniae Spain23F ST81. Journal of Bacteriology. 191 (5), 1480-1489 (2009).
  15. Croucher, N. J., et al. Selective and genetic constraints on Pneumococcal serotype switching. PLoS Genetics. 11 (3), 1-21 (2015).
  16. Pertoft, H., et al. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  17. Breakwell, D. P., Moyes, R. B., Reynolds, J. Differential staining of bacteria: Capsule stain. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), 1-4 (2009).

Tags

علم الوراثة، العدد 143، متقطع الكثافة المتدرجة، كبسولة، تراديس، هايبرموكويدي، الكلبسيله
فصل البكتيريا بمقدار كبسولة استخدام تدرج كثافة متقطع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feltwell, T., Dorman, M. J.,… More

Feltwell, T., Dorman, M. J., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient. J. Vis. Exp. (143), e58679, doi:10.3791/58679 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter