Summary
Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Vorbereitung einer Kokultur von Kryptokokkenzellen und Amöben, die mit Standbildern, fluoreszierenden Bildern und hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopbildern untersucht wird. Hier wird veranschaulicht, wie quantitative Daten solche qualitativen Informationen ergänzen können.
Abstract
Um eine Cryptococcus-Infektion zu simulieren, kann Amöbe, das natürliche Raubtier von Kryptokokkenzellen in der Umgebung, als Modell für Makrophagen verwendet werden. Dieser räuberische Organismus, ähnlich wie Makrophagen, verwendet Phagozytose, um verinnerlichte Zellen abzutöten. Mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops werden Bilder erfasst, die interaktive Momente zwischen Kryptokokkenzellen und Amöben darstellen. Die Auflösungskraft des Elektronenmikroskops hilft auch, die ultrastrukturellen Details von Kryptokokkenzellen zu enthüllen, wenn sie im Amöben-Lebensmittelvakuum gefangen sind. Da Phagozytose ein kontinuierlicher Prozess ist, werden quantitative Daten in die Analyse integriert, um zu erklären, was zum Zeitpunkt der Erfassung eines Bildes geschieht. Um genau zu sein, werden relative Fluoreszenzeinheiten gelesen, um die Effizienz von Amöben bei der Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu quantifizieren. Zu diesem Zweck werden Kryptokokkenzellen mit einem Farbstoff gefärbt, der sie fluoreszieren lässt, sobald sie in der sauren Umgebung des Nahrungsvakuums gefangen sind. Wenn sie zusammen verwendet werden, können Informationen, die durch solche Techniken gesammelt werden, wichtige Informationen liefern, um Schlussfolgerungen über das Verhalten und das Schicksal von Zellen zu ziehen, wenn sie durch Amöben und möglicherweise durch andere phagozytische Zellen verinnerlicht werden.
Introduction
Mikroben haben sich im Laufe der Zeit entwickelt, um in verschiedenen ökologischen Nischen wie den offenen physikalischen Grenzen des Bodens und des Wassers, unter anderem1, zu besetzen und zu gedeihen. In diesen Nischen liefern sich Mikroben häufig den direkten Wettbewerb um begrenzte Ressourcen; wichtig für Nährstoffe, die sie zur Unterstützung ihres Wachstums oder Raumes verwenden, die sie benötigen, um die wachsende Bevölkerung unterzubringen2,3. In bestimmten Fällen, einige holozoische Organismen wie Amöben können sogar auf Kryptokokken-Zellen als eine Möglichkeit, Nährstoffe aus ihrer Biomasse zu extrahieren4,5. Dies wiederum ermöglicht es solchen Organismen, eine territoriale Dominanz zu etablieren, indem sie die Populationszahlen ihrer Beute kontrollieren. Aufgrund dieses räuberischen Drucks können einige Beutetiere ausgewählt werden, um mikrobielle Faktoren zu erzeugen, wie die Kryptokokkenkapsel6, um die negativen Auswirkungen des Drucks in Einklang zu bringen. Als unbeabsichtigte Folge dieses Drucks erwerben einige Mikroben jedoch Faktoren, die es ihnen ermöglichen, die Artenbarriere zu überqueren und neue Nischen zu suchen, um7zu besiedeln, wie die engen Räume des menschlichen Körpers, die reich an Nährstoffen sind und ideale Bedingungen. Letzteres könnte erklären, wie eine terrestrische Mikrobe wie Cryptococcus (C.) Neoformane können sich transformieren, um pathogen zu werden.
Zu diesem Zweck ist es wichtig, den anfänglichen Kontakt zu untersuchen, den Kryptokokkenzellen mit Amöben haben können und wie diese sie auswählen können, um pathogen zu werden. Genauer gesagt, Dies kann Hinweise darauf geben, wie kryptokokken Zellen verhalten, wenn durch Makrophagen während der Infektion gehandelt. Aus diesem Grund wurde Amöbe hier als Modell für Makrophagen gewählt, da es relativ billig und einfach ist, eine Amöbenkultur in einem Labor zu pflegen8. Von Interesse war auch zu untersuchen, wie kryptokokkalsekundäre Metaboliten viz. 3-Hydroxy-Fettsäuren9,10 beeinflussen die Interaktion zwischen Amöben und Kryptokokkenzellen.
Eine einfache Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen Amöben und seiner Beute mit bloßem Auge zu erkennen, besteht darin, einen Rasen mit seiner Beute auf der Oberfläche einer Agarplatte zu schaffen und Amöben zu erkennen. Die Visualisierung von Plaques oder klaren Zonen auf der Agarplatte zeigt Bereiche, in denen Amöben sich von ihrer Beute ernährt haben könnten. Auf dieser Makroebene wird jedoch nur das Ergebnis des Prozesses festgestellt, und der Prozess der Phagozytose ist mechanisiert, kann nicht beobachtet werden. Daher, um den Prozess auf zell-zu-Zell-Basis zu schätzen, gibt es mehrere mikroskopische Methoden, die verwendet werden können11,12. Beispielsweise kann ein invertiertes Mikroskop mit einer Inkubationskammer verwendet werden, um einen Zeitraffer von Ereignissen zwischen einer phagozytischen Zelle und ihrem Ziel13aufzuzeichnen. Leider ist es aufgrund der Kosten für ein Mikroskop mit Einer Zeitrafferfunktionalität nicht immer möglich, dass Laboratorien ein solches Mikroskop kaufen, insbesondere bei Ressourcenmangel.
Um die obige Einschränkung zu umgehen, präsentiert diese Studie ein sequenzielles Explorativdesign, das die Wechselwirkung von C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 und C. neoformans LMPE 046 mit Acanthamoeba castellani bewertet. . Zunächst wird eine qualitative Methode verwendet, die einer quantitativen Methode vorausgeht. Standbilder werden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop sowie einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommen, um Amöben-Kryptokokken-Wechselwirkungen darzustellen. Es folgte die Quantifizierung der Fluoreszenz mit Hilfe eines Plattenlesers, um die Effizienz von Amöben zur Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu schätzen. Wenn man die Ergebnisse dieser Methoden während der Dateninterpretationsphase abgleicht, kann dies ebenso viele kritische Informationen offenbaren wie das Durchlesen eines Phagozytose-Zeitraffervideos.
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Protocol
Cryptococcus neoformans und einige Acanthamoeba castellanii Stämme gelten als Biosicherheits-Level-2 (BSL-2) Krankheitserreger; Daher müssen die Forscher bei der Arbeit mit diesen Organismen angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen. Beispielsweise sollte das Laborpersonal über spezielle Schulungen und persönliche Schutzausrüstungen (PSA) wie Labormäntel, Handschuhe und Augenschutz verfügen. Ein biologischer Sicherheitsschrank (Stufe-2) sollte für Verfahren verwendet werden, die eine Infektion verursachen können14.
1. Kultivierung und Standardisierung von Pilzzellen (modifiziert von Madu et al. 15 )
- Streichen Sie die Testpilzstämme (z.B. C. neoformans UOFS Y-1378 und C. neoformans LMPE 046) aus Bestandskulturen (nicht älter als 9 Monate) auf Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) Agarplatten. Informationen zu den Inhaltsstoffen von YPD-Agar finden Sie in Tabelle 1.
HINWEIS: C. neoformans UOFS Y-1378 produziert nachweislich 3-Hydroxy-Fettsäuren, während C. neoformans LMPE 046 keine 3-Hydroxy-Fettsäuren produziert. Informationen dazu, wie das Vorhandensein dieser Moleküle bestimmt wird, finden Sie in der Ergänzungsdatei 1. - Die Agarplatten für 48 h bei 30 °C inkubieren.
HINWEIS: Eine Platte kann bis zu 2 Monate bei 4 °C gelagert werden, bevor sie entsorgt oder zur Herstellung einer Bestandskultur verwendet werden kann16. - Schrott eise eine Schleife von Kryptokokkenzellen (C. neoformans UOFS Y-1378 oder C. neoformans LMPE 046) aus der 48 h-alten Platte und impfen in einen 250 ml kegelförmigen Kolben mit 100 ml der chemisch definierten YNB-Brühe (6,7 g/L) ergänzt mit 4% ( w/v) Glukose. Informationen zu den Inhaltsstoffen der YNB-Brühe finden Sie in Tabelle 2.
- Die Kolben bei 30 °C für 24 h inkubieren, während Sie bei 160 U/min auf einem Drehschüttler aufwirbeln.
- Zählen Sie nach einer Inkubationszeit von 24 h die Pilzzellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zellzahl auf 1 x 106 Zellen/ml mit PBS bei pH 7,4 an.
HINWEIS: Das vorbereitete C. neoformans UOFS Y-1378 inoculum wurde in den Schritten 3.1 und 3.2 verwendet, während C. neoformans LMPE 046 inoculum nur in Schritt 3.2 verwendet wurde.
2. Kultivierung und Standardisierung von Amöbenzellen (modifiziert von Madu et al. 15 )
- Tauen Sie eine Aktienkultur von Acanthamoeba castellanii und bringen Sie es auf Raumtemperatur (RT).
HINWEIS: Amoeba wurde auf der Grundlage der modifizierten Protokolle von Axelsson-Olsson et al.8 und Schuster17erstellt. - Pipette 1 ml der aufgetauten Kultur und impfen Sie sie in ein 50 ml Zentrifugenrohr mit 15 ml ATCC-Medium 712. Informationen zu den Inhaltsstoffen von ATCC medium 712 finden Sie in Tabelle 3.
- Schütteln Sie es vorsichtig und sofort zentrifugieren sie 5 min bei 400 x g und 30 °C.
- Aspirieren Sie den Überstand.
- Setzen Sie die Zellen in 15 ml ATCC-Medium 712 aus und inkubieren Sie das Rohr 14 Tage lang bei 30 °C.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellen regelmäßig mit einem einfachen Lichtmikroskop, um festzustellen, ob sie sich in einem Trophozoitzustand befinden. Sobald sie in einem trophozoiten Zustand sind, beginnen Sie eine neue Kultur. - Pipette 1 ml aus einer Kultur, die Zellen in einem Trophozoit-Zustand zeigt und verwenden Sie es, um ein steriles 50 ml Zentrifugenrohr mit 15 ml frischem, sterilem ATCC-Medium 712 zu impfen.
- Inkubieren Sie das Rohr bei 30 °C für 1 Woche, während bei 160 U/min auf einem Drehschüttler aufgewirtet wird.
- Zählen Sie nach einer Woche die Amöbenzellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zellzahl auf 1 x 107 Zellen/ml mit frischem, sterilem ATCC-Medium 712 an.
- Führen Sie einen Lebensfähigkeitstest mit einem Trypan-Blaufleck durch, wie von Strober18beschrieben. Gehen Sie weiter mit den Kulturen, die mindestens 80% Lebensfähigkeit aufweisen.
3. Fluoreszenzfärbung von Zellen zur Untersuchung der Phagozytose (modifiziert von Madu et al. 15 )
- Sammeln qualitativer Daten durch Einsatz von Fluoreszenzmikroskop
HINWEIS: Führen Sie diesen Test mit Acanthamoeba castellanii und C. neoformans UOFS Y-1378 durch.- Geben Sie eine 200-L-Suspension aus standardisiertem Amöben (1 x 107 Zellen/ml in ATCC-Medium 712) in Kammerbrunnen eines haftenden Schlittens und brüten sie für 2 h bei 30 °C für Zellen, die an der Oberfläche haften.
- Während sich Amöbenzellen absetzen, um zu haften, färben Sie die standardisierten C. Neoformans UOFS Y-1378 Zellen, die auf 1 x 106 Zellen/ml (in 999 l PBS) mit 1 l Fluoresceinisothiocyanat in einem 1,5 ml Kunststoffrohr eingestellt wurden.
HINWEIS: Bereiten Sie den Fleck vor, indem Sie 1 mg Fluoresceinisothiocyanat in 1 ml Aceton auflösen. - Rühren Sie die C. neoformans UOFS Y-1378-Zellen auf einem Orbital-Shaker, der bei 50 U/min für 2 h bei RT und im Dunkeln eingestellt ist, sanft auf.
- Nach 2 h Zentrifugieren Bei 960 x g für 5 min bei 30 °C, um die Zellen zu pellet.
- Aspirieren Sie den Überstand, um die PBS mit dem Fleck zu entfernen.
- Fügen Sie 1 ml PBS in das Rohr zum Waschen des Zellpellets. Waschen Sie die Zellen durch sanftes Pipetieren.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 960 x g für 5 min bei 30 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
- Setzen Sie die gewaschenen Zellen in 1 ml PBS wieder aus.
- Geben Sie eine 200-L-Suspension der gefärbten C. neoformans UOFS Y-1378-Zellen in Kammerbrunnen, die die ungefärbten Amöbenzellen enthalten.
- Die vorbereitete Kokultur bei 30 °C für einen zusätzlichen Zeitraum von 2 h inkubieren.
HINWEIS: Die Co-Kultur kann für verschiedene Zeitpunkte inkubiert werden, um dem Zweck des Experiments zu entsprechen. - Am Ende der Ko-Inkubationszeit, aspirieren Sie den Inhalt der Brunnen.
- Fügen Sie 300 L PBS in die Brunnen, um die Kammerbrunnen zu waschen und alle ungebundenen ko-kultivierten Zellen zu entfernen. Tun Sie dies durch sanftes Pipettieren. Aspirieren Sie den Inhalt der Brunnen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
- Bereiten Sie die 3% Glutaraldehyd-Lösung vor, indem Sie 3 ml Glutaraldehyd zu 97 ml destilliertem Wasser hinzufügen.
- Fixieren Sie die ko-kultivierten Zellen, indem Sie 250 l 3% Lösung in die Kammerbrunnen und Inkubation für 1 h hinzufügen.
- Aspirieren Sie die Fixativ und waschen Sie die Kammerbrunnen wie detailliert ab Schritt 3.1.13.
- Zerlegen Sie die Kammerbrunnen mit einem Werkzeug, das mit den Kammerrutschen versehen war.
- Fügen Sie einen Tropfen der Antifade-Verbindung, 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-Oktan, auf die Folie, um Auto-Bleaching zu verhindern. Mit einem Deckelbedeckung abdecken und die Seiten mit einem Nagellack versiegeln, um Verdunstung zu verhindern.
- Sehen Sie sich die ko-kultivierten Zellen mit der 100-fachen Objektivlinse (mit Öl) eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops an.
HINWEIS: Es ist wichtig, Bilder in Hellfeld und Fluoreszenz zu machen, um die Interaktion zwischen Amöben und Kryptokokkenzellen anzuzeigen. Wo immer möglich, kann die Fluoreszenz auf die Hellfeldbilder überlagert werden. Amöbenzellen sind in der Regel größer (d. h. 45-60 m), und die Trophozoitzellen haben eine unregelmäßige Form. Kryptokokkenzellen haben einen Durchmesser von 5-10 m und haben eine Globose bis zur eiförmigen Form. Wenn sie einem Laser ausgesetzt sind, ist es möglich, dass nicht gefärbte Amöbenzellen Autofluoreszenz aussenden. Methoden zur Reduzierung der Autofluoreszenz finden Sie in Beisker und Dolbeare19 und Clancy und Cauller20.
- Erfassung quantitativer Daten durch Verwendung von Fluoreszenzplattenlesern
HINWEIS: Führen Sie diesen Test mit Acanthamoeba castellanii und C. neoformans UOFS Y-1378 oder C. neoformans LMPE 046 durch.- Geben Sie eine 100-L-Aufhängung aus standardisiertem Amöben (angepasst auf 1 x 107 Zellen/ml in ATCC-Medium 712) in eine schwarze, haftende 96-Well-Mikrotiterplatte.
- Inkubieren Sie die Platte für 2 h bei 30 °C, damit Amöbenzellen an der Oberfläche haften können.
- Während sich Amöbenzellen absetzen, um zu haften, färben Sie die standardisierten C. Neoformans UOFS Y-1378 Zellen, die auf 1 x 106 Zellen/ml (in 999 l PBS) mit 1 l pHrodo Green Zymosan A BioParticles in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr eingestellt wurden. Stain C. neoformans LMPE 046 Zellen sowie in einem separaten Rohr.
HINWEIS: Der Farbstoff färbt im Gegensatz zu FITC selektiv Zellen, die in der sauren Umgebung einer phagozytischen Zelle gefangen sind21,22. Für diese Technik ist es wichtig, die Kryptokokkenzellen in einem Medium mit einem neutralen pH-Wert (PBS) und Amöben in einem Medium mit einem neutralen pH-Wert (ATCC-Medium 712) zu halten. Ein Medium mit einer sauren Umgebung führt zu einer falsch positiven Messung der relativen Fluoreszenzeinheiten, was impliziert, dass eine größere Anzahl von Kryptokokken internalisiert wurden. - Bewegen Sie Kryptokokkenzellen auf einem Orbital-Shaker, der bei 50 Umdrehungen pro Minute für 2 h bei RT und im Dunkeln eingestellt ist, sanft auf.
- Nach 2 h zentrieren Sie das Mikrozentrifugenrohr bei 960 x g für 5 min bei 30 °C, um die Zellen zu pellet. Aspirieren Sie den Überstand, um PBS mit dem Fleck zu entfernen.
- Fügen Sie 1 ml PBS in das Rohr, um die pelletierten Zellen zu waschen. Waschen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 960 x g für 5 min bei 30 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
- Das Pellet der gewaschenen Zellen in 1 ml PBS wieder aufhängen.
- Geben Sie eine 100-L-Suspension von gefärbten Kryptokokkenzellen an Brunnen, die ungefärbte Amöbenzellen enthalten.
- Die vorbereitete Kokultur bei 30 °C für einen zusätzlichen Zeitraum von 2 h inkubieren.
HINWEIS: Die Co-Kultur kann für verschiedene Zeitpunkte inkubiert werden, um den Zweck des Experiments zu erfüllen. - Messen Sie am Ende der Ko-Inkubationszeit die Fluoreszenz auf einem Mikroplattenleser. Konvertieren Sie logarithmische Signale in relative Fluoreszenzeinheiten.
HINWEIS: Die Anregung des Farbstoffs liegt bei 492 nm und die Emission bei 538 nm. Konsultieren Sie Beisker und Dolbeare19 und Clancy und Cauller20 für Methoden zur Verringerung der Autofluoreszenz.
4. Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie zur Untersuchung der Phagozytose (modifiziert von van Wyk und Wingfield 23 )
- Eine 5 ml Amöbenaufhängung (angepasst auf 1 x 107 Zellen/ml in ATCC-Medium 712) zu einem 15 ml Zentrifugenrohr geben und 30 min bei 30 °C absetzen lassen.
- Fügen Sie dem gleichen Zentrifugenrohr, das 5 ml standardisierte Amöbenzellen enthält, eine 5 ml Suspension von C. neoformans UOFS Y-1378-Zellen (angepasst auf 1 x 106 Zellen/ml in PBS) hinzu.
- Lassen Sie den Rohrständer für 2 h bei 30 °C.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 640 x g für 3 min bei 30 °C, um die kokultivierten Zellen zu pellet. Aspirieren Sie den Überstand. Waschen Sie die ko-kultivierten Zellen nicht.
- Fixieren Sie die ko-kultivierten Zellen, indem Sie das Pellet in 3 ml von 1,0 M (pH = 7,0) Natriumphosphat-gepuffertes 3% Glutaraldehyd für 3 h wieder aufsetzen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1.120 x g für 5 min bei 30 °C, um die kokultivierten Zellen zu pellet. Aspirieren Sie den Überstand.
- Fügen Sie dem Zentrifugenrohr 5 ml Natriumphosphatpuffer hinzu, um die pelletierten Zellen zu waschen. Waschen Sie durch sanftes Pipettieren des Rohrinhalts für 20 s.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1.120 x g für 5 min bei 30 °C, um die kokultivierten Zellen zu pellet.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.8-4.10. Aspirieren Sie den Überstand.
- Fixieren Sie die ko-kultivierten Zellen erneut, indem Sie das Pellet in 3 ml von 1,0 M (pH = 7,0) Natriumphosphat-gepuffert1% Osmiumtetroxid für 1,5 h wieder aufsetzen.
- Entfernen Sie das Fixierungsmittel (Osmiumtetroxid), indem Sie die ko-kultivierten Zellen in ähnlicher Weise wie 3% Glutaraldehyd waschen.
- Dehydrieren Sie das TEM-Material (auch als ko-kultivierte Zellen bezeichnet) in einer abgestuften Acetonserie von 30%, 50%, 70%, 95% und zwei Veränderungen von 100% für jeweils 15 min. Dazu 3 ml der Acetonlösung zu den pelletierten Zellen hinzufügen und 15 min stehen lassen. Dann Zentrifuge bei 200 x g für 10 min bei RT Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie den höheren Prozentsatz der Acetonlösung hinzu.
- Bereiten Sie das Epoxid der normalen Konsistenz gemäß dem Protokoll von Spur24vor.
HINWEIS: Das Epoxidharz wird zum Schnitten verwendet. - Das TEM-Material in das frisch zubereitete Epoxidharz einbetten. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
- Fügen Sie 3 ml des frisch zubereiteten Epoxids in ein Rohr, das das TEM-Material enthält, das in 3 ml 100% Lösung von Aceton resuspendiert wird. Lassen Sie das Rohr für 1 h stehen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 x g für 10 min bei 30 °C. Die Epoxid-Acetonlösung aspirieren.
- 6 ml des frisch zubereiteten Epoxids in das Pellet in der Röhre geben. Lassen Sie das Rohr für 1 h stehen.
- Zentrifuge bei 200 x g für 10 min bei 30 °C. Alle Epoxid-Aceton-Lösung aspirieren.
- 3 ml des frisch zubereiteten Epoxids in die Röhre geben. Lassen Sie das Rohr für 8 h stehen.
- Zentrifuge bei 200 x g für 10 min bei 30 °C. Aspirieren Sie alle Epoxid-Lösung
- 3 ml des frisch zubereiteten Epoxids in die Röhre geben. Bewahren Sie das TEM-Material über Nacht in einem Vakuum-Austrocknungsor in der Epoxidlösung auf.
VORSICHT: Epoxidharz ist ein radioaktives Material. Verwenden Sie PSA, um das Epoxidharz zu handhaben. Das Epoxidharz sollte auch in einer Dunstabzugshaube behandelt werden. Die Forscher sollten die Sicherheitsvorschriften für die Rückwürfe von Material, wie von jedem Land angegeben25.
- Polymerisieren Sie das TEM-Material für 8 h bei 70 °C.
- Schneiden Sie am Ultramikrotom kleine Abschnitte von ca. 0,1 mm x 0,1 mm und 60 nm Dicke aus dem epoxy-eingebetteten Material mit einem montierten Glasmesser. Montieren Sie Abschnitte auf einem Raster und platzieren Sie die Gitter vor der Färbung in einem TEM-Probenhalterkasten.
- Färben Sie die Abschnitte mit einem Tropfen von 6% Uranylacetat für 10 min im Dunkeln. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte vollständig abgedeckt sind.|
HINWEIS: Stellen Sie den Fleck (6 g) in 100 ml destilliertem Wasser wieder her.
VORSICHT: Uranylacetat ist ein radioaktives Material. Verwenden Sie PSA, um Uranylacetat zu behandeln. Uranlacetat sollte auch in einer Dunstabzugshaube behandelt werden. Die Forscher sollten die Sicherheitsvorschriften für die Rückwürfe von Material, wie von jedem Land angegeben25. - Spülen Sie Abschnitte, indem Sie sie fünfmal in einen Becher tauchen, der 100 ml destilliertes Wasser enthält.
HINWEIS: Das destillierte Wasser sollte entsprechend entsorgt werden, da es Spuren von Uranylacetat enthält. - Färben Sie den Abschnitt mit einem Tropfen Bleicitrat für 10 min im Dunkeln. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte vollständig abgedeckt sind.
HINWEIS: Bleicitrat sollte nach dem Protokoll von Reynold26vorbereitet werden. - Spülen Sie Abschnitte, indem Sie sie fünfmal in einen Becher tauchen, der 100 ml destilliertes Wasser enthält.
- Montieren Sie die Gitter einzeln mit gebeizten Profilen auf einem TEM-Probenhalterkasten.
- Ansichtsabschnitte mit einem Transmissionselektronenmikroskop.
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Representative Results
Mikroben sind mikroskopische Organismen, die nicht mit bloßem Auge wahrgenommen werden können. Ihre Auswirkungen können jedoch zu beobachtbaren klinisch offensichtlichen Krankheiten wie Hautinfektionen führen. Bei der Untersuchung bestimmter Aspekte von Mikroben, die von ihrer Morphologie, Nebenprodukten und Wechselwirkungen reichen, ist es von größter Bedeutung, Bild- und Videobeweise liefern zu können.
Wir versuchten zuerst, die Interaktion zwischen Kryptokokkenzellen und Amöben zu visualisieren. Zu diesem Zweck wurden zunächst Hellfeldbilder untersucht, die 2 h ko-inkubierte Zellen zeigten. Ein Bild zeigte eine Kryptokokkenzelle, die sich in unmittelbarer Nähe zur Amöbe befand. Eine der Amöbenzellen wurde mit ausgedehnten Pseudopodien gesehen, um eine Kryptokokkenzelle zu erfassen (Abbildung 1A). Als Nächstes wurde ein entsprechendes Bild in Fluoreszenz für die Referenzierung aufgenommen (Abbildung 1B). Die grüne Fluoreszenz auf der Oberfläche der gebeizten Zellen half bei der Bestätigung des Vorhandenseins von Kryptokokkenzellen. Die ungefleckte Amöbe fluoreszierte auch. Dies, zusätzlich zu den scheinbaren Differenzgrößen und Morphologie, half bei der weiteren Unterscheidung der beiden Zelltypen.
Autofluoreszenz ist eine Qualität, die häufig beobachtet wird, wenn biologische Strukturen natürlich Licht aussenden, das sie absorbiert haben (z. B. nach Der Exposition gegenüber einem Laser während der konfokalen Laserscanmikroskopie)27. In Abbildung 1Cwurden Kryptokokkenzellen (gleichzeitig 2 h) festgestellt, die bereits durch Amöben verinnerlicht wurden. Das entsprechende Bild in fluoreszenz wurde auch für die Referenzierung erfasst (Abbildung 1D). Basierend auf den vorliegenden Beweisen ist es verlockend zu schlussfolgern, dass die Amöbe die beiden eingeschlossenen Zellen getötet hat. Phagozytose ist jedoch ein dynamischer Prozess, bei dem Wirt, Raubtier und Erreger und Beute verschiedene Strategien anwenden, um sich gegenseitig zu zerstören oder zu umgehen28. Der Akt von Kryptokokkenzellen, die phagozytischen Zellen ausweichen, wird elegant durch Vomozytose29,30demonstriert, die ein nicht-lytischer Extifzprozess von eingeschlossenen Zellen aus Makrophagen ist. Dieser gewagte Schritt wurde in Zeitraffervideos29,30aufgenommen. Leider unterstreicht dies die Einschränkung des Studiums von Standbildern von festen Zellen, wie in unserer Studie, um einen dynamischen Prozess wie Phagozytose aufzuklären. Bis zu diesem Punkt kann ein Forscher das Intervall verpassen, wenn eine Zelle aus ihrem Capturer entweicht.
Als Ausgleich wurde der Messwert der relativen Fluoreszenzeinheiten berücksichtigt. In der aktuellen Studie wurden Messungen nach einer 2 h Co-Inkubationszeit durchgeführt und halfen, die Reaktion der beiden Test-Kryptokokkenstämme zu vergleichen [d.h. eine, die 3-Hydroxy-Fettsäuren(C. neoformans UOFS Y-1378) produziert, und die andere, die nicht (C. neoformans LMPE 046)]. Es wurde vermutet, dass 3-Hydroxy-Fettsäuren als Virulenz-Determinant wirken können, die die Aufnahme von Kryptokokkenzellen beeinträchtigen, einschließlich Phagozytose durch Amöben. Für weitere Informationen über den Einfluss von 3-Hydroxy-Fettsäuren auf Amöben, ist es ratsam, madu et al.15,31zu beziehen. Abbildung 2 zeigt die Menge der Kryptokokkenzellen, die basierend auf dem Lesen von Fluoreszenzeinheiten internalisiert wurden. Beim Vergleich der beiden Kryptokokkenisolate war klar, dass Zellen, die die 3-Hydroxy-Fettsäuren produzieren, weniger häufig verinnerlicht wurden als Zellen, die keine 3-Hydroxy-Fettsäuren produzieren.
Zur Verbesserung der qualitativen Daten wurde die Transmissionselektronenmikroskopie in die Analyse einbezogen (Abbildung 3A). Hier wurde festgestellt, dass der Stamm, der 3-Hydroxy-Fettsäuren(C. neoformans UOFS Y-1378) produziert, stachelige Protuberanzen auf der Kapsel hatte (Abbildung 3B), die von der Zelle verwendet werden können, um 3-Hydroxy-Fettsäuren an die äußere Umgebung freizusetzen.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Daten (in Abbildung 1, Abbildung 3) das Schicksal von Kryptokokkenzellen als internalisiert und nicht getötet/phagozytisiert vermitteln. Um festzustellen, ob die Zellen das phagozytische Ereignis überlebt haben, wird empfohlen, einen zusätzlichen Assay aufzunehmen, in dem der Forscher die Amöbenzellen lysiert und einen Streuplattenagar vorbereitet, um die kryptokokkalen Koloniebildenden Einheiten (CFU) aufzuzählen. Durch das Zählen von KBE berichteten Madu et al.15, dass Kryptokokkenzellen, die 3-Hydroxy-Fettsäuren produzieren, auch gegen die phagozytische Wirkung von Amöben nach der Internalisierung resistent waren. Somit ergaben diese Zellen eine signifikant höhere Überlebensrate im Vergleich zu Zellen, die keine 3-Hydroxy-Fettsäuren produzieren.
Abbildung 4 zeigt die Bedeutung der Vorbereitung und Prüfung von TEM-Proben. In diesem Fall waren C. neoformans UOFS Y-1378 Abschnitte absichtlich Elektronenbeschuss überbelichtet. Am Ende kann das aufgenommene Bild nicht verwendet werden, da es die Qualität der Informationen beeinträchtigt, die abgeleitet werden können. Zusammengenommen zeigen die erhaltenen Informationen, dass ein Forscher durch die Kombination dieser verschiedenen Techniken in der Lage ist, ausreichende Informationen abzuleiten, um das Schicksal von Kryptokokkenzellen zu bestimmen, wenn er mit Amöben kokultiviert wird.
| zutat | menge |
| bakteriologischer Pepton | 20 g/L |
| Hefeextrakt | 10 g/L |
| glukose | 20 g/L |
| Agar | 15 g/L |
Tabelle 1: Zutaten für die Herstellung von YPD-Agar. Fügen Sie die erforderliche Menge alle Zutaten in 1 L Wasser. Unter Rühren erhitzen, um die Zutaten vollständig aufzulösen. Einmal fertig Autoklav vor der Verwendung.
| zutat | menge |
| Ammoniumsulfat | 5 g/L |
| Biotin | 2 g/L |
| Calciumpantothenat | 400 g/L |
| Folsäure | 2 g/L |
| Inositol | 2000 g/L |
| Niacin | 400 g/L |
| p-Aminobenzoesäure | 200 g/L |
| Pyridoxinhydrochlorid | 400 g/L |
| Riboflavin | 200 g/L |
| Thiaminhydrochlorid | 400 g/L |
| Borsäure | 500 g/L |
| Kupfersulfat | 40 g/L |
| Kaliumiodid | 100 g/L |
| Eisenchlorid | 200 g/L |
| Mangansulfat | 400 g/L |
| Natriummolybdat | 200 g/L |
| Zinksulfat | 400 g/L |
| Monokaliumphosphat | 1 g/L |
| Magnesiumsulfat | 0,5 g/L |
| natriumchlorid | 0,1 g/L |
| Calciumchlorid | 0,1 g/L |
Tabelle 2: Zutaten für die Herstellung von YNB Brühe. Fügen Sie die erforderliche Menge alle Zutaten in 1 L Wasser. Unter Rühren erhitzen, um die Zutaten vollständig aufzulösen. Einmal fertig Autoklav vor der Verwendung.
| Teil I: Basalmedium. | |
| zutat | menge |
| Proteose-Pepton | 20 g/L |
| Hefeextrakt | 1 g/L |
| Agar (falls erforderlich) | 20 g/L |
| Teil II: Zuschläge. | |
| Zutaten (Lagerlösungen) | menge |
| 0,05 M CaCl2 | 8 mL |
| 0,4 M MgSO4 x 7H2O | 10 ml |
| 0,25 M Na2HPO4 x 7H2O | 10 mlL |
| 0,25 M KH2PO4 | 10 ml |
| Na Citrat x 2H2O | 1 g |
| 0,005 M Fe(NH4)2(SO4)2 x 6H2O | 10 ml |
Tabelle 3: Zutaten für die Herstellung von ATCC mittel 712. Bereiten Sie das Basalmedium in 900 ml Wasser vor. Bereiten Sie die Ergänzungen separat und fügen Sie dem Basalmedium. Einmal fertig stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH und Autoklaven ein. Filter sterilisieren 50 ml Lösung von 2 M Glukose (18 g/50 ml) und fügen Sie es aseptisch auf das gesamte Medium vor der Verwendung.
Abbildung 1 : Hellfeld und entsprechende fluoreszierende Mikrographien, die Amöbezeigen -Cryptococcus interaktive Momente. (A) Eine Amöbenzelle in unmittelbarer Nähe zu einer C. neoformans UOFS Y-1378 Zelle ist zu sehen. Das entsprechende fluoreszierende Bild ist in (B )dargestellt. (C) Darstellung von zwei C. neoformans UOFS Y-1378 Zellen, die im Amöbenfutter vakuol gefangen sind. Das entsprechende fluoreszierende Bild ist in (D )dargestellt. Diese Zahl wurde von Madu et al.15geändert. A = Amöben; C = C. neoformans. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Die Ergebnisse des Internalisierungs-Assays von Kryptokokkenzellen, die mit Amöben kokultiviert werden. Das Ablesen relativer Fluoreszenzeinheiten ermöglicht die Interpretation und den Vergleich der Effizienz von Amöben zur Internalisierung von C. neoformans UOFS Y-1378 und C. neoformans LMPE 046. Die Fehlerbalken stellen die berechneten Standardfehler dar, die auf drei biologischen Replikationen basieren. Diese Zahl wurde von Madu et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Transmissionselektronenmikroskopie, die Amöben- Cryptococcus Wechselwirkungen. TEM-Mikrographen (A, B) bestätigen die Beobachtungen in Abbildung 1C, D. (A) Gezeigt ist eine C. neoformans UOFS Y-1378 Zelle, die im Amöben-Lebensmittelvakuum eingeschlossen ist, während (B) eine Nahansicht von Abbildung 3A ist. . Diese Zahl wurde von Madu et al.15geändert. A = Amöbenzelle; C = C. neoformans Zelle. Der rote Pfeil zeigt auf eine kapselförmige Protuberanz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Eine Transmissionselektronenmikroskopie, die C. neoformans UOFS Y-1378 Zellen. Die Zellen sind beschädigt und können daher keine aussagekräftigen Daten liefern. Rote Pfeile zeigen Punkte an, an denen der Abschnitt gerissen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In dem Papier wurden verschiedene Techniken erfolgreich eingesetzt, um das mögliche Ergebnis zu enthüllen, das entstehen kann, wenn Amöben mit Kryptokokkenzellen interagieren. Außerdem waren wir daran interessiert, die Auswirkungen von 3-Hydroxy-Fettsäuren auf das Ergebnis von Cryptococcus-Amöben-Wechselwirkungen zu zeigen.
Die erste verwendete Technik war die konfokale Mikroskopie, die Standbilder wiedergab. Der hauptnachteil dieser Technik hier war, dass sie uns nur Informationen gab, die auf einen bestimmten Zeitpunkt beschränkt sind. Jede Schlussfolgerung, die auf der Grundlage der Ergebnisse gezogen werden kann, eignet sich für induktiveÜberlegungen, wobei man zu einer Schlussfolgerung auf der Grundlage einer Reihe von Beobachtungen 32 gelangenkann. Doch nur weil man mehrere Situationen beobachtet, in denen ein Muster existiert, bedeutet das nicht, dass dieses Muster für alle Situationen zutrifft. So wird in der Studie gezeigt und möglicherweise gewarnt, wie solche begrenzten Informationen zu unbegründeten Schlussfolgerungen führen können. Bis zu diesem Punkt kann in Ermangelung widersprüchlicher oder unterstützender, ergänzender Beweise der Schluss gezogen werden, dass die Internalisierung zur Phagozytose der Zellen geführt haben kann.
Das Tempo der Entwicklung in der Bildgebung bringt neue Möglichkeiten, wissenschaftliche Entdeckungen zu machen, wie es bei der Entdeckung der Vomozytose29,30der Fall war. Um diesen Punkt ohne den Einsatz eines Mikroskops zu veranschaulichen, das Zeitraffervideos aufzeichnen kann, wäre diese Entdeckung nicht möglich gewesen. Daher wird ein mangelhafter Zugang zu solchen High-End-Instrumenten immer ein Hindernis für Ressourcenmangel sein, die nicht an vorderster Front bei der Aufdeckung solcher Prozesse stehen. Eine Möglichkeit, dies zu überwinden, besteht darin, neue Kooperationen zu suchen oder innovative Wege zu finden, um Forschungsfragen anzugehen. Eine willkommene Entwicklung war die Einführung und Anwendung von spezialisierten Flecken wie der hier verwendete phagozytische Fleck21,22. Dieser Fleck ist pH-empfindlich und fluoresces nur in sauren Umgebungen wie im Lumen von Amöben Lebensmittel vauole15. Es lohnt sich darauf hinzuweisen, dass der Fleck nur Informationen über die Internalisierung von Zellen gibt. Es kann erforderlich sein, zu bestimmen, ob Zellen in weiteren Experimenten schließlich phagozytisiert werden.
Wichtig ist, dass sich ein solcher Fleck auch bei der Messung der Fluoreszenz als nützlich erwiesen hat. Letzteres ermöglichte die Integration quantitativer Daten, um zu erklären, was biologisch zu einem bestimmten Zeitpunkt geschieht. Hier wurde das Schicksal der Zellen erkannt (d.h. es wurde festgestellt, ob das Vorhandensein von 3-Hydroxy-Fettsäuren die Internalisierung von Zellen beeinträchtigt oder gefördert hat), indem die Bedeutung aus den Messwerten relativer Fluoreszenzeinheiten extrapoliert wurde.
Anders als in dieser Studie können sich Die Forscher auch dafür entscheiden, die Fluoreszenz von Zellen über einen Bestimmten Zeitraum zu messen. Die erhaltenen Informationen sind nützlich, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt internalisiert werden, und um zu verfolgen, wie sich der Betrag während der Periode ändert. Ebenso können Bilder auch zu entsprechenden Zeitpunkten aufgenommen werden.
Diese Studie zeigt die Kraft der Kombination einer Reihe von Methoden, um eine begründete Schlussfolgerung zu erreichen. Der Ansatz, mehrere Ansätze zur Überwachung der Phagozytose zu kombinieren, um eine anfängliche Technik zu vergleichen oder zu ergänzen, ist nicht neu. So verglichen Meindl und seine Kollegen33 drei Techniken (Bildanalyse, Fluoreszenz und Durchflusszytometrie), um zu untersuchen, wie sich fluoreszenzmarkierte Partikelgröße auf die Makrophagozytose auswirkt. Die Studie bewies, dass von den drei Techniken das Lesen von Platten die beste Option zur Überwachung der Phagozytose33sein kann.
TEM ist ein besonders leistungsfähiges Werkzeug, da es einen Blick aus der Vogelperspektive in das Lumen der Nahrungsvakuole bietet. Oft wird diese Detailgenauigkeit durch konfokale Mikroskopie in Form von Standbildern, einschließlich Zeitraffervideos, oft übersehen. Bis zu diesem Punkt des TEM war es interessant, Protuberanzen auf den Oberflächen der Kryptokokkenkapsel zu visualisieren. Es wurde früher vermutet, dass diese Zelloberflächenstrukturen als Kanal verwendet werden, um 3-Hydroxy-Fettsäuren in die Umgebung freizusetzen, um möglicherweise das Zellüberleben zu fördern9,10,15, 31. Die Einzelheiten des TEM-Mikrographen zeigen ferner, dass Protuberanzen an der internalisierten Zelle nicht verzerrt sind und ihre Integrität gewahrt haben. Daher (angesichts der Integrität der Protuberanzen), ist es möglich, dass sie 3-Hydroxy-Fettsäuren in die Lebensmittel-Vakuum-Umgebung liefern und innere Bedingungen verändern, was zum Zellüberleben führt, wie von Madu et al.15,31berichtet. Eine wesentliche Einschränkung des Einsatzes des Elektronenmikroskops ist, dass die Probenvorbereitung sehr mühsam ist. Um die Zerstörung der Proben gemäß Abbildung 4zu verhindern, sollte der Experimentator außerdem gut ausgebildet sein, um das Ultramikrotom und das Mikroskop manuell zu bedienen.
Abschließend ist vorgesehen, dass Forscher durch die Aussicht, Phagozytose zu untersuchen, ermutigt werden, indem sie einfach noch fluoreszierende Bilder mit quantitativen Daten kombinieren. Es wird darauf vertraut, dass Forscher genügend Informationen aus diesem Protokoll erhalten und in ihren eigenen Studien optimieren können. Dies kann die Entwicklung von Antikörpern gegen gezielte Metaboliten und die Anwendung auf Immunfluoreszenzstudien, einschließlich der Immuno-Gold-Kennzeichnung während der TEM-Untersuchung, umfassen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Unterstützt wurde die Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of South Africa (Fördernummer: UID 87903) und der Universität des Freistaats. Wir sind auch dankbar für die Dienstleistungen und die Unterstützung, die Pieter van Wyk und Hanlie Grobler während unserer Mikroskopiestudien angeboten haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
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