Summary
We tonen het gebruik van niet-aaneengesloten dichtheid verlopen te onderscheiden bacteriële populaties op basis van capsule productie. Deze methode wordt gebruikt capsule bedrag tussen culturen vergelijken, mutanten met een specifieke capsule fenotype te isoleren, of capsule regelgevers te identificeren. Hier beschreven is de optimalisatie en de werking van de bepaling.
Abstract
Capsule is een belangrijke virulentiefactor in veel bacteriesoorten, bemiddelen immuun belastingontduiking en resistentie tegen verschillende fysieke benadrukt. Terwijl vele methoden beschikbaar te kwantificeren en capsule productie tussen verschillende stammen of mutanten te vergelijken zijn, er is geen gebruikte methode voor het sorteren van bacteriën gebaseerd op hoeveel capsule die zij produceren. We hebben een methode ontwikkeld om bacteriën scheiden door capsule bedrag, met behulp van een discontinue dichtheid verloop. Deze methode wordt gebruikt om capsule hoeveelheden semi-kwantitatief tussen culturen, mutanten met gewijzigde capsule productie isoleren en zuiveren van ingekapselde bacteriën van complexe monsters te vergelijken. Deze methode kan ook worden gekoppeld aan transposon-invoeging rangschikken om genen die betrokken zijn bij de capsule verordening te identificeren. De methode blijkt zich hier, in detail, met inbegrip van het optimaliseren van de helling, mits het voor een nieuwe bacteriesoorten of spanning, en het samenstellen en uitvoeren van het verloop van de dichtheid.
Introduction
Veel bacteriesoorten produceren een polysaccharide capsule, die de bacteriële cel van verschillende fysieke stress en naar erkenning en doden door het immuunsysteem beschermt. In Klebsiella pneumoniaeis capsule productie een absolute vereiste voor infectie1,2. K. pneumoniae capsule bemiddelt resistentie tegen antimicrobiële peptiden, weerstand tegen aanvulling-bemiddelde doden, het voorkomen van fagocytose, en onderdrukking van de ingeboren immune reactie3. Capsule overproductie wordt geassocieerd met verhoogde virulentie en Gemeenschap opgelopen (in plaats van nosocomiale) infecties4.
Een aantal kwantitatieve en kwalitatieve tests zijn beschikbaar voor het onderzoeken van de capsule productie. Voor Klebsiella soorten hierbij de tekenreeks test5, waarin een tandenstoker aangeraakt naar een kolonie naar boven wordt getrokken en de lengte van de tekenreeks die gemeten, en de mucoviscosity assay6, waarbij de langzame centrifugeren van een cultuur die wordt gevolgd door het meten van de extinctie van de bovendrijvende substantie. Deze methoden zijn eenvoudig en snel, maar gebrek aan gevoeligheid bij gebruik op klassieke Klebsiella stammen in plaats van de capsule doormaken stammen. Een andere methode voor de kwantificering van de capsule is de zure test van uronic, die is technisch uitdagende en vereist het gebruik van geconcentreerd zwavelzuur1. Tenslotte is de capsule direct door microscopie (figuur 1A) zichtbaar. Van deze methoden alleen microscopie kan de gebruiker verschillende capsulation Staten in het kader van een enkele populatie observeren, en geen van deze methoden kunnen de fysieke scheiding van ingekapselde en niet-ingekapselde bacteriën.
Dichtheid gebaseerde scheidingen door kleurovergang centrifugeren worden routinematig gebruikt in de celbiologie te zuiveren van andere eukaryotische cel typen7, maar worden zelden gebruikt in microbiologisch onderzoek. De mucoviscosity assay voor Klebsiella is gebaseerd op de observatie dat zeer ingekapselde bacteriën meer tijd vergen te pellet door middel van centrifugeren, en we redeneerde dat dit veroorzaakt door verminderde totale dichtheid van ingekapselde cellen worden kan. De methode hieronder werd ontwikkeld om te onderscheiden K. pneumoniae populaties fysiek door capsule bedrag, met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren (Figuur 1). Deze methode werd met succes toegepast op Streptococcus pneumoniae, die aangeeft dat het geldt voor andere bacteriesoorten. Dichtheid-verloop scheiding van een verzadigde transposon mutant bibliotheek gekoppeld transposon-invoeging sequencing (dichtheid-TraDISort) is gebruikt om genen die betrokken zijn bij de capsule productie en verordening8te identificeren. Ook deze methode werd gebruikt in combinatie met willekeurige-prime polymerase-kettingreactie (PCR) van afzonderlijke kolonies te isoleren van de niet-ingekapselde K. pneumoniae mutanten. Deze methode kan ook worden gebruikt voor snelle vergelijkingen van de capsule productie tussen verschillende bevolkingsgroepen en voorwaarden, of aan het zuiveren van de ingekapselde bacteriën van complexe monsters (figuur 1B). Ten slotte is er de optie om andere fenotypen die invloed hebben op dichtheid, zoals de celgrootte of aggregatie assay.
Dit manuscript laat zien hoe het optimaliseren van de procedure voor een nieuwe bacteriesoorten of stam en toont de bouw en de werking van een discontinue dichtheid verloop te scheiden van de hyper-ingekapselde, ingekapselde en niet-ingekapselde bacteriën.
Protocol
Opmerking: Ervoor zorgen dat een toepassing op de bacteriestammen risicobeoordelingen worden nageleefd wanneer kweken en de behandeling van de monsters. Wees ervan bewust dat teveel hellingen in één keer instellen kan leiden tot spier-en skeletaandoeningen als gevolg van de druk op de gewrichten van de langzame pipetteren betrokken. Werk plannen en voorzorgsmaatregelen te nemen om schade te voorkomen.
1. bereiding van de bacteriestammen of Mutant bibliotheken
-
Streak uit de stammen worden getest op juiste agar platen. Dit zijn de voorraad platen voor het experiment.
- Incubeer de platen 's nachts op de gewenste temperatuur te bereiken één kolonies. Voor dit experiment, cultuur K. pneumoniae (NTUH-K2044 en ATCC43816-stammen) op Luria Bouillon (LB) agar bij 37 ° C, en S. pneumoniae (23F wild type en 23F Δcps) op bloed agar in een pot bevochtigde kaars bij 37 ° C.
-
Kies een één kolonie van een voorraad plaat (stap 1.1) om te enten 10 mL passende bouillon met behulp van een steriele lus of cocktail stick. Inoculeer voor screening van willekeurige mutant Bibliotheken, de bouillon met 10 µL van de willekeurige mutant bibliotheek voorraad (TraDIS Library).
- Incubeer K. pneumoniae stammen in de lage zout LB-media bij 37 ° C met schudden, en S. pneumoniae stammen in hersenen hart infusie (BHI) media, statisch bij 37 ° C.
- De overnachting cultuur overbrengen in een tube van 15 mL en centrifuge in een bench-top centrifuge voor 10 min bij 3200 x g in gang uit emmers met 15 mL tube inzetstukken en aërosol strakke deksels.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Opmerking: Beschikken over supernatant via de passende vloeibare biologische afval weg in het laboratorium. Het doel van de stappen van het centrifugeren en resuspensie (1.2.2 en 1.2.3) is te concentreren van de bacteriën voor eenvoudige visualisatie op de helling. Bacteriële culturen kunnen direct op het verloop worden geladen als de voorkeur. Zwaar ingekapselde stammen kunnen niet vormen een strakke pellet. Als dit het geval is, Verwijder zoveel supernatant mogelijk zonder het verwijderen van eventuele bacteriële cellen, 1 x PBS toevoegen aan een eindvolume van 5 mL en resuspendeer de pellet. Het protocol met stap 1.2.5 blijven. - Voor niet-slijmachtig stammen, gaat u naar stap 2.
- Centrifugeer de buizen zoals beschreven in stap 1.2.2.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver 1 x PBS. Cellen zijn nu klaar voor gebruik.
Opmerking: De dichtheid van de bacteriële celsuspensie is niet kritisch, maar moet volstaan voor visualisatie in het verloop. Een minimale OD600 (optische dichtheid bij 600 nm) van 4 is gesuggereerd.
2. voorbereiding van de kleurovergang verdunningen en mini verloop Test
-
Maak kleurovergang verdunningen.
Opmerking: Exacte concentratie van kleurovergang medium dichtheid (bvPercoll) die in de dichtheid verlopen nodig zijn om goede scheiding zal verschillen naar gelang van de bacteriële stam en groei omstandigheden gebruikt. Mini verloop tests worden eerst uitgevoerd ter identificatie van de concentraties die de beste scheiding zal geven. Deze omvatten 500 µL van een enkelvoudige verdunning in een tube van 2 mL. Als bacteriën worden geëxtraheerd uit het verloop en voor downstream toepassingen overgeënt, moeten deze stappen worden uitgevoerd onder aseptische condities.- Kleurovergang medium dichtheid combineren met 1 x PBS te maken van de dichtheid kleurovergang verdunningen. Verdunningen van 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% en 80% maken (bijvoorbeeld, 2 mL dichtheid kleurovergang medium plus 8 mL 1 x PBS = 10 mL 20% dichtheid kleurovergang voedingsbodem).
- Aliquot 500 µL van de kleurovergang verdunning van 20% in een tube 2 mL voor elke stam te beproeven (b.v., 4 stammen = 4 buizen met 500 µL van 20% kleurovergang verdunning).
- Herhaal stap 2.1.2 voor de rest van de kleurovergang verdunningen.
-
Toepassing bacteriën op het verloop.
- Breng 100 µL van bacteriecellen bereid in stappen 1.2.3 en 1.2.6 naar de top van elke kleurovergang verdunning de onderstaande stappen.
- Neem tot 100 µL van cellen met behulp van een precisiepipet µL 200 en plaats het uiteinde van de pipet aan de kant van de buis net onder de meniscus van het mini verloop.
- De bacteriecellen op het verloop zeer langzaam worden gecombineerd zodat ze een laag op de bovenkant van de helling, vormen zonder enige mengen van de interface.
- Herhaal de stappen 2.2.1.1–2.2.1.2 voor alle stammen te beproeven.
- Met behulp van een vaste hoek rotor met een aërosol strakke deksel, de bereid buizen in een microcentrifuge voor 10 min bij 8.000 x gcentrifugeren.
- Na het centrifugeren, door de buizen te overbrengen in een rack te visualiseren de minimale helling verdunning moet behouden cellen net boven de gradiënt laag na centrifugeren.
- Als de resultaten niet duidelijk zijn, herhaal de test van de mini verloop met stappen van 5% dichtheid kleurovergang middellange verdunningen hierboven en hieronder de concentraties gedefinieerd stap 2.1.1 (b.v., 25% en 35% verdunningen moeten worden getest als het resultaat van 30% niet eenduidig is).
Opmerking: Zie Figuur 2voor typische resultaten bij een enkele dichtheid kleurovergang middellange verdunning . - Gebruik de resultaten van de stappen 2.2.3–2.2.4 om te bepalen van de ideale kleurovergang verdunningen te gebruiken om te scheiden van de cellen in grotere discontinue verlopen.
- Breng 100 µL van bacteriecellen bereid in stappen 1.2.3 en 1.2.6 naar de top van elke kleurovergang verdunning de onderstaande stappen.
3. voorbereiding van de cellen voor de belangrijkste Experiment
-
Bereiden van verse overnachting culturen door het enten van 10 mL van de passende Bouillon, zoals beschreven in stap 1,2.
- Incubeer de culturen 's nachts onder geschikte omstandigheden zoals beschreven in stap 1.2.1.
- Pellet de overnachting cultuur zoals beschreven in stap 1.2.2.
- Wassen de cellen zoals beschreven in stap 1.2.3.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL 1 x PBS. Als de spanning slijmachtig is en doet niet gemakkelijk pellet, resuspendeer de pellet in maximaal 2 mL PBS of residuele media. Cellen zijn nu klaar voor gebruik.
4. voorbereiding van de discontinue dichtheid verlopen
Opmerking: Een alternatieve methode voor de bereiding van de gradiënt vanaf onderkant (meest geconcentreerd) naar boven (minste geconcentreerd) met behulp van een precisiepipet wordt beschreven in stap 7.
-
Pipet 1 mL van de meest verdunde kleurovergang verdunning van de dichtheid in een 5 mL-polypropyleen ronde onderkant buis te vormen van de hoogste, meest verdunde, laag van het verloop.
Opmerking: opeenvolgende lagen van geconcentreerder kleurovergang verdunningen worden toegevoegd onder deze laag met behulp van een naald, dus niet te verstoren de lagen. Minimaal twee en maximaal drie kleurovergang lagen van elk 1 mL worden aanbevolen voor robuuste scheiding en eenvoudige visualisatie van bacteriën.- Met een 1 mL wegwerp injectiespuit met een naald van 1,5 inch aangesloten, neem 1 mL van de volgende meest geconcentreerde dichtheid kleurovergang middellange verdunning in de spuit. Vermijd innemen lucht, zoals bubbels de kleurovergang lagen kunnen verstoren.
- Plaats het einde van de nld aan de onderkant van de buis met de eerste laag. De inhoud van de injectiespuit zeer langzaam gecombineerd om te voorkomen dat het mengen van de interface.
Opmerking: De interface van de twee verdunningen zal stijgen als de geconcentreerder kleurovergang verdunning wordt toegevoegd. Observeer de interface positie houden tot licht of een buiten-venster. Indien geen duidelijke interface wordt waargenomen, het negeren van het verloop en start opnieuw.- Verwijder de naald uit het verloop zeer voorzichtig om niet te storen van de interface tussen de verschillende kleurovergang verdunningen. Plaats de buis in een geschikt rek te rechtop houden.
- Als met behulp van drie verschillende verdunningen, herhaalt u stappen 4.1.1–4.1.2.1 zodat de dichtste verdunning onderaan is. Als het verloop is opgebouwd, zullen er drie verschillende lagen met geen mengen op de interfaces.
5. toevoegen bereid cellen te verlopen en scheiding door centrifugeren
- Voeg 600 µL van bereid cellen uit stap 3.3 naar de top van het verloop in de buis erg traag en zonder het mengen van de interface, zoals beschreven in stap 2.2.
-
Plaatsen van de buizen in de buis adapters en weegt de gecombineerde adapters en buizen om ervoor te zorgen dat zij evenwichtig zijn.
- Plaats de buis adapters in de rotor van een vaste hoek binnen een bank-top centrifuge. Centrifugeer gedurende 30 minuten op 3000 x g.
- Na het centrifugeren, zorgvuldig verwijderen van de buizen, plaats ze in een geschikt rek, en fotograferen van de resultaten als een record.
-
Herstellen van de bacteriële breuken voor uronic zuur kwantificering of DNA-extractie door het volgen van stap 6.
- Als downstream toepassingen niet vereist zijn, beschikken over de monsters/verlopen via de passende vloeibare biologische afval weg in het laboratorium.
Opmerking: Het is belangrijk voor het valideren van de scheiding voor nieuwe soorten/stammen van bacteriën. Individuele breuken uit het verloop moeten worden onderzocht door microscopie, door uronic acid test (stap 8), of een andere geschikte kwantitatieve test om te bevestigen de capsule fenotype van elke fractie. Als het doel is om te scheiden op basis van aggregatie of celgrootte, moeten onafhankelijke passende tests worden gebruikt.
- Als downstream toepassingen niet vereist zijn, beschikken over de monsters/verlopen via de passende vloeibare biologische afval weg in het laboratorium.
6. herstellen monster breuken en optionele uitgroei stap
-
Herstellen de breuken uit een verloop verwijderen en teruggooi van elke vloeistof uit de hoogste verdunning als geen bacteriële Fractie ontbreekt niet in die laag.
- Als wilt verwijderen van het bovenste gedeelte, gebruiken een P200 pipet zachtjes passeren de pipet tip via het verloop op de breuk en oppakken van de breuk. Plaats van de breuk in een tube van 1,5 mL en label op de juiste manier.
- Om te herstellen van verdere fracties, nog steeds met behulp van de P200 Pipet, invoegen de tip zachtjes door het verloop op de breuk en de breuk tot een verse 1,5 mL koker te herstellen. Verwijder overtollige verloop zoals de breuken lager in het verloop worden benaderd.
- Als DNA-extractie uit een breuk met zeer lage cel nummers vereist (bv. voor dichtheid-TraDISort), subcultuur de Fractie is door het protocol te volgen vanaf stap 6.2 voor optionele uitgroei te verkrijgen meer cellen.
Opmerking: Er zullen een laag niveau van overdracht van cellen aan de bovenkant van het verloop in lagere breuken, zoals breuken zijn verwijderd van boven naar beneden. Dit te minimaliseren door het zorgvuldig werken om niet het verloop, Meng door met een naald te verwijderen van lagere breuken, en door het uitvoeren van re-zuivering van zeer lage overvloed monsters waar de overdracht van invloed kan zijn op de resultaten.
-
De cellen van de overdracht van de Fractie van de lage-overvloed teruggevonden in stappen 6.1.1–6.1.2 in 5 mL van de passende vloeibare media. Plaats in een incubator en groeien gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Na 2 uur van groei of wanneer het monster een OD600 1 heeft bereikt, door de cultuur te overbrengen in een tube van 15 mL. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 3200 x g in een centrifuge met schommel emmers en aërosol strakke deksels. Verwijder het supernatant
- Resuspendeer de cel pellet in 1 mL 1 x PBS.
-
Voorbereiding van een verse single-concentratie dichtheid verloop in een polypropyleen tube van 5 mL. Gebruik de kleurovergang concentratie van net boven de locatie van de breuk in het oorspronkelijke verloop (bv. voor zuivering van de ΔslyA mutant afgebeeld in Figuur 2D, 15% dichtheid kleurovergang medium zou worden gebruikt).
Opmerking: deze re-zuivering stap is optioneel.- De cellen toepassen op de bovenkant van de kleurovergang en centrifuge zoals beschreven in stappen 2.2 en 5.1.
- Verwijder de buizen van de centrifuge en plaats in een passende rek. Foto van het verloop en de breuk voor DNA-extractie zoals beschreven in 6.1 – 6.1.2 te herstellen.
Opmerking: Het monster is nu klaar voor DNA-extractie of andere downstream toepassingen.
7. alternatieve methode voor de voorbereiding van de gradiënt vanaf onderkant (meest geconcentreerd) naar boven (minste geconcentreerd) met behulp van een precisiepipet
-
Gebruik de kleurovergang verdunningen in stap 2.2.3 vastgesteld. Met behulp van een precisiepipet µL 1.000, 1 mL van de dichtste kleurovergang verdunning aan een tube van 5 mL toevoegen.
- Met behulp van een pipet 200 µL, voeg 200 µL van de volgende dichte kleurovergang verdunning zeer langzaam naar de top van de laag in de buis, dus niet te mengen van de interface. Voeg een andere 200 µL en vervolgens de laatste 600 µL. meerdere kleinere volumes geeft meer controle over pipetting snelheid en voorkomt vermenging van de interface toe te voegen. Als de interface mixen, verwijderen en opnieuw te beginnen.
- Herhaal stap 7.1.1 met de derde, minste dichte concentratie van kleurovergang als drie verdunningen worden gebruikt. Nu moeten de buis gradiënten van 2 mL of 3 mL afhankelijk van de resultaten van stap 2.2.3.
- Ga naar stap 5 van het protocol aan cellen toevoegen en voortzetten van het experiment.
8. meting van de Capsule bedrag door Uronic Acid Test
- De OD-600 van elke herstelde breuk naar 4.0 aanpassen door verdunning met PBS. Ga verder met de kwantificering van uronic zuren als eerder gepubliceerde1.
Representative Results
Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 2. Het exacte resultaat te verwachten zal afhangen van de bacteriële soorten, de opzet van de dichtheid verlopen, en of de gebruiker een single strain of in een groep van mutanten bestudeert. De meeste stammen zal migreren naar één locatie binnen een verloop, zoals weergegeven in figuur 2A en 2D. Methode toepast op een bacteriële mutant bibliotheek zal aanleiding geven tot een grote band boven de helling, een minder dichte band gedistribueerd via de bovenste laag van het verloop, en een deel van de kleine acapsular onderaan (Figuur 2B). Deze fracties verschillen in capsule bedrag, zoals blijkt uit een onderzoek van uronic zuren (Figuur 2B). Transposon invoeging sequentiebepaling van individuele fracties resulteert in duidelijke lokalisatie van specifieke mutanten binnen verschillende kleurovergang breuken, zoals voor de capsule biosynthese locus van K. pneumoniae ATCC43816 (Figuur 2C). Representatieve resultaten voor reinculturen van K. pneumoniae NTUH-K2044 en S. pneumoniae, en verschillende capsule biosynthese of regelgevende mutanten, worden weergegeven in Figuur 2D.
Figuur 1 : Schematische van de dichtheid centrifugeren methode om te scheiden van de bacteriën op basis van de capsule, en haar toepassingen. (A) een elektronenmicroscopie beeld van een ingekapselde Klebsiella pneumoniae -cel. De capsule is zichtbaar als een dichte laag aan de buitenkant van de cel. (B) toepassingen van centrifugeren van de dichtheid aan de studie van ingekapselde bacteriën. (Bi) Dichtheid scheiding kan worden gebruikt voor het genereren van hoog-, laag- en neen-capsule breuken van een transposon mutant bibliotheek en gevolgd door sequentiebepaling van transposon invoeging definiëren van genen die van invloed zijn capsule productie. (Bii) Zuivering van ingekapselde bacteriën uit een complexe monster. (Biii) Gebruik van dichtheid gebaseerde scheiding voor snelle vergelijkingen van capsule bedrag tussen de monsters. Deze methode kan ook de visualisatie van heterogene capsule productie in bacteriële populaties, zoals in (Biii). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatieve resultaten. (A) voorbeeld van de output van Mini verloop proeven. Twee verschillende K. pneumoniae stammen waren gecentrifugeerd op 1 mL 15% dichtheid kleurovergang voedingsbodem. De hypermucoviscous NTUH-K2044 stam behouden boven de kleurovergang middellange laag dichtheid, en ATCC43816 (waardoor minder capsule) naar de onderkant van de laag migreert. (Bi) Gebruik van een verloop van de dichtheid kan worden gescheiden van een transposon mutant bibliotheek in drie fracties. Merk op dat het onderste deel een geringe aantal mutanten bevat en niet zichtbaar op deze foto is. (Bii) Validatie van verschillende capsule bedragen in de boven-, Midden- en fracties van de bodem met behulp van een test voor uronic zuren. Cellen uit de onderkant van het bovenste, middelste en ontgroeid breuken waren geïsoleerd en geresuspendeerde in PBS op een OD600 van 4, vervolgens capsule polysacchariden uitgepakt en uronic zuren gemeten1. (C) voorbeeld dichtheid-TraDISort resultaten. Mutatie locaties geïdentificeerd worden weergegeven door de blauwe lijnen boven het chromosoom-diagram. Mutanten ontbreekt capsule kunnen worden geïdentificeerd als degenen die aanwezig zijn in de input bibliotheek maar zijn uitgeput in het bovenste gedeelte terwijl wordt verrijkt in de Fractie van de bodem, zoals hier wordt weergegeven voor de capsule biosynthese locus8. (D) een voorbeeld van het gebruik van de kleurovergang centrifugeren dichtheid te vergelijken capsule bedrag tussen wild type en gemuteerde stammen van K. pneumoniae NTUH-K2044 en S. pneumoniae 23F. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Capsule is een belangrijke virulentiefactor in veel bacteriesoorten en K. pneumoniae3, Streptococcus pneumoniae9, immunodeficientie10, Neisseria11 soorten. Hoewel er verschillende methodes bestaan voor kwantificering en visualisatie van bacteriële capsules, is er op dit moment geen gebruikte methode om fysiek gescheiden ingekapselde en niet-ingekapselde cellen. In dit artikel, hebben wij aangetoond een robuuste methode voor capsule gebaseerde scheiding van bacteriële populaties, met meerdere mogelijke toepassingen in combinatie met verschillende stroomopwaarts of stroomafwaarts protocollen.
De aanwezigheid van een oppervlakte capsule kan verminderen bacteriële celdichtheid, waarmee de scheiding door dichtheid kleurovergang centrifugeren (Figuur 2D). We hebben deze methode in K. pneumoniae NTUH-K204412 en13 van de ATCC43816 evenals in Streptococcus pneumoniae 23F14 en haar Δcps mutant15gevalideerd. Deze methode gebruikt Percoll16 als de belangrijkste bestanddeel van het verloop van de dichtheid, die is een suspensie van gecoate Coloïdale siliciumdioxide deeltjes die lage viscositeit en geen toxiciteit ten aanzien van de bacteriën - in principe heeft andere stoffen die aan deze criteria voldoen zou kunnen zijn gebruikt om het verloop van de dichtheid.
Het kan zijn uitdagend om te zorgen dat de lagen van verschillende dichtheid Meng geen wanneer het construeren van dichtheid verlopen, en als mengen voordoet zich, de methode van scheiding niet schoon resultaten zal geven. We hebben twee alternatieve methoden voor het gieten van de hellingen, opgenomen met behulp van een naald of een pipet — zowel effectief zijn, en welke methode te gebruiken is gewoon een kwestie van voorkeur. Voor alle maatregelen die betrekking hebben op een stof (een bacteriële suspensie, of een meer verdund gradiënt laag) boven een gradiënt laag pipetteren, kunt pipetting meerdere aliquots van kleinere volumes u gemakkelijker om een sterke interface zonder enige mengen lagen.
Een beperking van dit protocol is dat zijn prestaties met andere bacteriesoorten kan niet worden gegarandeerd. Dus, het is cruciaal bij het onderzoek van een nieuwe bacteriesoorten of spanning voor het valideren van de dichtheid gebaseerde scheiding met behulp van een extra, onafhankelijke capsule kwantificering methode. Visualiseren van de bacteriën aanwezig in iedere fractie door microscopie met passende capsule vlekken is een betrouwbare methode waarvoor gedetailleerde protocollen beschikbaar17 zijn. U kunt ook kunnen capsules met uronic zuren (zoals die van Escherichia coli en K. pneumoniae) worden gekwantificeerd door een specifieke bepaling zoals weergegeven in Figuur 2B1. De centrifugeren gebaseerde mucoviscosity-test is niet geschikt als een onafhankelijke validatiemethode wordt gebruikt die, zoals deze bepaling hangt ook af van de dichtheid van de bacteriecellen.
Een andere beperking van deze methode is dat de productie van de capsule zeer gevoelig voor kweekomstandigheden, en zelfs kleine aanpassingen aan groeimedium, temperatuur is, of beluchting van invloed kan zijn op de resultaten van deze test. Om dit probleem te minimaliseren, onderzoekers kunnen een gedefinieerde groeimedium of een batch-consistent complex medium gebruikt, houden alle andere groeiparameters identiek tussen experimenten en passende controlemaatregelen stammen zodat de interpretatie van onverwachte resultaten . Sommige bacteriële capsules zijn kwetsbaar en ergens buiten de cel kunnen schuintrekken wanneer culturen zijn afgepipetteerde. Om te voorkomen dat het afsnijden van capsules, moeten culturen worden gecentrifugeerd en geresuspendeerde niet meer dan tweemaal tijdens de voorbereiding voor het laden op de helling. Als het verlies van de capsule tijdens de concentratie van de culturen blijft problematisch, bacteriële culturen kunnen worden toegepast op een dichtheid verloop rechtstreeks, met een groter volume van bacteriële suspensie toegevoegd indien nodig voor visualisatie.
Toekomstige toepassingen van deze methode zijn toe te passen op andere bacteriesoorten, en het gebruik van deze scheiding in combinatie met verschillende technologieën van de upstream- en downstream. Naast dichtheid-TraDISort8, is het raadzaam dat de dichtheid verlopende scheiding van ingekapselde bacteriën kan worden gebruikt voor isolatie van mutanten met gewijzigde capsule, voor zuivering van ingekapselde cellen uit gemengde culturen of complexe monsters, en voor snelle profilering van capsule productie bij meerdere stammen. Ten slotte, deze technologie kan worden gebruikt om te onderzoeken van andere bacteriële fenotypen zoals aggregatie.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële belangen openbaar te maken.
Acknowledgments
Wij danken Wang Jin-Town en Susannah Salter voor levering van virusstammen, en leden van de groep van de Parkhill voor nuttige discussies. Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Sanger Instituut (Wellcome grant 206194), en door een Sir Henry Wellcome postdoctoral fellowship aan F.L.S. (grant 106063/A/14/Z). M.J.D. wordt ondersteund door een Wellcome Sanger Instituut PhD studententijd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets | Eppendorf | 5810 718.007 | |
| Adapters for 15 mL tubes | Eppendorf | 5810 722.004 | |
| Fixed andgle rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5804 727.002 | |
| 2.6 to 7 mL tube adapter | Eppendorf | 5804 739.000 | |
| Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 | Eppendorf | 5424 000.460 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| 1 mL disposable syringe Luer slip | Becton Dickinson | 300013 | |
| AGANI Needle 21G Green x 1.5" | Terumo | AN 2138R1 | |
| P1000 pipette and tips | |||
| P200 pipette and tips |
References
- Favre-Bonté, S., Licht, T. R., Forestier, C., Krogfelt, K. A. Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infection and Immunity. 67 (11), 6152-6156 (1999).
- Bachman, M. A., et al. Genome-wide identification of Klebsiella pneumoniae fitness genes during lung infection. mBio. 6 (3), 1-9 (2015).
- Paczosa, M. K., Mecsas, J. Klebsiella pneumoniae: Going on the offense with a strong defense. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. 80 (3), 629-661 (2016).
- Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., Russo, T. A.
- Fang, C. -T., Chuang, Y. -P., Shun, C. -T., Chang, S. -C., Wang, J. -T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae. strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. The Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 697-705 (2004).
- Lai, Y. -C., Peng, H. -L., Chang, H. -Y. RmpA2, an activator of capsule biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43, regulates K2 cps gene expression at the transcriptional level. Journal of Bacteriology. 185 (3), 788-800 (2003).
- Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), 1-10 (2014).
- Dorman, M. J., Feltwell, T., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. The capsule regulatory network of Klebsiella pneumoniae defined by density-TraDISort. , (2018).
- Geno, K. A., et al. Pneumococcal capsules and their types: Past, present, and future. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 871-899 (2015).
- Weber, B. S., Harding, C. M., Feldman, M. F. Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond. Journal of Bacteriology. 1986 (6), 880-887 (2016).
- Mubaiwa, T. D., Semchenko, E. A., Hartley-Tassell, L. E., Day, C. J., Jennings, M. P., Seib, K. L. The sweet side of the pathogenic Neisseria.: The role of glycan interactions in colonisation and disease. Pathogens and Disease. 75 (5), 1-9 (2017).
- Wu, K. -M. M., et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiellapneumoniae. NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. Journal of Bacteriology. 191 (14), 4492-4501 (2009).
- Broberg, C. A., Wu, W., Cavalcoli, J. D., Miller, V. L., Bachman, M. A. Complete genome sequence of Klebsiellapneumoniae. Strain ATCC 43816 KPPR1, a rifampin-resistant mutant commonly used in animal, genetic, and molecular biology studies. Genome Announcements. 2 (5), (2014).
- Croucher, N. J., et al. Role of conjugative elements in the evolution of the multidrug-resistant pandemic clone Streptococcuspneumoniae Spain23F ST81. Journal of Bacteriology. 191 (5), 1480-1489 (2009).
- Croucher, N. J., et al. Selective and genetic constraints on Pneumococcal serotype switching. PLoS Genetics. 11 (3), 1-21 (2015).
- Pertoft, H., et al. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Breakwell, D. P., Moyes, R. B., Reynolds, J. Differential staining of bacteria: Capsule stain. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), 1-4 (2009).
