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Chemistry

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

Published: April 12, 2019 doi: 10.3791/58744
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Este artículo presenta un protocolo detallado para ligadura de T4 y desnaturalización página purificación de moléculas pequeñas de ADN circular, recocido y del análisis de la página nativa de Tejas circular, montaje y proyección de imagen de AFM de nanoestructuras de ADN de 1D y 2D, así como de agarosa gel purificación de electroforesis y centrifugación de nanoestructuras de ADN finito.

Abstract

Este artículo presenta un protocolo detallado para la síntesis de pequeñas moléculas de ADN circular, recocido de circular motivos de ADN y la construcción de nanoestructuras de ADN de 1D y 2D. Durante décadas, el rápido desarrollo de la nanotecnología de ADN se atribuye al uso de DNAs lineales como los materiales. Por ejemplo, el azulejo DAO (doble cruce, antiparalelos, impares de medias vueltas) es conocido como un bloque de construcción para la construcción de enrejados de ADN 2D; la estructura base del DAO se hace de dos oligonucleótidos lineal monocatenario (ss), como dos cuerdas haciendo un nudo de la abuelita de mano derecha. Aquí, un nuevo tipo de azulejos de ADN llamado cDAO (DAO acoplado) se construyen utilizando una pequeño ss-DNA circular de c64nt o c84nt (circular 64 o 84 nucleótidos) como el filamento de andamio y varios ss-DNAs lineales como las hebras discontinuas. Perfectos Nanoestructuras 1D y 2D son ensamblados de azulejos cDAO: infinito nanohilos, nanotubos, nanospirals, nanoribbons; y nano-rectángulos finitos. Protocolos detallados se describen: 1) preparación por T4 ligasa y purificación desnaturalizando PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) de oligonucleótidos circular pequeño, 2) recocido de Tejas circular estables, seguido por análisis de la página nativa, montaje de 3) de infinito 1D nanohilos, Nanoanillos, nanospirals, infinitos 2D enrejados de nanotubos y nanoribbons nano-rectángulos finitos de 2D, seguido de proyección de imagen de AFM (microscopía de fuerza atómica). El método es simple, robusto y asequible para la mayoría de laboratorios.

Introduction

Las moléculas de ADN se han utilizado para construir muchos tipos de nanoestructuras en décadas. Motivos típicos incluyen DAE (doble cruce, antiparalela, incluso medias vueltas) y DAO azulejos1,2,3, azulejos estrellas4,5,6,7, trenzado (ss) azulejos8,9,10y ADN origami11,12,13. Estos motivos de ADN y los enrejados están montados de ss-DNAs lineales. Recientemente, otros ya hemos divulgado el uso de oligonucleótidos de ss circular como andamios para construir motivos, nanotubos de 1D y 2D enrejados14,15,16,17. Insertando un Holliday junction (HJ)18,19,20,21 en el centro de c64nt, un par de dos azulejos DAO acoplados puede ser formado17. Este nuevo motivo cDAO y sus derivados son estables y lo suficientemente rígido para montar 2D ADN enrejados hasta 3 × 5 μm2. En este trabajo, utilizamos un término de "mosaico circular", que se define como una estable molécula compleja de DNA construida con un andamio circular y otras grapas lineales de oligonucleótidos de ss, y otro término de "mosaico lineal", que se construye a partir de un conjunto completo de lineal SS-oligonucleótidos.

Este protocolo muestra cómo crear cinco tipos de nanoestructuras de ADN con pequeñas moléculas circulares de ADN como andamios: 1) infinita nanohilos de c64nt y c84nt D 1, 2) infinito 2D cDAO-c64nt-O y cDAO-c64nt-E (-O representa un número impar de 5 medias vueltas y -E representa un número par de 4 medias vueltas) enrejados, 3) infinitos 2D cDAO-c84nt-O y cDAO-c84nt-E enrejados, 4) finito 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O y 5 × 6, rectángulos cDAO-c74 & 84nt-O, 5) infinito 1D Nanoanillos de acDAO-c64nt-E y nanospirals (refiera por favor a Figura 3-5 para los dibujos esquemáticos y las imágenes de los anteriores cinco tipos de nanoestructuras de ADN). El 1D c64nt y c84nt los nanohilos se ensamblan desde cada andamio c64nt y c84nt asociado con dos grapas lineales respectivamente. Cada loseta circular de cDAO-c64nt, c64nt de acDAO, cDAO-c74nt o cDAO-c84nt es templado de su andamio correspondiente de c64nt, c74nt o c84nt con cuatro grapas lineales respectivamente. Los enrejados 2D infinitos se montan con el mismo tipo de dos fichas circulares con diferentes secuencias. Los dos enrejados de rectángulo 2D finito se montan de dos conjuntos de sub-fichas circular 32 respectivamente. Para ahorrar dinero, c84nt, c74nt y c64nt sólo una-secuencia se utiliza como el andamio respectivo y diferentes voladizos se recuece el 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt y circular baldosas sub 20 cDAO-c84nt respectivamente en el primer paso del recocido de las baldosas, luego mezclar las sub-fichas circular 32 correspondientes y aplicar el segundo enrejado recocido paso para montar el cDAO de finitas 5 × 6-c64nt-O y 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O enrejados, respectivamente. Definitivamente, andamios circulares ordenados de manera diferente pueden ser adoptados para montar una variedad de nanoestructuras de tamaño finito, sin embargo costará más dinero y trabajos. El infinito 1D acDAO-c64nt-E Nanoanillos y nanospirals son recocido de Tejas una secuencia asimétrica acDAO-c64nt con conexiones lineales de un número par de 4 medias vueltas. Existen dos enfoques para armar enrejados 2D infinitos de azulejos circulares de cDAO-c64nt y cDAO-c84nt, que se distinguen por las distancias intertile de un número par de 4 y un número impar de 5 medias vueltas respectivamente. El primero requiere que todas las fichas para ser alineados idénticamente; Este último requiere alternancia de las caras de dos fichas vecinas a lo largo de los ejes helicoidales. Si el azulejo es rígido y planar, como cDAO-c64nt, ambos enfoques generará nanoribbons planar; Si la teja es curva hacia una dirección, como cDAO-c84nt, la conexión intertile de un número par de 4 vueltas media generará nanotubos, mientras que la conexión intertile de un número impar de 5 vueltas media producirá nanoribbons planar debido a la eliminación de crecimiento sesgado de curvatura por alineación alterna de teja curva. La exitosa asamblea de nanoestructuras de ADN de 1D y 2D de azulejos circular indica varias ventajas de este nuevo enfoque: forzada estabilidad y rigidez de circular azulejos sobre azulejos lineales, azulejos quirales para montaje de nanoestructuras asimétrico como Nanoanillos y nanoribbons, nuevas visiones en la comprensión de la mecánica de ADN y las estructuras moleculares, etcetera.

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Protocol

1. preparación de DNAs circulares

  1. Utilice todas DNAs lineales proporcionadas por las empresas comerciales directamente sin una posterior purificación.
  2. Las muestras de ADN a 5.000 x g durante 5 minutos recoger todos los gránulos de ADN en la parte inferior de los tubos de centrífuga. Añadir un volumen adecuado de tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) para disolver el ADN.
  3. Medir la concentración de "a" ng/μl de cada solución de ss-DNA usando un micro espectrómetro de UV a 260 nm. Convertir "un" ng/μl a μm "b" después de b = a × 103 / (peso molecular de la DNA del filamento). Ajustar la cantidad de solución de TE para hacer una solución madre ADN a 10 μm.
  4. Uso de T4 ADN ligasa para conectar los extremos 3' y 5' de 5'-fosforilados lineales plantillas de la DNA ( figura 1) de c64nt, c74nt y c84nt proporcionada directamente de las empresas comerciales.
  5. Mezclar la hebra de ADN lineal 5'-fosforilados (3,5 μm) y su correspondiente férula filamento de la DNA (4,5 μm) en 80 μl de tampón TE en 200 μL PCR tubo de prueba15. Incubar el tubo en una botella abierta termo llenado de agua de 95 ° C. Enfriar el agua caliente a temperatura ambiente (25 ° C) durante unos 2-3 horas bajo la atmósfera del laboratorio.
  6. Añadir 10 μl de tampón de x T4 10 (660 mM Tris-HCl, 66 mM de MgCl2, 100 mM DTT, ATP de 1 mM) y 10 μl de T4 ligasa (300 U/μL) a la mezcla hasta un volumen final de 100 μl. Incube la mezcla en un termociclador durante 16 horas a 16 ° C.
    Nota: Las anteriores concentraciones de DNA y reacción volumen de ~ 100 μl se optimizan para la eficacia de la ligadura alta y el alto rendimiento de ciclización correcto oligo-monómero. Ejecute dos o más tubos de reacciones de ligadura en el mismo tiempo según el diseño experimental. Un procedimiento alternativo de incubación para paso reemplazando la ligadura 1.6 es 4 horas a 25 ° C.
  7. Después de la incubación, inactivar la ligasa de T4 en agua de 95 ° C por 5 minminutes. Luego transferir el tubo a un baño de agua helada e incubar durante 5 minutos para enfriar.
  8. Añada 10 μl de 10 x exonucleasa buffer y 10 μl de exonucleasa I (5 U/μL) de la mezcla de Temple e incubar el tubo a 37 º C en un baño de agua durante 30 min para selectivamente digerir las DNAs lineales restantes y dejar intacto el ADN circular.
  9. Preparar un gel página la desnaturalización del 10%.
    1. Use gafas protectoras y guantes de goma al preparar el gel de la página en la campana. Añadir a 6,67 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida 30% (p/v) (19:1), 2 mL de 10 x TAE· Tampón de mg (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8,0, 12.5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g de urea (7 M) y agua desionizada hasta un volumen final de 20 mL en un tubo de centrífuga de 40 mL.
      PRECAUCIÓN: La solución de acrilamida/bisacrilamida solución (19:1) 30% (p/v) es tóxica.
    2. Añadir 20 μl de tetramethylethylenediamine (TEMED) y 100 μl de persulfato de amonio (APS, 10% w/v) a los 40 mL del tubo antes de la transferencia la solución gel al sistema electroforesis inmediatamente. Inserte un 1,5 mm de espesor y peine de 10 pozos. Espere por lo menos 20 minutos hasta que la solución gel se solidifica.
    3. Establece una tensión constante de 80 V para un gel de 85 × 80 × 1,5 mm3 (anchura × altura × espesor). Añadir 1 TAE· x Mg de búfer en el sistema de electroforesis y prerun el gel por 20 min a 10 V/cm.
  10. Poner el tubo de ensayo PCR de paso 1.8 en 95 ° C agua durante 5 minutos inactivar la exonucleasa I. Luego transferir el tubo a un baño de agua helada e incubar durante otros 5 minutos.
  11. Añadir 20 μl de formamida en el tubo a un volumen final de 140 μl y mezclar la solución. Distribuir bien la solución a 7-9 pozos de gel de desnaturalización página igualmente con 16-20 μl para cada gel. Mezcle 2 μl de colorante (azul de bromofenol 0.05%, 0.05% xileno cyanol FF, 60% glicerol, 10 mM Tris-HCl 60 mM EDTA, pH 7,6) con 8 μl del ADN lineal correspondiente precursor de carga (10 μm) e inyectar la mezcla a un pozo separado para referencia.
    Nota: La adición de formamida es aumentar la densidad de la solución de carga para hundirse hasta el fondo del gel página bien y también disociar algunas doble trenzado de restos de ADN.
  12. El gel para aproximadamente 2 horas a 10 V/cm y dejar de correr cuando cyanol xileno FF en la posición 2/3 de la placa de cristal con el ojo desnudo.
  13. Use guantes de goma y gafas protectoras para proteger piel y ojos. Tomar el gel de la placa de vidrio. Coloque el gel en una placa fluorescente de TLC (cromatografía en capa fina). Cortar las bandas de gel blanco de una hoja de afeitar tan exactamente como sombra por la irradiación UV (figura 2).
    PRECAUCIÓN: La luz ultravioleta es nociva para ojos y pieles.
    Nota: Bajo irradiación UV a 254 nm, ADN absorben la luz y proyectan una sombra sobre la placa de TLC. El ADN circular funcionó un poco más lento que su correspondiente ADN lineal de precursor. Algunos sin digerir DNAs lineales y DNAs circulares no deseados en pequeñas cantidades que rodean la banda de blanco sombreado contaminará el ADN circular si se recogen.
  14. Transferencia de las bandas de gel en un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL. Aire seco o golpe seco las bandas de gel y luego puré los geles en una pasta por una espátula o varilla de vidrio aplanado. Asegúrese de que el gel ha sido totalmente aplastado en una pasta, que es fundamental para el alto rendimiento de ADN circular. Agregue dos veces del gel desionizada agua en el tubo y agitar el tubo a temperatura ambiente durante la noche.
  15. Filtrar la mezcla para recoger el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL. Recuperar cualquier ADN residual enjuagando con el pequeño volumen de agua desionizada y filtro nuevo para combinar los sobrenadantes.
  16. Extraiga el eluyente con igual volumen de n-butanol. Repita este procedimiento hasta que el volumen acuoso se reduce a cerca de 200 μl.
  17. Añadir 500 μl de etanol absoluto (−20 ° C) y 20 μl de 3 M de NaOAc (pH 5.1) a la mezcla para la precipitación del ADN. Guarde el tubo a −20 ° C por 30 min.
  18. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante. El precipitado de ADN restante es cerca de 100 μL en el tubo.
  19. Añadir 600 μl de etanol 75% (−20 ° C) al tubo y guardarlo a −20 ° C por 30 min. Luego centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante. El precipitado de ADN restante es solución aproximadamente 100 μL en el tubo otra vez. Repita el procedimiento dos veces.
  20. Después de la última centrifugación, descartar el sobrenadante tanto como sea posible. Seque los restos con un concentrador de vacío.
  21. Tienda la circular DNA purificado en el tubo a −20 ° C.
  22. Resuspender el ADN circular en tampón TE hacen un 10 μm circular ADN solución según paso 1.3 cuando sea necesario.

2. recocido de soluciones de montaje

  1. Preparar cada azulejo o en nano-estructural solución de montaje de c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, c64nt de acDAO, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt y acDAO-c64nt-E con un sistema diseñado de DNAs lineales y circulares para recocido de una olla.
    1. Para cada solución de montaje, se mezclan 2 μl de 10 x TAE· Almacenador intermediario de la mg, 1 μl de cada solución madre de ADN de un conjunto de filamentos lineales y circulares en relaciones molares igual, adicional TE tampón y en un tubo de ensayo PCR de 200 μL para una concentración final de cada hilo de 0,5 μm y un volumen final de 20 μl. Recueza la solución de montaje en una termo botella de 95 ° C a 25 ° C durante 48 h.
  2. Preparar cada solución de ensamblaje de enrejados infinitos 2D de cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E y cDAO-c84nt-O con un sistema diseñado de DNAs lineales y circulares para dos etapas de recocido.
    1. Preparar cada solución precursora azulejo sub montaje mezclando 2 μl de 10 x TAE· Almacenador intermediario de la mg, 1 μl de cada solución madre de ADN de un conjunto de filamentos lineales y circulares en relaciones molares igual, adicional TE tampón y en un tubo de ensayo PCR de 200 μL para una concentración final de 0,5 μm de cada filamento y un volumen final de 20 μl. En el primer paso de recocido sub-azulejo, Recueza cada solución precursora de los azulejos en un termociclador PCR utilizando un método de enfriamiento rápido lineal de 95 ° C a 25 ° C durante 2,5 h.
    2. Preparar cada solución de montaje de los anteriores cuatro enrejados infinitos mezclando 10 μl de cada una de las dos soluciones de azulejo sub correspondiente a una concentración final de 0.25 μm para cada filamento. En el segundo enrejado paso de recocido, recocido la mezcla de 20 μl en un termociclador PCR utilizando un método de enfriamiento lento de permanecer a 50 ° C por 2 h y enfriando a una velocidad de 0.1 ° C por 5 minutos a 20 ° C, aproximadamente 24 horas en total.
      Nota: Dos experimentos paralelos se pueden ejecutar simultáneamente o posteriormente en el segundo paso de recocido para cada enrejado infinito 2D.
  3. Preparar soluciones de montaje de dos conjuntos finitos rectángulo de 5 × 6 cDAO-c64nt-O y 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O de dos etapas del recocido.
    1. Preparar cada solución precursora azulejo sub montaje mezclando 1 μl de 10 x TAE· Almacenador intermediario de mg, 0.5 μl de cada solución madre de ADN de un conjunto de filamentos lineales y circulares en relaciones molares igual, adicional TE tampón y en un tubo de ensayo PCR de 200 μL para una concentración final de 0,5 μm de cada filamento y un volumen final de 10 μl. En el primer paso de recocido, recocido cada solución precursora de los azulejos en un termociclador PCR utilizando un método de enfriamiento rápido lineal de 95 ° C a 25 ° C durante 2,5 h.
    2. Preparar cada rectángulo finito enrejado conjunto solución mezcla 32 x (2 μl de cada solución de sub-azulejos) en un tubo de ensayo PCR de 200 μL para una concentración final de ~ 15 nM para cada sub- azulejo y un volumen final de 64 μl. En el segundo paso de recocido, recocido la mezcla 64 μL en un termociclador PCR utilizando un método de enfriamiento lento de permanecer a 50 ° C por 2 h y enfriando a una velocidad de 0.1 ° C por 5 min a 20 ° C, cerca de 24 horas en total.
      Nota: Cinco experimentos paralelos se pueden ejecutar simultáneamente o posteriormente en el segundo paso de recocido para cada conjunto de rectángulo finito.

3. Análisis de la página nativo

  1. Preparar 10% natural página siguiente paso 1.9 excepto el componente de la urea.
  2. Para muestras de control de c64bp y c84bp, añadir 2 μl de cada solución de montaje y 1 μl de colorante a 3 μl de buffer TE de carga como controles por separado. Para cada uno de los otros conjuntos indicadas en la figura 3, agregar 1 μl de cada solución de montaje y 1 μl de carga de tinte a 4 μL de tampón TE.
  3. Inyectar cada uno de las soluciones anteriores a un gel bien. Añadir 5 μl del marcador de ADN (25-500 bp) de un bien separado para referencia.
  4. Correr el gel durante 4 horas a 10 V/cm en un baño de agua helada. La cyanol xileno FF se ejecutará fuera de la placa de vidrio.
  5. Use guantes de goma y gafas protectoras para proteger piel y ojos. Tomar el gel de la placa de cristal y sumergirlo en 100 mL de agua desionizada con 10 μl de una mancha de gel de ácido nucleico por 30 min.
    PRECAUCIÓN: La solución de tinción de gel ácido nucleico es tóxica.
  6. Observar el gel en un UV sistema de imagen y toma una fotografía del gel teñido (figura 3).

4. purificación de enrejados finitos

  1. Preparar un gel de agarosa al 2% nativa para la purificación de la electroforesis de enrejados finitos.
    1. Mezclar 1 g de agarosa en polvo, 5 mL de 10 x TBE· Buffer de mg (89 mM Tris, 89 mM ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8,0, 12.5 mM Mg(Ac)2), 2 μl de ácido nucleico gel manchas y 47,5 mL de agua desionizada en un frasco de 250 mL triángulo. Hervir la mezcla hasta que las burbujas se convierten en pequeñas y densas. Añadir agua caliente en la botella a un volumen total de 50 mL y una concentración de agarosa al 2%.
    2. Use guantes gruesos. Vierta la solución en gel en una caja plástica del gel de 7 x 10 x 1 cm3 (ancho × largo × thickness). Inserte un peine de gel de espesor y 12 pozos de 1,5 mm. Espere a que el gel se enfríe a temperatura ambiente. Si es necesario, poner el gel en una nevera de 4 ° C.
      PRECAUCIÓN: Tenga escaldaduras porque la solución está muy caliente.
    3. Agregar 0.5 x TBE· Buffer de mg en el sistema de electroforesis. Prerun el gel a 5 V/cm durante 20 min en un baño de agua helada a una tensión constante de 50 voltios.
    4. Inyectar 20 μl de la solución de enrejado finito preparada en el paso 2.3 en gel agarosa bien y añadir 5 μl de un marcador de ADN (100-3.000 bp) a un separado bien. Correr el gel por 2 h a 5 V/cm en un baño de agua helada.
    5. Use guantes de goma y gafas protectoras para proteger piel y ojos. Corte blanco gel bandas con una posición similar a la pistola bp 1.000 bajo luz UV y rebanada en finas piezas y colocar los geles machacados en un filtro de columna8.
    6. Centrifugar la columna a 2.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Extraer la solución de la muestra a través de la columna. Recoger la solución para la proyección de imagen de AFM.
  2. Purificar enrejados finitos por la precipitación de PEG.
    1. Mezcla 50 μl de la solución de enrejado finito preparada en el paso 2.3 con un volumen igual del 15% PEG8000 (w/v) tampón (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA y 505 mM NaCl)22. Centrifugue la solución a 18.000 × g a 4 ° C durante 30 minutos.
    2. Quite el sobrenadante y añadir 100 μl de buffer de PEG. Repetir la centrifugación.
    3. Después de retirar el sobrenadante, disolver el pellet en 1 x TAE· Buffer de mg para la proyección de imagen de AFM.
      Nota: Purificación es necesaria para los enrejados finitos de 5 × 6 cDAO-c64nt-O y 5 × 6 cDAO-c74 c84nt-O para la proyección de imagen de AFM y otras aplicaciones. Si el rendimiento es muy bajo, aumentar la velocidad de centrifugación. Si el producto no es lo suficientemente puro, repita el paso 4.2.2.

5. AFM imágenes

  1. C64nt nanocable, c84nt nanocable, acDAO-c64nt-E, enrejados 2D infinitos de cDAO-c64nt-E(O) y cDAO-c84nt-E(O), depositan 2 μL de muestra recocida en una superficie recién descamada mica. Deje por 2 min para la adsorción de enrejados de ADN a la superficie de la mica. Lavar dos veces la superficie con 100 μl de agua desionizada y secarla por aire comprimido.
  2. Obtener imágenes AFM de infinitos enrejados de ADN en el aire por la exploración de la superficie de mica con sondas de AFM de triangular bajo modo. Definir los siguientes parámetros de análisis: Análisis de tamaño de 0.5 ~ 5 μm, resolución de 512 líneas de exploración y exploración velocidad de 3,5 Hz (figura 4).
  3. Para los enrejados de ADN finitos de 5 × 6 cDAO-c64nt-O y 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, depósito 80 μl de 1 x TAE· Buffer de mg sobre una superficie recién descamada mica. Luego añadir 5 μl de las muestras finitas en el búfer. Deje por 2 min para la adsorción de enrejados de ADN a la superficie de la mica. Añadir otro 50 μl de 1 x TAE· Buffer de mg en la sonda AFM.
  4. Obtener imágenes AFM de finitos enrejados de DNA en líquido mediante la exploración de la superficie de mica con sondas de AFM en modo de triangular. Definir los siguientes parámetros de análisis: Análisis de tamaño de 0.5-1 μm, con resolución de 256 líneas de exploración y exploración velocidad de 1,5 Hz (figura 5).

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Representative Results

El ADN circular se mueve ligeramente más lento que su precursor ADN lineal en desnaturalización página (figura 2) porque se penetra el poro dentro de la DNA circular y retardado por gel de fibras23,24,25. La eficiencia de la reacción de ligadura correcta por ciclización de oligo-monómero depende de la secuencia de sustrato y concentración, temperatura de reacción, tiempo, etcetera. Como la concentración de un precursor de DNA linear es lo suficientemente alta en alrededor de 3,5 μm, los productos de la ciclación de c64nt (o c84nt) y la referencia del precursor en el presente Protocolo puede ser sombra directamente como bandas en la placa de TLC bajo luz UV sin morir. Si las bandas de ADN circular son vagas o invisible, que indica un fracaso de la reacción de la ligadura o un mucho rendimiento bajo de los productos. A veces hay dos bandas por encima de la banda lineal precursor, refiriendo un anillo adicional oligo-dimer excepto el anillo correcto oligo-monómero. Sólo dejar las bandas superiores y recoger los inferiores. Los productos purificados de ADN circular pueden verse como polvo blanco en el tubo después de secado al vacío. Excepto en la página de desnaturalización, la pureza del ADN puede medirse también por el espectrómetro de UV. Es el pico de absorción de ADN a 260 nm. Dos criterios estándar para la pureza de ADN son el cociente de la absorción de 280 nm/260 nm a 1.8 y de 280 nm/230 nm comúnmente en el rango de 2.0-2.2. Si las dos razones arriba se desvían de los valores estándar, los restos se extraerá otra vez por los siguientes pasos de 1.18-1.20. Las producciones de c64nt y c84nt para la ciclización correcto oligo-monómero se miden en el rango de 30-60% según este protocolo.

Análisis de la página nativa proporciona mucha información sobre estabilidad de adorno, pureza, rigidez, modo de conjunto de monómero o polímero, etcetera (figura 3). C64nt conjunto de c64bp, c64nt HJ, aHJ-c64nt, c64nt cDAO y acDAO-c64nt tienen solamente una banda clara y limpia para cada Asamblea, que representa que son motivos de monómero estables. Mientras que las familias de montaje c84nt de HJ-c84nt, tHJ-c84nt y c84nt cDAO tienen manchas alrededor de sus bandas principales, lo que indica menores derivados a excepción de los motivos de monómero de destino. Independientemente de los menores derivados de incorrecta asociados, se pueden montar excelentes enrejados de cDAO-c84nt-O (E) con altos rendimientos. Para obtener una imagen clara y limpia de la electroforesis, el volumen de carga debe ser no más de 10 μl y la cantidad de ADN debe ser 0.01 ~ 0,02 μg/mL.

Finalmente se evalúa el éxito de los experimentos de 1D y 2D nanoestructuras de ADN reflejada por AFM (figura 4 y figura 5). Cada unidad tiene sus propias características morfológicas en la escala del micrómetro como nanohilos, nanotubos, nanospirals, nanoribbons, etcetera. Además, las texturas detalladas de las Asambleas de la DNA en la escala nanométrica correlacionaron con sus tamaños de azulejo circular teóricos y modos de organización muy bien respectivamente son la clave para la verificación del montaje acertado y correcto. Por lo tanto, deben obtenerse imágenes AFM de panorámica y de alta resolución en escalas del micrómetro y del nanómetro. Opciones de métodos AFM y sondas son cruciales para las imágenes AFM de alta calidad. La fuerza de exploración debe ajustarse tan pequeño como 50 pN26. Si la fuerza de exploración es demasiado grande, dañaría los patrones de ADN nano-estructural. La limpieza ambiental es otro parámetro clave para conseguir una imagen limpia y hermosa alta resolución AFM en líquido. Todas las memorias intermedias deben ser filtradas por filtro de 0,22 μm; el porta sondas y pinzas deben lavar por detergente y enjuagar con agua desionizada. Si el ambiente está contaminado por residuos de partículas, la punta de la sonda sería dañada o aferrada por las partículas en el buffer, así afectando la calidad de las imágenes AFM.

Figure 1
Figura 1 . Síntesis de ADN circular. El diagrama de flujo representa cómo un oligonucleótido lineal largo 5'-fosforilados en azul evoluciona a una molécula de ADN circular. Los dos hilos rojo corto representan los oligonucleótidos de la férula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Fotografía de la página de desnaturalización ADN ciclización de productos de bajo la luz sin morir UV. Una banda de DNA precursor 64nt lineal es en el carril de la extrema izquierda y sus productos de ciclación de 64nt circular DNA (c64nt) aparecen como 9 bandas en la horizontal mismo nivel en otros 9 carriles. Las 9 bandas de c64nt se cortará para abstraer DNAs circulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Fotografías de la página nativa después de morir y esquema doble helicoidal modelos de azulejos circulares. Ambos polímeros de nanocable de c64nt y c84nt nanocable están representados por sus células de unidad plegable más sencillas, en la que los dos alinearon puntos arriba y debajo de cada celda indican la alineación infinita de células unidad vertical hasta abajo, con igual distancia entre dúplex en forma de nanohilos. Fichas circulares de monómero de c64bp, c84bp, c64nt HJ, aHJ-c64nt, HJ-c84nt y tHJ-c84nt en A) no tienen voladizos que sobresalen de sus anillos, mientras que cDAO-c64nt, c64nt de acDAO y cDAO-c84nt en B) tienen ambos voladizos de bp 10 punta Roma respectivamente. Secuencias, consulte la tabla de secuencias de ADN. Esta figura ha sido modificada de una figura previamente publicada17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Imágenes AFM de los conjuntos típicos 1D y 2D infinitos de ADN analizan en el aire. C64nt nanocable de A) B) infinito acDAO-c64nt-E, C) infinito cDAO-c64nt-E, D) infinito cDAO-c64nt-O, E) infinito cDAO-c84nt-E y F) infinito cDAO-c84nt-O se recuecen por cohesión final pegajoso. Todos los datos de textura en las imágenes AFM están en consonancia con los modos de organización muy bien y tamaños de baldosas. Secuencias, consulte la tabla de secuencias de ADN. Esta figura ha sido modificada de una figura previamente publicada17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Imágenes AFM de asambleas rectángulo finito analizan en líquido de. La Asamblea de rectángulo finito de A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O se compone de 32 cDAO-c64nt los azulejos y B) 5 × 6 cDAO-c74 84nt O se compone de 12 cDAO-c74nt y 20 cDAO-c84nt sub-azulejos. Secuencias, consulte la tabla de secuencias de ADN. Esta figura ha sido modificada de una figura previamente publicada17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla de secuencias de ADN. Haga clic aquí para descargar este archivo. 

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Discussion

Los protocolos presentados en este enfoque del artículo de la síntesis de pequeñas moléculas de ADN circular y la Asamblea de nanoestructuras de ADN. La mayor parte de diseños de ADN ordenados al azar puede utilizarse en el presente Protocolo. La pureza de los DNAs circulares es crítica para el éxito de los conjuntos de ADN. El rendimiento de producción de ciclación puede mejorarse reduciendo la concentración de ADN lineal 5'-fosforilados; sin embargo, esto aumentará la carga de trabajo para producir la misma cantidad de ADN circular. La longitud de los filamentos de la DNA de férula también afecta la reacción de ligadura correcta, está optimizado para ser alrededor 20 nucleotides largo para c64nt y c84nt.

Una adecuada concentración de cationes magnesio (e.g., 12,5 mM) en la solución durante y después de Asamblea es muy importante para la formación y mantenimiento de nanoestructuras de ADN. Así, una concentración de catión magnesio de 12,5 mM se mantiene siempre durante los procesos de recocido, página nativa, electroforesis en gel de agarosa y PEG tampón purificaciones de centrifugación, proyección de imagen de AFM, etcetera.

Para asambleas de rectángulo finito de 5 × 6 cDAO-c64nt-O y 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, la purificación del gel de agarosa no afecta a los detalles de textura, mientras que la purificación de centrifugación de búfer PEG daña los detalles de textura de nanoestructuras de ADN en el imágenes de AFM de alta resolución.

Beneficiarse de la estabilidad y rigidez de azulejos circulares, es mucho más fácil de producir bien organizado y gran tamaño solo cristalino 2D enrejados de módulos circulares que en los azulejos lineales y origami escalonada9,11, aunque trabajo extra es necesario sintetizar y purificar las moléculas de ADN circular. Con sólo un ADN circular como la misma estructura de base, pueden generarse muchos módulos circulares con diferentes voladizos; por medio de cohesiones específico extremo pegajoso de voladizos se pueden construir nanoestructuras finito; Esta estrategia reduce la carga de trabajo y costo de nanoestructuras finito. Una ventaja significativa de nanoestructuras de ADN circular es la resolución de las estructuras secundarias y terciarias de las moléculas de ADN y sus elementos clave como ensambladura de Holliday de los detalles de textura del únicos enrejados cristalinos. 1D, 2D y 3D nanoestructuras de módulos circulares y sus potenciales aplicaciones en biología, medicina e ingeniería de nano se convertirá en un nuevo miembro de la familia de la nanotecnología de ADN en el futuro.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Acknowledgments

Estamos agradecidos por el apoyo financiero de la NSFC (Nº de becas 91753134 y 21571100) y la Universidad Estatal de clave laboratorio de Bioelectrónica del sureste.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

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References

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Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

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