Summary
נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.
Abstract
כדי לדמות זיהום קריפטוקוקוס , אמבה, אשר הוא טורף טבעי של תאים cryptococcal בסביבה, יכול לשמש כמודל עבור מקרופאגים. זה אורגניזם טורף, דומה מקרופאגים, מעסיקה phagocyציטוזה כדי להרוג תאים הפנימו. בעזרתו של מיקרוסקופ לייזר ממוקד סריקה, תמונות המתארים רגעים אינטראקטיביים בין תאים cryptococcal ו אמבה נלכדים. הכוח החלטה של מיקרוסקופ אלקטרון גם מסייע לחשוף את הפרטים בדיקת אולטרה מבנית של תאים cryptococcal כאשר לכודים בתוך מזון אמבה ולאחר. מאז phagocyציטוזה הוא תהליך רציף, נתונים כמותיים משולבים אז בניתוח כדי להסביר מה קורה בנקודת הזמן כאשר התמונה נלכדה. כדי להיות ספציפיים, יחידות הזריחה יחסית נקראים על מנת לכמת את היעילות של אמבה הפנמה תאים cryptococcal. למטרה זו, תאים cryptococcal מוכתמים בצבע שהופך אותם זרוח פעם לכודים בתוך הסביבה החומצית של המזון ולבולית. כאשר נעשה שימוש יחד, מידע שנאסף באמצעות טכניקות כאלה יכול לספק מידע קריטי כדי לעזור להסיק מסקנות על ההתנהגות ועל גורלם של תאים כאשר הפנפו על ידי אמבה, ואולי, על ידי תאי phagocytic אחרים.
Introduction
החיידקים התפתחו לאורך זמן כדי לכבוש ולשגשג נישות אקולוגיות שונות כגון הגבולות הפיזיים פתוח של הקרקע והמים, בין היתר1. בגומחות אלה, חיידקים לעתים קרובות לעסוק בתחרות ישירה עבור משאבים מוגבלים; חשוב מכך, עבור חומרים מזינים שהם משתמשים בהם לתמיכה בצמיחה או במרחב שלהם, שהם צריכים להתאים לאוכלוסיה המתרחבת2,3. במקרים מסוימים, כמה אורגניזמים הולואיקון כמו אמבה אולי אפילו קדומים על התאים cryptococcal כדרך לחילוץ חומרים מזינים מתוך ביומסה שלהם4,5. בתורו, זה מאפשר אורגניזמים כאלה להקים שליטה טריטוריאלית באמצעות שליטה על מספר האוכלוסייה של טרפו. בגלל הלחץ הטורף הזה, אפשר לבחור טרף כדי לייצר גורמים מיקרוביאלית, כמו כמוסה הקריפטוקוקאל6, כדי ליישב את ההשפעות השליליות של הלחץ. עם זאת, כתוצאה בלתי מכוונת של לחץ זה, כמה חיידקים לרכוש גורמים המאפשרים להם לחצות את מחסום המינים ולחפש נישות חדשות ליישב7, כמו חללים סגורים של גוף האדם כי הם עשירים בחומרים מזינים יש אידיאלי תנאים. האחרון עשוי להסביר כיצד חיידק יבשתי כמו קריפטוקוקוס (C.) נאופורמנים יכולים להפוך. להיות פתוגניים
לשם כך, חשוב ללמוד את הקשר הראשוני כי תאים cryptococcal עשוי להיות עם אמבה וכיצד זה יכול לבחור אותם להיות פתוגניים. באופן ספציפי יותר, זה עשוי לתת רמזים על איך תאים cryptococcal להתנהג כאשר פעלו על ידי מקרופאגים במהלך הזיהום. זה בגלל הסיבה כי אמבה נבחרה כמודל עבור מקרופאגים כאן, כפי שהוא זול יחסית קל לשמור על תרבות של אמבה במעבדה8. העניין היה גם לבדוק כיצד הקריפטוקותא משנית משני מטבוליטים. 3-חומצות שומן הידרורוקסי9,10 להשפיע על האינטראקציה בין אמבות ותאי cryptococcal.
דרך פשוטה של תפיסת האינטראקציה בין אמבה וטרפו עם עין בלתי היא ליצור מדשאה באמצעות טרפו על פני השטח של צלחת אגר ואמבה ספוט. ויזואליזציה של לוחיות או אזורים ברורים על צלחת אגר מתאר אזורים שבהם אמבה אולי ניזון טרף שלה. עם זאת, ברמת מאקרו זו, רק את תוצאת התהליך הוא ציין, והתהליך של phagocyציטוזה הוא ממוכן לא ניתן לצפות. לכן, כדי להעריך את התהליך על בסיס תא-לתא, ישנן מספר שיטות מיקרוסקופיים שניתן להשתמש בהן11,12. לדוגמה, מיקרוסקופ הפוך עם תא דגירה יכול לשמש להקליט וידאו לשגות זמן של אירועים בין תא phagocytic היעד שלה13. למרבה הצער, בשל העלות של מיקרוסקופ עם פונקציונליות זמן לשגות, זה לא תמיד אפשרי מעבדות לרכוש כזה מיקרוסקופ, במיוחד במשאבים עניים-הגדרות.
כדי לעקוף את המגבלה שלעיל, מחקר זה מציג עיצוב סדרתי שמעריך את האינטראקציה של ה- c. neoformans מק. נאופורמנים 1378 ו- c. neoformans Lmpe 046 עם הקואקאואמבה קסטאני . ראשית, נעשה שימוש בשיטה איכותית הקודמת לשיטה כמותית. תמונות סטילס לכוד באמצעות מיקרוסקופ הפוך מעין פלואורסצנטית, כמו גם מיקרוסקופ אלקטרון שידור לתאר את האינטראקציות אמבה-קריפטוקוקוס . זה היה לאחר מכן על ידי כימות זריחה באמצעות קורא צלחת להעריך את היעילות של אמבה להפנים תאים cryptococcal. כאשר ליישב ממצאים משיטות אלה בשלב פרשנות הנתונים, זה עשוי לחשוף באופן שווה את המידע הקריטי הרבה כמו pergocyציטוזה מעידה בזמן וידאו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצפנת קריפטוקוקוס וכמה זנים קסטאנימה של הקואקאז נחשבים ברמה אבטחה טיחות 2 (bsl-2) פתוגנים; לכן, החוקרים חייבים לנקוט אמצעי זהירות נאותים כאשר עובדים עם אורגניזמים אלה. לדוגמה, על אנשי המעבדה להיות בעלי הכשרה מסוימת וציוד הגנה אישי (PPE) כגון מעילי מעבדה, כפפות והגנת עיניים. יש להשתמש בקבינט בטיחות ביולוגית (רמה 2) להליכים שעלולים לגרום לזיהום14.
1. טיפוח וסטנדרטיזציה של תאים פטרייתיים (השתנה ממדדו ואח ' 15 )
- החוצה את מבחן הזנים פטרייתי (כלומר, ג. neoformans Uofs Y-1378 ו -c. neoformans lmpe 046) מתרבויות מניות (לא יותר מ 9 חודשים) על שמרים-peptone-דקסטרוז (YPD) אגר צלחות. מידע על המרכיבים של YPD אגר ניתן למצוא בטבלה 1.
הערה: c. neoformans uofs 1378 הוכח לייצר 3-הידרוxy חומצות שומן, בעוד C. neoformans lmpe 046 אינו מייצר 3-הידרוxy חומצות שומן. התייחס לקובץ משלים 1 לקבלת מידע אודות אופן הקביעה של נוכחות מולקולות אלה. - מודטה את צלחות אגר עבור 48 h ב 30 ° c.
הערה: ניתן לאחסן צלחת עד 2 חודשים ב -4 ° c לפני שניתן יהיה להיפטר ממנו או להשתמש בו כדי ליצור מלאי תרבות16. - גרד את הloopful של תאים cryptococcal ( כולל של הצפנת מימן) מלוח 48 h-1378 או c. neoformans lmpe 046) מתוך הלוחית הישנה והנחסן ל-ml בקבוקון 250 משנת המכיל מתחת ל-ml (100 g/L) שיושלם עם 4% ( w/v) גלוקוז. בטבלה 2ניתן למצוא מידע על מרכיבי הציר של ynb.
- מודסת את מבחנות ב 30 ° צ' עבור 24 שעות בזמן השקיעה ב 160 סל ד על שייקר רוטרי.
- לאחר תקופת דגירה של 24 שעות, לספור את התאים פטרייתי באמצעות התקן הומוציטוטומטר ולהתאים את מספר התא ל 1 x 106 תאים/ML עם PBS ב-pH 7.4.
הערה: השימוש ב- c. neoformans Uofs Y-1378 הוכנו בשלבים 3.1 ו 3.2, בעוד C. neoformans lmpe 046 בשימוש רק בשלב 3.2.
2. טיפוח וסטנדרטיזציה של תאים אמבה (משנת Madu et al. 15 )
- הפשרת תרבות מניות של הקואקאנאמבה קסטאניאני ולהביא אותו לטמפרטורת החדר (RT).
הערה: אמבה הוכנו על בסיס פרוטוקולים ששונו של Axelsson-אולסון ואח '8 ו שוסטר17. - פיפטה 1 מ ל של התרבות המופשנת ומחסן אותו לצינור צנטריפוגה 50 mL המכיל 15 מ ל של ATCC בינוני 712. מידע על מרכיבי 712 בינונית של ATCC ניתן למצוא בטבלה 3.
- באופן ידני לנענע אותו בעדינות ומיד צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 400 x g ו 30 ° c.
- . ומכה את הסופרנטאנט
- השהה מחדש את התאים ב-15 מ ל של ATCC medium 712 והרכבת את הצינור ב -30 ° c למשך 14 ימים.
הערה: בדוק מדי פעם את התאים, תוך שימוש במיקרוסקופ אור פשוט, כדי לקבוע אם הם נמצאים במצב של trophozoite. , ברגע שהם במצב של טרופוזוייט. תתחילו בתרבות טרייה - פיפטה 1 מ ל מן התרבות המציגה תאים במצב trophozoite ולהשתמש בו כדי לחסן שפופרת צנטריפוגה 50 mL סטרילי המכיל 15 מ ל של טרי, סטרילי ATCC בינונית 712.
- מודסת את הצינור ב 30 ° צ' במשך 1 שבוע בזמן השקיעה ב 160 סל ד על שייקר רוטרי.
- לאחר שבוע, לספור את התאים אמבה באמצעות הומוציטוטומטר ולהתאים את מספר התא ל 1 x 107 תאים/mL עם טריים, סטרילי atcc בינוני 712.
- לבצע שיטת הכדאיות באמצעות הכתם הכחול כמפורט על ידי Strober18. המשיכו עוד עם התרבויות המציגות לפחות 80% יכולת הכדאיות.
3. כתמים פלואורסצנטית של תאים ללמוד phagocyציטוזה (השתנה מ-Madu et al. 15 )
- איסוף נתונים איכותניים באמצעות שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטית
הערה: יש לבצע את הדבר הזה עם מחאקאנאמבה ו -C. neoformans uofs 1378.- לוותר על 200-μL השעיה של אמבות סטנדרטיות (1 x 107 תאים/mL ב-atcc בינונית 712) לתוך בארות קאמרית של שקופית חסיד ו דגירה עבור 2 h ב 30 ° c עבור תאים לדבוק המשטח.
- בעוד תאים אמבה הם מתיישב כדי לדבוק, כתם מתוקננת C. neoformans Uofs Y-1378 תאים שהותאמו 1 x 106 תאים/ML (ב 999 μl של PBS) עם 1 μl של פלואורואסעין isothiocyanate ב שפופרת פלסטיק 1.5 mL.
הערה: הכינו את הכתם על ידי המסת 1 מ"ג של fluorescein isothiocyanate ב 1 מ ל של אצטון. - מתפרעים בעדינות את C. neoformans Uofs Y-1378 תאים על שייקר מסלולית להגדיר ב 50 rpm עבור 2 h ב RT ו בחושך.
- לאחר 2 h, צנטריפוגה ב 960 x g עבור 5 דקות ב 30 ° צ' כדי התאים גלולה.
- . להסיר את הערוץ עם הכתם
- הוסף 1 מ ל של PBS לצינור לשטוף את הגלולה תא. רוחצים את התאים על ידי ליטוף בעדינות.
- צנטריפוגה את התאים ב 960 x g עבור 5 דקות ב 30 ° c. . מחק את הסופרנטאנט חזור על השלב השוטף. עוד פעם אחת
- השהה מחדש את התאים הנשטפים. ב-100 מ ל של הערוץ
- מוותר על 200 μL השעיה של הוכתם C. neoformans Uofs Y-1378 תאים לבארות קאמרית המכיל את התאים אמבה הבלתי מוכתם.
- מודאת התרבות המוכנה ב -30 ° c לתקופה נוספת של 2 שעות.
הערה: ניתן לשלב את התרבות המשותף בנקודות זמן שונות בהתאם למטרת הניסוי. - בתום תקופת הדגירה השותפת, משבבת את תכולת הבארות.
- הוסף 300 μL של PBS אל הבארות כדי לשטוף את הבארות הקאמרית וכלה להסיר תאים מאוגדים משותפים. . תעשה את זה בעדינות . מחלק את תכולת הבארות חזור על השלב השוטף. עוד פעם אחת
- הכינו את התמיסה של 3% באמצעות הוספת 3 מ ל של גלוטארלדהיד ל 97 mL של מים מזוקקים.
- תקן את התאים שיתוף התרבותי על-ידי הוספת 250 μL של 3% פתרון לבארות קאמרית ו הדגירה עבור 1 h.
- מנושמים את הקיבעון ורוחצים את הבארות הקאמריים כמפורט משלב 3.1.13.
- לפרק את הבארות הקאמרית באמצעות כלי שסופק עם השקופיות הקאמרית.
- להוסיף טיפה של מתחם antifade, 1, 4-diazicy,-[2.2.2]-החזק את השקופית כדי למנוע הלבנת אוטומטית. מכסים עם שמיכות ולאטום את הצדדים עם לק ציפורניים כדי למנוע אידוי.
- להציג את התאים שיתוף תרבותי באמצעות עדשת היעד 100x (עם שמן) של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד-סריקת.
הערה: חשוב לצלם תמונות בשדה בהיר ובאמצעות קרינה פלואורסצנטית כדי להציג אינטראקציה בין תאי אמבה לבין הצפנה. הקרינה הפלואורסצנטית יכולה להיות. מוטלות על התמונות בשדה הבהיר תאים אמבה הם בדרך כלל גדולים יותר בגודל (כלומר, 45-60 μm), ואת התאים trophozoite יש צורה לא סדירה. תאים cryptococcal הם 5-10 יקרומטר בקוטר ולקבל בצורת globose כדי דמוי. כאשר הם חשופים ללייזר, ייתכן שתאי אמבה לא מוכתמים יכולים לפלוט אוטומטית באופן אוטומטי. התייחס לביקר ולדולבהן19 ו קלנסי ו-cauller20 עבור שיטות כדי להפחית את הקרינה האוטומטית.
- רכישת נתונים כמותיים באמצעות שימוש בקורא לוחית קרינה
הערה: יש לבצע את הערך הזה עם כלאקקואמבה ו -c. neoformans uofs 1378 או c. neoformans lmpe 046.- לוותר על 100 μL השעיה של מתקן אמבות (מותאם 1 x 107 תאים/ML ב atcc בינונית 712) לתוך שחור, חסיד 96 היטב microtiter לוחית.
- מודקת את הצלחת 2 h ב 30 ° צ' כדי לאפשר תאי אמבה לדבוק המשטח.
- בעוד תאים אמבה מתיישב לדבוק, כתם מתוקננת C. neoformans Uofs Y-1378 תאים שהותאמו 1 x 106 תאים/ML (ב 999 μl של PBS) עם 1 Μl של Phrodo ירוק Zymosan מאמרים בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. כתם C. neoformans lmpe 046 תאים גם בצינור נפרד.
הערה: הצבע, בניגוד fitc, כתמים בררנית תאים שנלכדו בתוך הסביבה חומצי של תא phagocytic21,22. עבור טכניקה זו, חשוב לשמור על התאים cryptococcal במדיום עם pH נייטרלי (PBS) ו אמבה במדיום עם pH נייטרלי (ATCC בינוני 712). בינונית עם סביבה חומצית תגרום לקריאה חיובית כוזבת של יחידות הזריחה היחסיות, ורומז כי מספר רב יותר של הצפנה הפנימו. - בעדינות מתפרעים תאים cryptococcal על שייקר מסלולית להגדיר ב 50 rpm עבור 2 h ב RT ו בחושך.
- לאחר 2 h, צנטריפוגה את שפופרת מיקרוצנטריפוגה ב 960 x g עבור 5 דקות ב 30 ° צ' כדי גלולה התאים. . להסיר את הערוץ הPBS עם הכתם
- הוסף 1 mL של PBS לצינור לשטוף את התאים מפלטד. שטפו את התאים בעזרת מלטף עדין.
- צנטריפוגה את התאים ב 960 x g עבור 5 דקות ב 30 ° c. . מחק את הסופרנטאנט חזור על השלב השוטף. עוד פעם אחת
- השהה מחדש את הגלולה של תאים שנשטפו ב-1 מ ל של PBS.
- מוותר על 100 μL השעיה של תאים cryptococcal מוכתם לבארות המכילות תאים אמבה לא מוכתם.
- מודאת התרבות המוכנה ב -30 ° c לתקופה נוספת של 2 שעות.
הערה: התרבות השותפת יכולה להיות מודערת לנקודות זמן שונות כדי להתאים למטרת הניסוי. - בסוף תקופת הדגירה המשותף, למדוד את הזריחה על קורא מיקרופלייט. המר אותות לוגריתמי ליחידות זריחה יחסית.
הערה: עירור של הצבע הוא ב 492 ננומטר ופליטה היא ב 538 nm. היוועץ בביקר ודולבהם19 וקלנסי וקולר20 לשיטות להפחתת הקרינה האוטומטית.
4. שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית לחקר פאיגוציטוזה (שונה מוואן ווינק ווינגפילד 23 )
- הוסף 5 מ"ל השעיה של אמבות (מותאם ל 1 x 107 תאים/ML ב atcc בינונית 712) לצינור הצנטריפוגה 15 מ"ל ולאפשר להם להתפשר על 30 דקות ב 30 ° c.
- הוסף 5 מ ל השעיה של C. neoformans Uofs Y-1378 תאים (מותאם 1 x 106 תאים/mL ב-PBS) לאותה צינורית צנטריפוגה המכילה 5 מ ל של תאים אמבה מתוקננת.
- אפשר לעמוד הרכבת התחתית ב -30 ° c.
- צנטריפוגה את הצינור ב 640 x g עבור 3 דקות ב 30 ° צ' כדי לצנפה את התאים השותפים בתרבית. . ומכה את הסופרנטאנט . אל תשטוף את התאים המתורבתות
- תקן את התאים שיתוף תרבותי על ידי השעיית הגלולה ב 3 מ ל של 1.0 M (pH = 7.0) נתרן פוספט באגירה 3% גלוטרלדהיד עבור 3 h.
- צנטריפוגה את הצינור ב 1,120 x g עבור 5 דקות ב 30 ° צ' כדי גלולה התאים שלנו תרבותי. . ומכה את הסופרנטאנט
- הוסף 5 מ ל של נתרן פוספט מאגר לצינור הצנטריפוגה כדי לשטוף את התאים הפלטאד. לשטוף בעדינות ללטף את תכולת הצינור עבור 20 s.
- צנטריפוגה את הצינור ב 1,120 x g עבור 5 דקות ב 30 ° צ' כדי גלולה התאים שלנו תרבותי.
- חזור על שלבים 4.8-4.10. . ומכה את הסופרנטאנט
- תקן את התאים שיתוף התרבותי שוב על ידי השעיית הגלולה ב 3 מ ל של 1.0 M (pH = 7.0) נתרן פוספט באגירה 1% אוסמיום tetroxide עבור 1.5 h.
- הסר את התיקונים (osmium tetroxide) על ידי שטיפת תאים שיתוף תרבותי באופן דומה להסרת 3% גלוטרלדהיד.
- מייבשים את החומר TEM (הידוע גם כתאים שיתוף תרבותי) בסדרה מדורגת של 30%, 50%, 70%, 95% ושני שינויים של 100% עבור 15 דקות כל אחד, בהתאמה. כדי לעשות זאת, להוסיף 3 מ ל של פתרון אצטון לתאי מפלטד ולתת לו לעמוד 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב-RT להיפטר supernatant ולהוסיף את אחוז גבוה יותר של פתרון אצטון.
- הכינו את האפוקסי של עקביות נורמלית בהתאם לפרוטוקול באמצעות השלוחה24.
הערה: שרף האפוקסי משמש להענשת האתרים. - להטביע את החומר TEM לתוך שרף אפוקסי שהוכן טרי. לשם כך, בצע את השלבים שלהלן.
- הוסיפו 3 מ ל של אפוקסי המוכן טרי לצינור המכיל את חומר TEM מחדש ב 3 מ ל של 100% תמיסה של אצטון. . הניחו לצינור לעמוד בעוד 1 שעות
- צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 10 דקות ב 30 ° c. . ומכה את תמיסת האפוקסי-אצטון
- הוסיפו 6 מ ל של אפוקסי המוכן טרי לגלולה שבצינור. . הניחו לצינור לעמוד בעוד 1 שעות
- צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב 30 ° c. מנושף את כל התמיסה. של האפוקסי-אצטון
- הוסיפו 3 מ ל של אפוקסי המוכן טרי לצינור. . הניחו לצינור לעמוד 8 שעות
- צנטריפוגה ב 200 x g עבור 10 דקות ב 30 ° c. מנושף את כל תמיסת האפוקסי
- הוסיפו 3 מ ל של אפוקסי המוכן טרי לצינור. לשמור את החומר TEM בתמיסה האפוקסי לילה בdesiccator ואקום.
התראה: שרף אפוקסי הוא חומר רדיואקטיבי. השתמש ב-PPE כדי לטפל שרף אפוקסי. יש לטפל גם בשרף האפוקסי בתוך מכסה המנוע. החוקרים צריכים לעקוב אחר תקנות בטיחות להשליך חומר כזה כפי שצוין על ידי כל מדינה25.
- החומר לצורך המשך 8 שעות ב70 ° c.
- על ultramicrotome, לקצץ קטעים קטנים של כ 0.1 מ"מ x 0.1 מ"מ ו 60 בעובי ננומטר מחומר אפוקסי מוטבע עם סכין זכוכית רכוב. להרכיב מקטעים על רשת ולמקם את הרשתות בתיבת מחזיק לדוגמה TEM לפני כתמים.
- כתם את הסעיפים עם טיפה של 6% uranyl אצטט עבור 10 דקות בחושך. ודא שהסעיפים מכוסים לחלוטין. |
הערה: מרכיבים מחדש את הכתם (6 גר') ב-100 mL של מים מזוקקים.
התראה: Uranyl אצטט הוא חומר רדיואקטיבי. השתמש ב-PPE כדי לטפל באצטט uranyl. גם אצטט uranyl צריך להיות מטופל בתוך מכסה. החוקרים צריכים לעקוב אחר תקנות בטיחות להשליך חומר כזה כפי שצוין על ידי כל מדינה25. - לשטוף מקטעים על ידי טבילה חמש פעמים לתוך גביע המכיל 100 mL של מים מזוקקים.
הערה: מים מזוקקים צריך להיות מושלך בהתאם, כפי שהוא מכיל שאריות של אצטט uranyl. - הכתם את החלק עם טיפת עופרת ציטראט במשך 10 דקות בחושך. ודא שהסעיפים מכוסים כליל.
הערה: יש להכין ציטראט עופרת בהתאם לפרוטוקול של ריינוld26. - לשטוף מקטעים על ידי טבילה חמש פעמים לתוך גביע המכיל 100 mL של מים מזוקקים.
- הכנס בנפרד את הרשתות עם חלקים מוכתמים בתיבת מחזיק לדוגמה של TEM.
- הצגת מקטעים עם מיקרוסקופ אלקטרוני שידור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חיידקים הם אורגניזמים מיקרוסקופיים שאי אפשר להיתפס עם עין בעירום. עם זאת, ההשפעה שלהם עלולה לגרום למחלות קליניות מובנת, כגון דלקות עור. כאשר לומדים היבטים מסוימים של חיידקים, החל מורפולוגיה שלהם, תוצרי לוואי ואינטראקציות, להיות מסוגל לספק ראיות ציורית ווידאו הוא בעל חשיבות עליונה.
אנחנו הראשונים שחיפשנו לדמיין את האינטראקציה בין תאים cryptococcal ו אמבה. למטרה זו, תמונות בשדה בהיר שהראה 2 שיתוף התאים שכונתיות נחקרו הראשון. תמונה אחת חשפה תא קריפטוקוקו שהיה בקרבת אמבה. אחד התאים אמבה נראה עם פסבדו מורחב כדי ללכוד תא cryptococcal (איור 1A). לאחר מכן, תמונה תואמת של הקרינה הפלואורסצנטית נלכדה להפניה (איור 1B). הזריחה הירוקה על פני התאים המוכתמת סייעה באישור הימצאות תאים cryptococcal. האמבה הבלתי מוכתמת. גם אוטומטית באופן אוטומטי זה, בנוסף לגודל ההבדל לכאורה מורפולוגיה, בסיוע נוסף להבחין שני סוגי תאים.
פלואורסצנטית אוטומטי היא תכונה שנצפתה לעתים קרובות כאשר מבנים ביולוגיים באופן טבעי פולטים אור כי הם ספגו (למשל, בעקבות חשיפה לייזר במהלך מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית)27. באיור 1C, התאים הcryptococcal צוינו (באותה נקודת זמן של 2 שעות) שכבר הפנימו על ידי אמבה. התמונה המקבילה של הקרינה הפלואורסצנטית גם נלכד לקראת התייחסות (איור 1D). בהתבסס על הראיות בהישג יד, מפתה להסיק כי אמבה הרג את שני תאים לכודים. עם זאת, phagocyציטוזה הוא תהליך דינמי שבו המארח, טורף ופתוגן, וטרף להעסיק אסטרטגיות שונות כדי להרוס או להתחמק אחד את השני28. הפעולה של תאים cryptococcal התחמקות תאים phagocytic הוא הפגינו באלגנטיות על ידי vomלוציציטוזה29,30, שהוא תהליך גירוש ללא ליטיק של תאים לכודים מקרופאגים. מהלך נועז זה נתפס בקטעי וידאו הזמן פקיעה29,30. למרבה הצער, זה מדגיש את המגבלה של לימוד תמונות סטילס של תאים קבועים, כמו במחקר שלנו, כדי להבהיר תהליך דינמי כמו phagocyציטוזה. עד הנקודה, החוקר עלול להחמיץ את המרווח כאשר תא נמלט מן הקפילו שלו.
כדי לפצות על האמור לעיל, הקריאה של יחידות זריחה יחסית נחשבה. במחקר הנוכחי, קריאות צולמו לאחר התקופה 2 h שיתוף הדגירה ועזר להשוות את התגובה של שני זנים cryptococcal במבחן [i.e., אחד שמייצר חומצות שומן 3-הידרוxy (c. neoformans uofs 1378) והשני שאינו (c. 046)]. זה היה שיערו כי 3-הידרוxy חומצות שומן עשוי לפעול כגורם התקפה אלימה כי לפגוע ספיגה של תאים cryptococcal, כולל phagocyציטוזה על ידי אמבה. לקבלת מידע נוסף על ההשפעה של חומצות שומן הידרורוקסי 3 על אמבה, מומלץ להפנות אל madu et al.15,31. איור 2 מציג את כמות תאי הקריפטוקותא שפנימו על בסיס הקריאה של יחידות הזריחה. כאשר משווים את שני מבודד cryptococcal, היה ברור כי תאים המייצרים חומצות שומן 3-הידרוxy הפנימו לעתים קרובות לתאים שאינם מייצרים 3-הידרוxy חומצות שומן.
כדי לשפר את הנתונים האיכותניים, המיקרוסקופיה האלקטרונית הייתה כלולה בניתוח (איור 3A). כאן, ציין כי המתח המייצר 3-הידרוxy חומצות שומן (כ. neoformans Uofs Y-1378) היו בליטות מחודדים על הקפסולה (איור 3b), אשר עשוי לשמש את התא כדי לשחרר 3-הידרוxy חומצות שומן לסביבה החיצונית.
חשוב לציין כי הנתונים ( באיור 1, איור 3) להעביר את גורלם של תאים cryptococcal כמו להיות הפנפו ולא להיהרג/phagocytized. כדי לקבוע אם התאים שרדו את האירוע phagocytic, מומלץ לכלול מינון נוסף שבו החוקר ליסס את התאים אמבה ומכין צלחת הכפולה אגר כדי לספור את המושבה cryptococcal היוצרים יחידות (CFU). על ידי ספירת CFUs, Madu et al.15 דיווח כי התאים cryptococcal לייצר 3-הידרוxy חומצות שומן היו גם עמידים לפעולה phagocytic של אמבה לאחר הפנמה. כך, תאים אלה הניבו שיעור הישרדות גבוה באופן משמעותי בהשוואה לתאים שאינם מייצרים 3-הידרוxy חומצות שומן.
איור 4 מראה את חשיבותו של הכנה לדוגמה TEM ובדיקה. במקרה זה, מקטעים שנעשו בשנת 1378. בסופו של דבר, לא ניתן להשתמש בתמונה שנלכדה, מכיוון שהיא פוגעת באיכות המידע שניתן להסיק. יחד, המידע המתקבל מראה כי על ידי שילוב טכניקות שונות אלה, חוקר הוא מסוגל להסיק מידע מספיק כדי לקבוע את גורלם של תאים cryptococcal כאשר שותף תרבותי עם אמבה.
| מרכיב | כמות |
| פנימה בקטיוולוגית | 20 גר'/ליטר |
| תמצית שמרים | 10 גר'/ליטר |
| גלוקוז | 20 גר'/ליטר |
| אגר | 15 גר'/ליטר |
טבלה 1: מרכיבים לעשיית YPD אגר. להוסיף את הסכום הנדרש את כל המרכיבים ב 1 L של מים. חום תוך כדי ערבוב לפזר את החומרים לחלוטין. פעם נעשה החיטוי לפני השימוש.
| מרכיב | כמות |
| מלחת | 5 גר'/ליטר |
| ביוטין | 2 μg/L |
| סידן פנטאט | 400 μg/L |
| חומצה פולית | 2 μg/L |
| אינוזיטול | 2000 μg/L |
| ניאצין | 400 μg/L |
| פ-אמינבאנאיקון | 200 μg/L |
| pyridoxine הידרוכלוריד | 400 μg/L |
| ריבופלאווין | 200 μg/L |
| ויטמין הידרוכלוריד | 400 μg/L |
| חומצה בורית | 500 μg/L |
| נחושת גופרתית | 40 μg/L |
| אשלגן יודיד | 100 μg/L |
| מיכל כלוריד | 200 μg/L |
| מנגן סולפט | 400 μg/L |
| נתרן molybdate | 200 μg/L |
| אבץ סולפט | 400 μg/L |
| מונואוטאסייום פוספט | 1 גר'/ליטר |
| מגנזיום גופרתי | 0.5 ג'/ליטר |
| נתרן כלוריד | 0.1 ג'/ליטר |
| סידן כלוריד | 0.1 ג'/ליטר |
טבלה 2: מרכיבים להכנת ציר YNB. להוסיף את הסכום הנדרש את כל המרכיבים ב 1 L של מים. חום תוך כדי ערבוב לפזר את החומרים לחלוטין. פעם נעשה החיטוי לפני השימוש.
| חלק I: בינונית בסיס. | |
| מרכיב | כמות |
| פנימה פרוטז | 20 גר'/ליטר |
| תמצית שמרים | 1 גר'/ליטר |
| אגר (אם יש צורך) | 20 גר'/ליטר |
| חלק ב': תוספי מזון. | |
| מרכיב (פתרונות מניות) | כמות |
| 0.05 מ ל2 | 8 מ ל |
| 0.4 מ ר4 x 7h2O | 10 מ ל |
| 0.25 M נה2hpo4 x 7h2O | 10 מטר |
| 0.25 M KH2פו4 | 10 מ ל |
| מבנה ציטראט x 2H2O | מיכל הג |
| 0.005 M Fe (NH4) 2 (SO4) 2 x 6h2O | 10 מ ל |
שולחן 3: החומרים להכנת ATCC בינוני 712. הכינו את המדיום הבסיס ב-900 מ ל של מים. הכינו את התוספים בנפרד והוסיפו למדיום הבזלי. פעם עשיתי להתאים את ה-pH כדי 7.4 עם 1 N HCl או 1 N NaOH ו החיטוי. מסנן לעקר 50 mL של 2 M גלוקוז (18 גרם/50 mL) ולהוסיף אותו aseptically כדי המדיום השלם לפני השימוש.
איור 1 : שדות בהירים ומיקרוגרפים פלואורסצנטי מתאים להצגת רגעים אינטראקטיביים של אמבה-קריפטוקוקוס . (א) תא אמבה בסמיכות ל C. neoformans uofs Y-1378 ניתן לראות תא. תמונת הפלורסנט המתאימה מוצגת ב (ב). (ג) תיאור של שני C. neoformans uofs Y-1378 תאים הלכודים בתוך מזון אמבה ולבן. תמונת הפלורסנט המתאימה מוצגת ב (ד). דמות זו שונתה מ-Madu et al.15. A = אמבה; . בסדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : התוצאות של הסדר הפנמה של תאים cryptococcal שיתוף תרבותי עם אמבה. הקריאה של יחידות הזריחה היחסית מאפשרת את הפרשנות וההשוואה של היעילות של אמבות להפנים את המין הטוב ביותר ב -046 1378. קווי השגיאה מייצגים את השגיאות הסטנדרטיות המחושבות בהתבסס על שלושה משכפל ביולוגי. דמות זו שונתה מ-Madu et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : שידור אלקטרון מיקרוגרפים מראה אמבה- קריפטוקוקוס אינטראקציות. TEM מיקרוגרפים(א, ב) לאשר את התצפיות באיור 1 ג, ד. (א) המוצג הוא C. neoformans uofs Y-1378 תא לכוד בתוך מזון אמבה ולאחר מכן (ב) היא תצוגה מקרוב של איור 3a . דמות זו שונתה מ-Madu et al.15. A = תא אמבה; . תא מספרי . החץ האדום מצביע על. הקופסית הערמונית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : מיקרוגרף אלקטרון שידור מראה ג. נאופורמנים -1378 תאים. התאים פגומים ולכן אינם יכולים לספק נתונים משמעותיים. חיצים אדומים מציינים נקודות שבהן המקטע נקרע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעיתון, טכניקות שונות המועסקים בהצלחה כדי לחשוף את התוצאה האפשרית שעלולים להתעורר כאשר אמבה אינטראקציה עם תאים cryptococcal. כמו כן, היינו מעוניינים להראות את ההשפעות של חומצות שומן 3-הידרורוקסי על התוצאה של אינטראקציות של הקריפטוקוקוס-אמבה.
הטכניקה הראשונה שהייתה בשימוש היתה מיקרוסקופית מוקד, אשר הייתה עדיין בתמונות. החיסרון העיקרי של טכניקה זו היה כי זה נתן לנו רק מידע כי הוא מוגבל לנקודת זמן מסוימת. כל מסקנה שיכולה להיות מצוירת על בסיס התוצאות משאיל את עצמה לחשיבה אינדוקטיבית, שבה ניתן להגיע למסקנה המבוססת על סט של תצפיות32. עם זאת, רק בגלל שמישהו מתבונן במספר מצבים בהם התבנית קיימת, אין פירושו שדפוס זה נכון לכל המצבים. לפיכך, במחקר, הוא מוצג ואולי הזהיר כיצד מידע מוגבל כזה עלול להביא למסקנות לא מבוססות. לעניין, בהיעדר ראיות סותרות או תומכות, משלימות, ניתן להסיק כי הפנמה אולי הובילה את הפגוציטוזה של תאים.
קצב ההתפתחות בהדמיה מביא הזדמנויות חדשות ליצור תגליות מדעיות, כפי שקרה בגילוי של vomסוציציטוזה29,30. כדי להמחיש נקודה זו ללא שימוש במיקרוסקופ שיכול להקליט קטעי וידאו בזמן, גילוי זה לא היה אפשרי. לפיכך, היעדר גישה למכשור איכותי כזה יהיה תמיד מכשול במסגרות עניות-הגדרות שאינן בחזית הגילוי של תהליכים כאלה. דרך אחת להתגבר על זה היא לחפש שיתופי פעולה חדשים או לגלות דרכים חדשניות לטיפול בשאלות מחקר. אחד הפיתוח הברכה כבר המבוא ויישום של כתמים מיוחדים כגון הכתם phagocytic משמש כאן21,22. הכתם הזה הוא pH-רגישות ו זוהר רק בסביבות חומצה כגון בתוך לומן של מזון של בולי המזון של אמבה15. כדאי לציין כי הכתם רק נותן מידע הקשור הפנמה של תאים. קביעה אם התאים הם בסופו של דבר במהלך ניסויים נוספים ניתן לדרוש.
וחשוב מכך, כתם כזה גם הוכח להיות שימושי במדידה של זריחה. האחרון איפשר שילוב של נתונים כמותיים בניסיון להסביר מה קורה ביולוגית בנקודת זמן ספציפית אחת. כאן, גורלם של התאים הובחנו (כלומר, נקבע אם הנוכחות של חומצות שומן הידרורוקסי לקויה או לקדם את הפנמה של תאים) על-ידי הפחתה במשמעות הקריאות של יחידות הזריחה היחסיות.
בניגוד למחקר זה, החוקרים עשויים גם לבחור למדוד את הזריחה של תאים על פני תקופה. המידע המתקבל שימושי לקביעת מספר התאים המופנמו בנקודת זמן אחת ולאחר האופן שבו הסכום משתנה בתקופה. כמו כן, ניתן לקחת תמונות גם בנקודות זמן מתאימות.
מחקר זה מראה את העוצמה של שילוב מספר שיטות כדי להגיע למסקנה מנומקת. הגישה של שילוב גישות מרובות כדי לפקח על phagocyציטוזה או להשוות או להשלים טכניקה ראשונית אינה חדשה. לדוגמה, מיוד"ל ועמיתים לעבודה33 השוו בין שלוש טכניקות (ניתוח תמונה, זריחה וזרימה cy, והזרמת החומר) כדי לחקור כיצד גודל החלקיקים מתויג על ידי קרינה פלואורסצנטית משפיע מקרופאג phagocyציטוזה. המחקר הוכיח כי של שלוש טכניקות, הקריאה צלחת יכול להיות האפשרות הטובה ביותר כדי לפקח על phagocyציטוזה33.
TEM הוא במיוחד כלי רב עוצמה, כפי שהוא מספק את ההשקפה של הציפור לתוך לומן של המזון ולבן. לעתים קרובות, רמת הפירוט הזאת מחמיצה לעתים קרובות את המיקרוסקופיה בצורה של תמונות סטילס, כולל קטעי וידאו של פקיעה בזמן. עד לנקודה זו של ה-TEM, היה מעניין להמחיש את ההפרוסים על משטחי הקפסולה הcryptococcal. זה היה בעבר שיערו כי אלה מבנים תא תאים משמשים כערוץ לשחרר 3-הידרוxy חומצות שומן לסביבה הסובבת אולי לקדם הישרדות התא9,10,15, 31. הפרטים על המיקרוגרף TEM מציינים עוד כי הבליטות על התאים הפניאית אינן מעוותות ושמרו על שלמות. לפיכך (בהתחשב בשלמות הפרוטוברסים), יתכן כי הם יכולים לספק 3-הידרוxy חומצות שומן לסביבת המזון ולשנות את התנאים הפנימיים, המוביל להישרדות תאים כפי שדווח על ידי madu et al.15,31. הגבלה מרכזית של שימוש במיקרוסקופ אלקטרון היא כי ההכנה לדוגמה היא מפרך מאוד. יתר על כן, כדי למנוע השמדת דגימות כפי שניתן לראות באיור 4, הניסויים צריך להיות מיומן היטב כדי להפעיל ידנית את מיקרוסקופ ואת המיקרוסקופ.
לסיכום, זה נראה כי החוקרים יהיו מעודדים על ידי האפשרות של חקר phagocyציטוזה פשוט על ידי שילוב תמונות פלורסנט עדיין עם נתונים כמותיים. הוא מהימן כי החוקרים יכולים להשיג מספיק מידע מפרוטוקול זה ולמטב אותו במחקרים שלהם. זה עשוי לכלול את ההתפתחות של נוגדנים נגד מטבוליטים ממוקדות וליישם את זה למחקרים immunofluorescence כולל התוויות החיסונית-זהב במהלך בדיקת TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
העבודה נתמכת על ידי מענק מקרן המחקר הלאומי של דרום אפריקה (מספר המענק: UID 87903) והאוניברסיטה של המדינה החופשית. אנו גם אסירי תודה לשירותים ולסיוע המוצעים על ידי פיטר ואן ווינק והנלי גרובלר במהלך לימודי המיקרוסקופיה שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
